CN104059111B - 用活性炭梯度洗脱从地黄提取甘露三糖单体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用活性炭梯度洗脱从地黄提取甘露三糖单体的方法,其步骤是将地黄根用10倍量的水超声提取或水煎煮提取3次，每次1小时，提取液减压浓缩成浸膏，浸膏溶解后上活性炭色谱柱，先以重蒸水、5%乙醇溶液、10%乙醇溶液、20%乙醇溶液洗脱除去单糖、二糖及四糖，再以15%乙醇溶液洗脱4‑5倍柱体积，收集15%乙醇洗脱液，减压冷冻干燥或减压低温加热干燥15%乙醇洗脱液，即得甘露三糖单体。本发明简单快速，具有分离效率高、环保、经济等优点，解决了现有技术问题。用活性炭色谱柱分离、重蒸水和不同浓度乙醇梯度洗脱从地黄提取甘露三糖单体成分的纯度达99%，提取率达到3.2%（g/g）。
Description
技术领域
本发明涉及一种从玄参科植物地黄中分离纯化制备甘露三糖单体的方法，即利用活性炭柱色谱法从地黄中分离纯化制备高纯度的甘露三糖单体的方法。
背景技术
地黄为玄参科植物地黄(Rehmannia glutinosa Libosch．)的新鲜或干燥块根。地黄是我国常用的大宗中药, 2010版《中国药典》收载的90 多种成方制剂中有地黄，占收载成方制剂三分之一，如经典名方 “六味地黄丸”、“金匮肾气丸”等。
现代研究表明地黄中含有复杂的化学成分，包括糖类、环烯醚萜苷类、苯乙醇苷类、紫罗兰酮类、黄酮类、地黄脑苷类、甾乙醇类、氨基酸类等近百种，其中含量最高的是糖类成分。现代药理研究表明，地黄中的药效物质基础之一甘露三糖具有促进造血细胞的增殖、提高免疫力、降血糖等作用。
地黄市场需求量一直很大，市场行情上涨，但是《中国药典》目前不能有效地质控地黄，为了有效地保证地黄质量，必须进一步明确地黄的活性成分,得到不同成分单体。
1971年Tomoda等采用鲜地黄，用热乙醇和热水提取，以阳离子交换树脂和阴离子交换树脂交换得到中性部分，水苏糖含量达到64.9 %，但没有得到甘露三糖单体的报道。
目前文献报道，地黄中甘露三糖的分离纯化方法有水提醇析法、水苏糖水解反应法、酶催化水解反应法。
水提醇析法：加4 倍水，沸水浸提6 h，提取2 次，将水提液进行70 %醇析处理后水苏糖的含量大大降低，有利于甘露三糖的分离，为甘露三糖的精制提供了有效的工艺参数。（郭威，温学森，王少云，赵宇. “地黄中活性成分甘露三糖提取工艺研究”，ACTAUNIVERSITATIS TRADITIONIS MEDICALIS SINENSIS PHARMACOLOGIAEQUE SHANGHAI，2007，21（6）：32-35）
水苏糖水解反应法：先用鲜地黄制备得到水苏糖，在pH2.5 、90 ℃和24 h条件下,水苏糖水解成为甘露三糖，90.63 %的水苏糖可以水解。水苏糖降解生成三糖的方式有两种:一是生成半乳糖和棉子糖,二是生成果糖和甘露三糖。（武卫红，温学森，赵宇. “甘露三糖的制备及其工艺优化”，中药材，2007，30（7）：848-853）。
酶催化水解反应法：使用β-D-呋喃糖苷酶水解水苏糖，得到白色粉末状的甘露三糖，酶催化水解反应具有专属性高，条件温和，但需严格控制pH条件、酶的纯度，否则无法得到纯度很高的单体。（TomodaM, et al.Water soluble constituents of RehmanniaeRadix， Cabohydrates and acids of Rehmannia glutinosa， hueingensis. Chem1Pharm1 Bull, 1971, 19 ( 7) :1455；姚新生，等.天然药物化学. 北京:人民卫生出版社，2001: 831）
综观上述，从地黄中直接分离制备甘露三糖单体难度大，存在制备繁琐、甘露三糖单体纯度低等问题。如何快速、高效从地黄药材中分离纯化得到甘露三糖单体成分是目前地黄研究热点。
发明内容
为此，本发明另僻蹊径，其目的旨在提供一种用活性炭梯度洗脱从地黄提取甘露三糖单体的
方法。该方法具有简便、快速、低成本的特点。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种用活性炭梯度洗脱从地黄提取甘露三糖单体的方法，包括如下步骤：
（1）称取地黄根，清洗干净，粉碎；
（2）用干净地黄根量的10倍量的水超声提取或水煎煮提取，每次1 h，合并所得药液，滤过；
（3）滤液减压浓缩干燥，得干浸膏；
（4）活性炭做为色谱柱固定相，取活性炭用水拌匀，湿法装柱，所用柱内径为3.5cm，
柱长40 cm；
（5）称取浸膏，用重蒸水完全溶解后，在常压下在1- 6 ml/min的流速下上活性炭色谱柱，色谱柱中活性炭的重量为浸膏重量的1 -12 倍；
（6）待上样完毕，在3- 8 ml/min的流速下，先用重蒸水冲洗至无色，再用5 %、10%、20 %、15 %乙醇梯度洗脱4 倍-5 倍量柱体积，收集15 %乙醇流份；
（7）将15 %乙醇洗脱溶液在压力-5.7 MPa，温度 -70 ℃减压冷冻干燥；或压力为−0.070 MPa，温度30 ℃，减压低温加热干燥得甘露三糖单体产品。
甘露三糖单体分子结构式为：
地黄甘露三糖分子结构含有2 个半乳糖和1个葡萄糖。
上述技术方案源于本发明以下工艺研究过程：
（1）提取溶媒的确定：地黄中主要含糖类成分、环烯醚萜苷类成分、苯乙醇苷类成分，多而复杂，从地黄中提取甘露三糖单体比较困难。本发明根据糖类成分、环烯醚萜苷类成分、苯乙醇苷类成分等成分的溶解性，糖类成分易溶于水，可溶于甲醇、乙醇；环烯醚萜苷类成分、苯乙醇苷类成分易溶于甲醇的特点，从环保性和经济性出发，本发明采用水提取地黄寡糖。
（2）本发明利用活性炭的非极性吸附以及吸附能力强的特性，用来分离水溶性物质，尤其是对糖类和氨基酸等成分的分离特点，以及环烯醚萜苷类成分、苯乙醇苷类成分易被聚酰胺、大孔树脂吸附的特点，采用活性炭做为固定相，先将糖类成分吸附，再根据不同糖类成分的溶解性进行梯度洗脱。本发明中活性炭在色谱柱采用湿法装柱以排除装柱时的空气，有利于糖类成分的溶解性进行梯度洗脱，减少洗脱剂的用量，提高洗脱效率。
（3）本发明根据甘露三糖的理化性质，其可溶于水、乙醇、甲醇和正丁醇，难溶于氯仿、乙醚、苯等亲脂性有机溶剂，易被酸水解，所以本发明在采用活性炭柱层析过程中，用正丁醇、甲醇、乙醇、水作为洗脱系统，洗脱率依次为甲醇>乙醇>水>正丁醇；利用高效液相色谱法分析所得样品中甘露三糖的含量，依次为乙醇>水>甲醇>正丁醇。所以根据溶媒提取甘露三糖含量，本发明选择浓度为5%-20%乙醇作为洗脱溶剂。
（4）利用乙醇作为洗脱剂，在保证纯度和提取率的前提下，考察了上样量和洗脱剂的浓度。在其他条件不变的前提下，本发明考察了浸膏量/活性炭量;g/g 上样量为1：12；1：8；1：6；1：3；1：1五个条件，各组的吸附率分别为97.04%、96.78%、93.5%、76.79%、41.62%，因此，上样量（浸膏量/活性炭量；g/g）优选在1：12-1：1之间。选用重蒸水（常水中的离子等成分较多）、5 %、10 %、15 %、20 %乙醇浓度作为本发明的优选，示差折光检测器考察吸收峰值，由表1 、图1 –图5结果显示重蒸水和不同浓度乙醇对地黄寡糖的洗脱率依次为20 %>5%>10 %>重蒸水>15 %洗脱，重蒸水、5 %乙醇溶液、10 %乙醇溶液洗脱主要得到的是单糖和二糖，20 %乙醇溶液洗脱主要得到的是四糖，所以先以重蒸水、5 %乙醇溶液、10 %乙醇溶液、20 %乙醇溶液洗脱除去单糖、二糖及四糖，再以15 %乙醇溶液洗脱得到甘露三糖，以峰面积归一化法计算甘露三糖的纯度得达到99 %。优化上述条件，本发明分离纯化地黄中甘露三糖单体的最佳方案是：上样量在12：1-1：1之间，重蒸水、5 %乙醇溶液、10 %乙醇溶液、20 %乙醇溶液、15 %乙醇溶液进行梯度洗脱，洗脱体积为5倍量柱体积。从表1可见，得到甘露三糖含量高最佳洗脱溶剂是浓度为15 %乙醇。
表1 地黄药材及不同洗脱溶剂中寡糖含量测定结果表
（5）常用干燥方法有加热干燥、减压低温加热干燥、减压冷冻干燥、微波干燥等。加热干燥所需的时间长、温度高，容易导致成分发生化学变化。甘露三糖在长期较高温度（＞50℃）加热的条件下容易将3个单糖裂解，导致成分发生变化；减压低温加热（＜ 50℃）干燥或减压冷冻干燥，温度相对较低可有效地保证成分的稳定性，进而保证成分的纯度。所以本发明采用将洗脱溶液减压冷冻干燥（压力-5.7 MPa，温度 -70 ℃）或减压低温加热干燥（30℃，−0.070 MPa），制备得到白色粉末状甘露三糖单体。
（6）甘露三糖的表征：
用WZZ-15 automatic polarimeter旋光仪测定旋光度，[а]26 D+1720 （C=117，H2O），与甘露三糖对照品一致，由此可见，制备的甘露三糖纯度很高；
用示差折光检测器waters 410并联二极管阵列检测器waters 996检测，高效液相色谱法测定，制备的甘露三糖与对照品峰对应处有相应的峰，其峰型好，且没有干扰峰，见图6，tR= 12.717 为甘露三糖峰，tR= 2.103 为溶剂峰；
经LC-MS质谱分析检测（见图7），以及1 H-NMR (600 MHz，D2 O)（见图10）、 13 C-NMR (600 MHz，D2 O)和IR光谱检测，确定制备甘露三糖分子式为C18 H32 O16，分子量504.4，与甘露三糖对照品相关检测结果一致。
注：甘露三糖对照品购自日本和光纯药工业株式会社，code No. 135-17711
本发明的优点：
本发明利用活性炭色谱柱分离、重蒸水和不同浓度乙醇梯度洗脱从地黄提取甘露三糖单体成分的纯度达99 %，提取率达到3.2 %（g/g），避免了现有技术甘露三糖分解变质和繁琐多步骤所造成的产品损失。该方法简单快速，具有生产成本低、制备效率高、产品纯度高的优点。
附图说明
图1为活性炭水洗脱物示意图 。
图2为活性炭5 %乙醇洗脱物示意图。
图3为活性炭10 %乙醇洗脱物示意图。
图4为活性炭15%乙醇洗脱物示意图。
图5为活性炭20 %乙醇洗脱物示意图。
图6地黄甘露三糖单体HPLC法测定色谱图（示差折光检测器）。
图7地黄甘露三糖LC-MC质谱图。
图8地黄甘露三糖IR光谱图。
图9地黄甘露三糖13C-NMR光谱图 (600 MHz，D2 O)。
图10地黄甘露三糖1 H-NMR光谱图 (600 MHz，D2 O)。
具体实施方式
实施例1
一种用活性炭梯度洗脱从地黄提取甘露三糖单体的方法，分别称取200 g地黄根5份，清洗干净，粉碎，分别用10倍量的水超声提取三次，每次1 h，分别合并所得药液，过滤，减压浓缩蒸干得80 g浸膏。称取200 g活性炭5份，分别用水拌匀，湿法装柱，所用柱内径为3.5 cm，柱长40 cm；每份取27 g浸膏，分别用5倍体积重蒸水完全溶解后，在常压下在1- 3ml/min的流速下上样，待上样完毕，在3- 4ml/min的流速下，分别用重蒸水、5 %、10 %、15%、20 %乙醇进行洗脱4 倍-5 倍量柱体积，分别收集其洗脱流份；HPLC法测定色谱图分别见图1-图5，在图1-图5中：地黄中含有的糖类成分（从左到右）依次为半乳糖、葡萄糖、蔗糖、楝二糖、棉子糖、甘露三糖和水苏糖，因半乳糖和葡萄糖是单糖，采用单一的活性炭乙醇洗脱剂，在现有检测条件下，很难将其分开；由图4可见，甘露三糖主要在15 %乙醇洗脱液中。
实施例2
一种用活性炭梯度洗脱从地黄提取甘露三糖单体的方法，称取200 g地黄根，清洗干净，粉碎，用10倍量的水超声提取三次，每次1 h，合并所得药液，过滤，减压浓缩蒸干得80g浸膏。取200 g活性炭用水拌匀，湿法装柱，所用柱内径为3.5 cm，柱长40 cm；取27 g浸膏，用5倍体积重蒸水完全溶解后，在常压下在1- 3 ml/min的流速下上样，待上样完毕，在3-4ml/min的流速下，先以重蒸水、5 %乙醇溶液、10 %乙醇溶液、20 %乙醇溶液洗脱除去单糖、二糖及四糖，再以15 %乙醇溶液洗脱4 倍柱体积，减压冷冻干燥（压力-5.7 MPa，温度 -70℃），得到含量达99 %的地黄甘露三糖单体产品，见图6-图10，由图6表明，tR= 12.717 为甘露三糖峰，tR= 2.103 为溶剂峰，HPLC色谱图显示，没有其它干扰峰，只有甘露三糖一个单体峰，说明纯度很高；由图7可知，甘露三糖准分子离子峰为m/z 525.4[M+Na]+ ；由图8可知，在3385.29，2926.17 cm-1 有强吸收峰，说明结构有-OH和-CH2 -；地黄甘露三糖分子式C18 H32 O16 及分子结构图由图9-图10可以确定。
本实施例3-6是在活性炭色谱柱、重蒸水和不同浓度乙醇梯度洗脱条件不变的前提下制备的地黄甘露三糖单体。实施例3-6分别采用水超声提取、减压冷冻干燥；水煎煮提取、减压冷冻干燥；水超声提取、减压低温加热干燥和水煎煮提取、减压低温加热干燥不同的工艺方法，通过不同的工艺方法比较，用于寻求地黄药材质量标准定量及定性检测时的对照品。
实施例3
称取200 g地黄根，清洗干净，粉碎，用10倍量的水超声提取三次，每次1 h，合并所得药液，过滤，减压浓缩蒸干得80 g浸膏。取200 g活性炭（40目）用水拌匀，湿法装柱，所用柱内径为3.5 cm，柱长40 cm；取27 g浸膏，用5倍体积重蒸水完全溶解后，在常压下在1- 3ml/min的流速下上样，待上样完毕，在3- 4ml/min的流速下，先以重蒸水、5 %乙醇溶液、10%乙醇溶液、20 %乙醇溶液洗脱除去单糖、二糖及四糖，再以15 %乙醇溶液洗脱4 倍柱体积，减压冷冻干燥（压力-5.7 MPa，温度 -70 ℃），得到含量达99 %的地黄甘露三糖单体产品。
实施例4
取200 g地黄根，粉碎，用10倍量的水煎煮提取三次，每次1 h，合并所得药液，过滤，减压浓缩蒸干得80 g浸膏。取200 g活性炭（40目）用水拌匀，湿法装柱，所用柱内径为3.5 cm，柱长40 cm；取27 g浸膏，用5倍体积重蒸水完全溶解后，在常压下在1- 3 ml/min的流速下上样，待上样完毕，在3- 4ml/min的流速下，先以重蒸水、5 %乙醇溶液、10 %乙醇溶液、20 %乙醇溶液洗脱除去单糖、二糖及四糖，再以15 %乙醇溶液洗脱4 倍柱体积，减压冷冻干燥（压力-5.7 MPa，温度 -70 ℃），得到含量达94 %的地黄甘露三糖单体产品。
实施例5
取200 g地黄根，粉碎，用10倍量的水超声提取三次，每次1 h，合并所得药液，过滤，减压浓缩蒸干得80 g浸膏。取200 g活性炭（40目）用水拌匀，湿法装柱，所用柱内径为3.5 cm，柱长40 cm；取27 g浸膏，用5倍体积重蒸水完全溶解后，在常压下在1- 3 ml/min的流速下上样，待上样完毕，在3- 4ml/min的流速下，先以重蒸水、5 %乙醇溶液、10 %乙醇溶液、20 %乙醇溶液洗脱除去单糖、二糖及四糖，再以15 %乙醇溶液洗脱4 倍柱体积，减压低温加热干燥（30 ℃，−0.070 MPa），得到含量达90 %的地黄甘露三糖单体产品。
实施例6
取200 g地黄根，粉碎，用10倍量的水煎煮提取三次，每次1 h，合并所得药液，过滤，减压浓缩蒸干得80 g浸膏。取200 g活性炭（40目）用水拌匀，湿法装柱，所用柱内径为3.5 cm，柱长40 cm；取27 g浸膏，用5倍体积重蒸水完全溶解后，在常压下在1- 3 ml/min的流速下上样，待上样完毕，在3- 4ml/min的流速下，先以重蒸水、5 %乙醇溶液、10 %乙醇溶液、20 %乙醇溶液洗脱除去单糖、二糖及四糖，再以15 %乙醇溶液洗脱4 倍柱体积，减压低温加热干燥（30 ℃，−0.070 MPa），得到含量达88 %的地黄甘露三糖单体产品。
表2 不同制备方法的地黄甘露三糖单体纯度、得率对比表
| 组别 | 工艺不同处 | 纯度，%（g/g） | 得率，%（g/g） |
| 实施例1 | 水超声提取、减压冷冻干燥 | 99 | 3.2 |
| 实施例2 | 水煎煮提取、减压冷冻干燥 | 94 | 3.4 |
| 实施例3 | 水超声提取、减压低温加热干燥 | 90 | 3.2 |
| 实施例4 | 水煎煮提取、减压低温加热干燥 | 88 | 3.6 |
经多次试验，采用水超声提取、减压冷冻干燥或水煎煮提取、减压冷冻干燥制备地黄甘露三糖单体得率在3.2 %～3.4 %范围内，甘露三糖单体纯度高，其中实施例1制备的单体，适用于定量测定的对照品，实施例2、例3制备的单体适用于定性检测的对照品。
Claims (1)
1.一种用活性炭梯度洗脱从地黄提取甘露三糖单体的方法，包括如下步骤：
a. 称取地黄根，清洗干净，粉碎；
b. 用干净地黄根量的10倍量的水超声提取或水煎煮提取，每次1 h，合并所得药液，滤过；
c. 滤液减压浓缩干燥，得干浸膏；
d. 活性炭做为色谱柱固定相，取活性炭用水拌匀，湿法装柱，所用柱内径为3.5 cm，
柱长40 cm；
e. 称取浸膏，用重蒸水完全溶解后，在常压下在1- 6 ml/min的流速下上活性炭色谱柱，色谱柱中活性炭的重量为浸膏重量的1 -12 倍；
f. 待上样完毕，在3- 8 ml/min的流速下，先用重蒸水冲洗至无色，再用5 %、10 %、20%、15 %乙醇梯度洗脱4 倍-5 倍量柱体积，收集15 %乙醇流份；
g. 将15 %乙醇洗脱溶液在压力-5.7 MPa，温度 -70 ℃减压冷冻干燥；或压力为−0.070 MPa，温度30 ℃，减压低温加热干燥得甘露三糖单体产品。
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