CN103969354B - 一种肾康注射液的指纹图谱的鉴别方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了肾康注射液的指纹图谱鉴别方法，包括供试品溶液的制备、指纹图谱的测定、对照指纹图谱的确定和肾康注射液指纹图谱的鉴别。通过对肾康注射液进行HPLC指纹图谱测定和分析，确定了9个肾康注射液的特征峰，这些共有特征峰构成了肾康注射液的指纹特征，可作为肾康注射液的对照指纹图谱；对需要鉴别的肾康注射液可以与对照指纹图谱进行比对，检查共有特征峰的情况，以鉴别质量。本发明具有方法简便、重现性好、特征峰明显、准确可靠等特点，有利于鉴别肾康注射液的质量。

Description

一种肾康注射液的指纹图谱的鉴别方法

技术领域

本发明涉及一种肾康注射液指纹图谱的鉴别方法，具体地说是用高效液相色谱指纹图谱法来对肾康注射液中有效成分进行质量控制的一种鉴别方法。

背景技术

慢性肾功能不全是由各种原因造成的慢性进行性肾实质损害的一组临床综合征，随着疾病的进展最终发展为尿毒症，目前慢性肾功能不全尚缺乏有效的治疗方案。肾康注射液由大黄、丹参、黄芪、红花四味药物制成的中药复方静脉注射液,具有降逆泄浊，益气活血之功，用于治疗慢性肾衰。临床资料显示，肾康注射液可以改善肾功能，延缓慢性肾功能不全的进展。

肾康注射液由大黄、丹参、黄芪、红花四味药材制成，四味药材均为《中华人民共和国药典2010版》一部收载品种。大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheumpalmatum,L．、唐古特大黄Rheumtanguticum／Maxim.exBalf.或药用大黄Rheumoj-flcinaleBaill.的干燥根和根茎。大黄中的主要成分是蒽醌苷及双蒽酮苷，其醌苷有：大黄酚-1-葡萄糖苷或大黄酚苷、大黄素-6-葡萄糖苷、芦荟大黄素-8-葡萄糖苷、大黄素甲醚葡萄糖苷、大黄酸-8-葡萄糖苷；掌叶大黄中还含有大黄素双葡萄糖苷、芦荟大黄素双葡萄糖苷、大黄酚双葡萄糖苷。双蒽酮苷有番泻苷A、B、C、D、E、F。游离型蒽醌类主要有：大黄酚、大黄素、大黄素甲醚、芦荟大黄素、大黄酸。大黄又含有大黄鞣酸及其相关物质,如没食子酸、儿茶素、大黄四聚素。此外，大黄尚含有脂肪酸、草酸钙、葡萄糖、果糖和淀粉。目前大黄药材的质量控制方法主要有：以芦荟大黄素(C₁₅H₁₀O5)、大黄酸(C₁₅H₈0₆)、大黄素(C₁₅H₁₀0₅)、大黄酚(C₁₀H₁₀0₄)和大黄素甲醚(C₁₆H₁₂0₅)的总量测定作为含量测定方法《中华人民共和国药典2010版一部》；道地产区大黄药材HPLC_DAD_MS指纹特征研究（张依倩等，《2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集》）；中药大黄UPLC-MS指纹图谱的研究（王国英等，《西北地区第六届色谱学术报告会甘肃省第十一届色谱年会论文集》）；Determinationof19rhubarbconstituentsbyhigh-performanceliquidchromatography-ultraviolet-massspectrometry（J.Sep.Sci.2006,29,2584-2593）。丹参为唇形科植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根茎。丹参主要含结晶性菲醌类化合物：丹参酮I、IIA、IIB，异丹参酮I、异丹参酮II，隐丹参酮，异隐丹参酮、羟基丹参酮IIA、丹参新酮、左旋二氢丹参酮I、丹参酚等。此外，尚含原儿茶醛、原儿茶酸、琥珀酸、熊果酸、乳酸、维生素E等。目前丹参药材的质量控制方法主要有：以丹参酮ⅡA(C₁₉H₁₈0₃)、丹酚酸B(C₃₆H₃₀0₁₆)的含量测定作为含量测定方法《中华人民共和国药典2010版一部》；杨树声采用HPLC法同时测定丹参类药材中水溶性活性成分的含量（甘肃中医学院学报，2008年06期）；王伟采用反相高效液相色谱法同时测定丹参药材中丹参素(Ⅰ)、迷迭香酸(Ⅱ)、紫草酸(Ⅲ)、丹酚酸B(Ⅳ)的含量（安徽医药,AnhuiMedicalandPharmaceuticalJournal，2010年11期）；宋洁瑾通过建立丹参药材的指纹图谱,对不同产地丹参药材质量进行评价（辽宁中医杂志,2008年03期）。黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch)Bge.var.mongholicus(Bge)Hsiao或膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch)Bge.的干燥根。黄芪含黄酮、皂苷类成分；黄酮类成分如芒柄花素、3'-羟基芒柄花黄素（毛蕊异黄酮）及其葡萄糖苷、2',3'-二羟基-7,4'-二甲氧基异黄酮、7,2'-二羟基-3',4'-二甲氧基异黄烷及其葡萄糖苷、7,3'-二羟基-4',5'-二甲氧基异黄烷、3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷及其葡萄糖苷等；皂苷类成分有黄芪皂苷Ⅰ～Ⅷ及大豆皂苷Ⅰ；黄芪甲苷（即黄芪皂苷IV）与黄芪乙苷。中国药典2010版黄芪以黄芪甲苷(C₂₂H₂₂0₁₀)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(C₂₂H₂₂O₁₀)为指标进行含量测定；李颜建立高效液相色谱法测定黄芪饮片中4个异黄酮成分毛蕊异黄酮-7-葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素的含量方法（中国药师,2012年02期）；王宗权采用HPLC-ELSD法测定不同产地黄芪药材中的黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ和黄芪皂苷Ⅳ的含量（药物分析杂志,2010年07期）；红花为菊科植物红花CarthamustinctoriusL.的干燥花。中国药典2010版以羟基红花黄色素A、山柰素(C₁₅H₁₀0₆)为指标进行含量测定；姚苗苗采用RP-HPLC法同时测定红花中羟基红花黄色素A与红花黄色素A的含量（药物分析杂志,2010年02期）；范莉用HPLC方法建立红花药材的标准指纹图谱（中国实验方剂学杂志,2011年01期）。

中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。“整体性”和“模糊性”为其显著特点。以指纹图谱作为中药（天然药物）提取物及其制剂的质量控制方法，已成为目前国际共识，各种符合中药（天然药物）特色的指纹图谱控制技术体系正在研究和建立。美国食品药品管理局（FDA）允许草药保健品申报资料中提供色谱指纹图谱；世界卫生组织（WHO）在1996年草药评价指导原则中也规定，如果草药的活性成分不明确，可以提供色谱指纹图谱以证明产品质量的一致；欧共体在草药质量指南中亦称，单靠测定某种有效成分考查质量的稳定性是不够的，因为草药及其制剂是以整体为活性物质。色谱指纹图谱尤其是薄层色谱的鲜明的指纹图谱是很有用的。国外指纹图谱的应用，目的在于解决成分复杂，有效成分不明确的植物药质量检测和产品批次间质量差异的问题。其中德国研制的银杏叶提取物制剂是一个突出的例子。他们应用指纹图谱制定了相应的标准，该图谱体现了制剂所含的33个化学成分（主要为黄酮类和内酯类）和各自的含量。经化学成分和药效相关性研究，发现约24%银杏黄酮和约6%银杏内酯组成的提取物具有最佳疗效。此外，采用“混批勾兑”法，可使最终产品质量稳定，指纹图谱重现性良好，含量浮动范围为5%左右。中国食品药品监督管理局于2000年颁布了《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》，要求中药注射剂必须进行指纹图谱的研究，并建立其相关的标准。规范了中药指纹图谱的研究，从而掀起了国内近几年来对指纹图谱的研究热潮。

肾康注射液所含化学成分复杂、多样，目前，对中药及中成药质量控制较成熟的方法有单个成分含量测定或一类成分如总皂苷、总黄酮等的紫外分光光度测定法，不能对制剂进行全面直观的质量控制。采用指纹图谱技术除了能反映几乎全部成分的含量、种类外，尚能反映成分的比例、未知成分（含量测定方法中可能已被作为无效或干扰成分扣除）的产生，作者认为更多的是从药物稳定性、安全性上进行监测。

发明内容

本发明的目的是提供一种肾康注射液的指纹图谱鉴别方法，通过指纹图谱测定对肾康注射液成品进行全面而有效的鉴别。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的。

肾康注射液的制备方法：

以大黄、丹参、红花、黄芪为原料，四味药材以重量份计为：大黄70-150g，丹参60-120g，黄芪150-280g，红花80-150g。取大黄、丹参，加水煎煮，煎液浓缩后加乙醇沉淀，吸取上清液，回收乙醇，再加入明胶溶液静置除鞣质，将除鞣质后的上清液备用。取红花、黄芪按上法同法处理。将上述两种上清液合并，经过入活性炭和氢氧化钠处理，再加水稀释，滤过，分装于安瓿中，灭菌，即得。

本发明肾康注射液的指纹图谱鉴别方法，该方法包括如下步骤：

(a)色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈或甲醇、乙腈甲醇混合溶剂为流动相A，以甲酸水溶液或冰醋酸水溶液、磷酸水溶液、三氟乙酸水溶液为流动相B。检测器为紫外检测器、示差检测器或蒸发光检测器；

(b)供试品溶液的制备取本品适量，用微孔滤膜滤过，取续滤液，备用；

(c)测定法吸取供试品溶液适量，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。

进一步优选的测定条件为：

(a)色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长10~25cm，内径3~5cm，粒径为1~10μm)；以乙腈为流动相A，以0.01~2%冰醋酸水溶液为流动相B；紫外检测器，检测波长200~400nm；柱温20~50℃，流速为每分钟0.2~2ml。

(b)供试品溶液的制备取本品适量，用微孔滤膜0.22~0.45μm滤过，取续滤液，即得。

(c)测定法吸取供试品溶液5~40μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。

最佳测定条件:

(a)色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm；以乙腈为流动相A，以0.3%冰醋酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为280nm；柱温25℃；流速为每分钟0.9ml。

(b)供试品溶液的制备取本品适量，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得。

(c)测定法精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，记录75分钟色谱图，即得。

供试品色谱图应与对照图谱基本一致，肾康注射液的对照指纹图谱如图1所示，有相对应的9个特征峰，其中8号峰与相邻色谱峰分离度应不低于1.0。相对保留时间不超过±5%偏差。经布鲁克离子肼质谱特征指认，色谱峰1为来源于黄芪、红花药材黄酮苷类结构成分；色谱峰2为没食子酸峰；色谱峰3为丹参素峰；色谱峰4为原儿茶醛峰；色谱峰为来源于大黄药材的蒽醌苷类峰；色谱峰7为迷迭香酸峰；色谱峰8为大黄素糖苷峰；色谱峰9为大黄蒽醌苷峰。

相对保留时间

1号峰：0.102号峰：0.133号峰：0.184号峰：0.30

5号峰：0.566号峰：0.667号峰：0.868号峰（S）：1.009号峰：1.01

这9个峰峰面积比为：峰1（360~460）：峰2（110~320）：峰3（300~700）：峰4（450~650）：峰5（250~400）：峰6（200~600）：峰7（50~400）：峰8（700~1200）：峰9（250~600）

本发明与背景技术相比具有的有益效果

一、本发明与已公开的文献《肾康注射液中大黄药材指纹图谱研究》（《中国药业》2001年10期）中所述的方法相比较，不同之处和有益效果在于：

（a）鉴别对象不同

本发明的鉴别对象是肾康注射液成品，并且以肾康注射液中大黄蒽醌苷类、丹参酚酸类、黄芪异黄酮类、红花色素类等主要药效活性成分为指标，建立了HPLC指纹图谱测定方法；而《肾康注射液中大黄药材指纹图谱研究》中鉴别对象为肾康注射液中的大黄药材，并以大黄药材中的6个化学成分作为指标进行研究。

（b）实验方法不同

本发明优选出最佳的实验方法为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm；以乙腈为流动相A，以0.3%冰醋酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为280nm；柱温25℃；流速为每分钟0.9ml。

供试品溶液的制备取本品适量，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得。

测定法精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，记录75分钟色谱图，即得。

而对比文献中的色谱条件和测定方法为：以甲醇-1%冰醋酸（77:23）为流动相，等度洗脱，检测波长：430nm；柱温35℃；流速为每分钟1.1ml，记录60分钟色谱图，即得。

与本发明的实验方法相比有明显区别。本发明实验方法更能全面系统地对大黄及组方中其他药物所含成分进行鉴别。

二、本发明与其他文献报道的方法相比具有的有益效果

（a）本发明以肾康注射液中大黄蒽醌苷类、丹参酚酸类、黄芪异黄酮类、红花色素类等主要药效活性成分为指标，建立了HPLC指纹图谱测定方法，能代表肾康注射液中大部分化学成分，能有效地表征肾康注射液的质量；而其他文献中研究对象多对单味药材中几个化学成分作为指标进行研究。而实际上肾康注射液是由大黄、丹参、红花、黄芪四味中药组成，化学成分非常复杂，大黄药材的指纹图谱不能体现出肾康注射液所含的化学成分。本发明中将各主要成分色谱峰构建指纹图谱代表产品，与对照指纹图谱比较，避免单一成分或几个成分含量测定代表制剂质量的片面性，从整体上全面反映制剂质量，同时也能够检测异常成分的出现，为制剂的安全性提供了保证；

（b）本发明与文献报道的方法相比较，更加注重各色谱峰化学成分结构组成和峰保留时间，具有较高的专属性，各色谱峰的特征所代表的制剂不易通过人为或虚假方法获得，通过大量实验进行验证后，具有较高的重复性、精密度、稳定性，易于操作；

（c）本发明使用的流动相比例未见报道。其特点是：流动相中A（乙腈）所占的比例随时间由低逐渐升高，流动相B（0.3%冰醋酸）比例随时间逐渐下降，采用梯度洗脱的方式，使得流动相的极性随时间变化，针对肾康注射液中各种成分极性不同的特点，从而实现良好的分离。

附图说明

图1是肾康注射液的对照指纹图谱。其中从左到右分别标出了其共有特征峰1至9号。

图2是本发明提供的肾康注射液供试品指纹图谱。其中从左到右分别标出了其共有特征峰1至9号。

图3是本发明提供的肾康注射液对照指纹图谱。其中从左到右分别标出了其共有特征峰1至9号。

实施例一肾康注射液对照指纹图谱的建立

1、仪器：Agilent1260型高效液相色谱仪，G1311C四元泵，柱温箱，G1316A，G1315D，DAD检测器，AgilentZorbaxEclipseXDBC18色谱柱（4.6×250mm，5μm）。质谱仪器系统为ESI-MSn质谱仪（Bruker公司）。

试剂：乙腈为色谱纯（Burdick&Jackson,HoneywellInternationalInc.,USA）、冰醋酸色谱纯（TediacompanyInc.,USA）、水（Millipore,Bedford,MA,USA)，其它试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

2、色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，AgilentZorbaxEclipseXDBC18色谱柱（柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm）；以乙腈为流动相A，以0.3%冰醋酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为280nm；柱温25℃；流速为每分钟0.9ml。见表1。

表1梯度洗脱时间

3、供试品溶液的制备取本品适量，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得。

测定法精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，记录75分钟色谱图，即得。

4、方法学考察

4.1仪器精密度考察

取批号201108041样品，按照前述供试品溶液制备方法制备，连续进样6次，考察指纹图谱精密度。将精密度实验色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，计算相似度，得到肾康注射液供试品指纹图谱如图3所示，结果表明有较高的相似度（相似度在0.99以上，见表2）。结果表明仪器精密度较高。

表2肾康注射液HPLC指纹图谱精密度相似度

4.2指纹图谱重复性试验

供试品制备和分析方法如前所述，取同一批号肾康注射液（批号201108041），平行制备6份供试品，考察指纹图谱的变化情况。将重复性实验色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，计算相似度，如表3所示，结果表明有较高的相似度（相似度均在0.99以上）。

表3肾康注射液HPLC指纹图谱重复性相似度

4.3指纹图谱稳定性试验

按照前述方法制备肾康注射液（批号201108041）供试品一份，于常温下保存，分别在0、4、8、12、16、24小时测定供试品溶液，考察稳定性，指纹图谱如图36所示，结果见表4，相似度大于0.99，说明肾康注射液供试品溶液在24小时内稳定。

表4肾康注射液HPLC指纹图谱稳定性相似度

5、系统适用性试验

供试品溶液的色谱图与对照谱基本一致，如图2所示，主要的色谱峰应在75分钟以内出完，分离良好，具有代表意义的9个共有峰，不应有缺峰现象。

6、肾康注射液成品指纹图谱检测

表5肾康注射液相似度测定结果

采用上述批次的肾康注射液构建对照指纹图谱如图3所示

相对保留时间

1号峰：0.102号峰：0.133号峰：0.184号峰：0.30

5号峰：0.566号峰：0.667号峰：0.868号峰（S）：1.009号峰：1.01

图谱峰描述

供试品溶液的色谱图与对照谱基本一致，主要的色谱峰应在75分钟以内出完，8号峰分离度应不低于1.0。具有代表意义的9个共有峰，不应有缺峰现象。其中2号峰为大黄特征峰，3、4号为丹参特征峰；6、7、8和9号峰为大黄特征峰。5号峰为大黄、丹参峰；1号峰由大黄、红花和黄芪色谱峰共同组成。以上9个共有峰构成肾康注射液指纹图谱的特征峰。

实施例二31批次肾康注射液指纹图谱测定

采用构建好的肾康注射液对照指纹图谱，对后续31批次肾康注射液供试品进行指纹图谱测定，结果见表6。结果：31个批次的相似度结果良好，相似度均大于0.9。

表631批指纹图谱测定结果

本发明通过对肾康注射液进行指纹图谱测定，能够对其质量进行有效的鉴别。

Claims (4)

1.肾康注射液的指纹图谱鉴别方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：肾康注射液由下述重量份的大黄70-150g，丹参60-120g，黄芪150-280g，红花80-150g制备而成；吸取肾康注射液供试品溶液，用0.22-0.45μm微孔滤膜滤过，收取滤液，备用；

(2)指纹图谱测定：取供试品溶液适量，注入高效液相色谱仪，记录75分钟以内的色谱图，得到由其共有特征峰构成的肾康注射液对照高效液相指纹图谱；其中高效液相色谱分析的条件如下：用十八烷基键合硅胶为填充剂；AgilentZorbaxEclipseXDBC18色谱柱4.6×250mm；乙腈-0.01-2％冰醋酸为流动相梯度洗脱，梯度程序为：0min→5min→30min→45min→60min→62min→75min：对应流动相：乙腈：2％→7％→15％→20％→35％→50％→50％；0.01-2％冰醋酸：98％→93％→85％→80％→65％→50％→50％；检测波长为200nm-400nm；流速为0.2ml/min-2ml/min；柱温为20℃-50℃；

(3)采用上述相同方法和条件测定待测肾康注射液的高效液相指纹图谱，再将待测肾康注射液高效液相指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，与肾康注射液对照高效液相指纹色谱比较，计算其相似度，相似度应不低于0.85。

2.根据权利要求1所述的肾康注射液的指纹图谱鉴别方法，其特征在于：其中所述的检测波长为280nm；流速为0.9ml/min；柱温为25℃。

3.根据权利要求1所述的肾康注射液的指纹图谱鉴别方法，其特征在于：其中的流动相乙腈-0.01-2％冰醋酸用乙腈-0.03％磷酸溶液或乙腈-0.03％甲酸溶液代替。

4.根据权利要求1-3任一所述的肾康注射液的指纹图谱鉴别方法，其特征在于：所得到的肾康注射液的对照指纹图谱有9个共有特征峰，其相对保留时间分别为：1号峰：0.10，2号峰：0.13，3号峰：0.18，4号峰：0.30，5号峰：0.56，6号峰：0.66，7号峰：0.86，8号峰(S)：1.00，9号峰：1.01。