CN106885856B - 一种胃可宁片中氨基酸类成分指纹图谱的检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种胃可宁片指纹图谱的检测方法，通过对供试品溶液的制备、衍生化、测定并获得胃可宁片的指纹图谱。本发明还提供一种胃可宁片中氨基酸类成分指纹图谱的检测方法，通过对供试品溶液、对照品溶液及空白对照溶液的制备、衍生化、测定并获得供试品溶液、对照品溶液及空白对照溶液的液相色谱图，经与对照品溶液及空白对照溶液的液相色谱图比较后，得到氨基酸类成分指纹图谱。此方法还可以作为胃可宁片中氨基酸类成分含量的测定方法及其胃可宁片的质量检测方法。本发明中方法测定胃可宁片中氨基酸类成分结果可靠，精密度、重复性、稳定性良好，可作为胃可宁片的质控方法，实现多成分定量控制胃可宁片质量，提高胃可宁片质控水平。

Description

一种胃可宁片中氨基酸类成分指纹图谱的检测方法及其应用

技术领域

本发明属于中药成分分析检测技术领域，涉及一种胃可宁片中氨基酸类成分指纹图谱的检测方法及其应用，具体涉及一种胃可宁片及胃可宁片中氨基酸类成分指纹图谱的检测方法及其在质量检测中应用。

背景技术

胃可宁片是在传统古方“乌贝散”的基础上，由上海中药制药一厂(现为上海和黄药业有限公司)与上海市一、香山、仁济、中山、华山等家医院协作，经临床验证、对照、研制成功的一种治疗胃部疾病的药物。经临床证实，胃可宁片具有收敛、制酸、止痛作用，可用于胃病泛酸、胃及十二指肠溃疡。它是治疗慢性胃炎及消化性溃疡的理想药物，既能中和胃酸、抑制胃蛋白酶，又能收敛生肌、保护胃粘膜、促进胃上皮细胞生长，有利于炎症消失和溃疡愈合。经临床验证，75％患者服药后，在3-7天疼痛就能得到缓解。疼痛消失最快的天数为1-3天，总有效率可达80％左右；二组药物治疗中泛酸缓解率在1周己达70-80％。

胃可宁片中的主要有两味药材，珍珠层粉和浙贝母。其中，珍珠层粉为蚌科动物三角帆蚌Hyriopsis cumingii(Lea)、褶纹冠蚌Cristaria plicata(Leach)或珍珠贝科动物马氏珍珠贝Pteria martensii(Dunker)的贝壳内壁磨成粉，性味咸寒，其主要成分为钙，多种氨基酸和少量微量元素，其中所含有的角壳蛋白有人体不能合成的单元氨基酸。浙贝母为百合科植物浙贝母Fritillaria thunbergii Miq.的干燥鳞茎，性味苦寒，其主要成分为生物碱，皂苷类和多种氨基酸等。氨基酸是人体主要的营养物质及生命物质，在珍珠层粉和浙贝母中均含有丰富的氨基酸，且是珍珠层粉最主要的成分，而珍珠层粉为胃可宁的主要药材。为了更好的控制胃可宁质量，因而需要检测氨基酸这类成分。

中药指纹图谱具有整体、宏观、模糊分析等特点，可通过对中药整体特征的描述，采用适当模糊处理方式，达到整体质量控制的目的，因此成为中药质量控制的有效手段。其中色谱指纹图谱分析可以使中药所含多种化学组分的整体特征可视化，从而披露出常规检验难以发现的质量问题。目前缺乏对胃可宁片系统的定性、定量研究。氨基酸类成分作为人体营养所需蛋白质的基本物质，在胃可宁片中广泛存在，因此，有必要建立胃可宁片中氨基酸类成分的指纹图谱，同时也可用此指纹图谱方法建立成分含量测定方法，实现以一次样品制备、一次进样分析，同时完成定性和定量分析，用于对胃可宁片中氨基酸类成分进行有效的质量控制，防止生产过程中掺假、掺杂现象，使指纹图谱在胃可宁片的质量控制中更具意义。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种胃可宁片中氨基酸类成分指纹图谱的检测方法及其应用，采用优化条件的前处理及高效液相色谱方法建立了胃可宁片及胃可宁片中氨基酸类成分指纹图谱的检测方法，并且同时可以利用此方法一次对5种成分(甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸)进行定量分析。本发明中方法主要通过指纹图谱来反映胃可宁片中氨基酸类成分，且利用该方法实现多成分定量控制胃可宁片的质量，提高胃可宁片的质控水平。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种胃可宁片指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：

1)供试品溶液的制备：称取胃可宁片样品，加入5-7mol/L浓盐酸溶解，再进行水解后冷却，取水溶液浓缩至干，再加0.05-0.2mol/L稀盐酸溶解后过滤，取清液，即得供试品溶液；

优选地，所述胃可宁片为将原料珍珠层粉、浙贝母粉碎后过筛、混合，加入糊精和淀粉制粒，再加入陈皮油、润滑剂混合均匀后压片，制得。

优选地，所述胃可宁片样品为将胃可宁片粉碎后获得的粉末样品。

优选地，所述胃可宁片样品加入的重量与所述浓盐酸加入的体积之比为1:10-15(g/ml)。

更优选地，所述胃可宁片样品加入的重量与所述浓盐酸加入的体积之比为2:25(g/ml)。

优选地，所述浓盐酸的浓度为6mol/L。

优选地，所述稀盐酸的浓度为0.1mol/L。

优选地，所述水解条件为：水解设备：水浴；水解温度：100±5℃；水解时间：7-9h。

更优选地，所述水解条件为：水解设备：水浴；水解温度：100±1℃；水解时间：8h。

优选地，所述水溶液与浓盐酸加入的体积比为1:2-3。更优选地，所述水溶液与浓盐酸加入的体积比为2:5。

优选地，所述浓缩条件为：浓缩设备：水浴；浓缩温度：100±5℃。

更优选地，所述浓缩条件为：浓缩设备：水浴；浓缩温度：100±1℃。

优选地，所述稀盐酸与浓盐酸加入的体积比为1:1-3。更优选地，所述稀盐酸与浓盐酸加入的体积比为1:2。

优选地，所述过滤的方式为采用针式过滤器的滤膜过滤方式。更优选地，所述滤膜的孔径为0.45μm。

2)衍生化：在步骤1)中的供试品溶液中分别加入三乙胺的乙腈溶液和异硫氰酸苯酯的乙腈溶液，摇匀后进行衍生，再加入有机溶剂摇匀后静置分层，取下层溶液过滤后，待用；

优选地，所述三乙胺的乙腈溶液的浓度为0.5-2.0mol/L。更优选地，所述三乙胺的乙腈溶液的浓度为1mol/L。

优选地，所述异硫氰酸苯酯的乙腈溶液的浓度为0.05-0.2mol/L。更优选地，所述异硫氰酸苯酯的乙腈溶液的浓度为0.1mol/L。

优选地，所述三乙胺的乙腈溶液与供试品溶液加入的体积比为1:4-3:4。更优选地，所述三乙胺的乙腈溶液与供试品溶液加入的体积比为1:2。

优选地，所述异硫氰酸苯酯的乙腈溶液与供试品溶液加入的体积比为1:4-3:4。更优选地，所述异硫氰酸苯酯的乙腈溶液与供试品溶液加入的体积比为1:2。

优选地，所述衍生条件为：衍生温度：室温；衍生时间：0.5-2h。

更优选地，所述衍生条件为：衍生温度：20-25℃；衍生静置时间：1h。

优选地，所述有机溶剂为正己烷。

更优选地，所述正己烷与供试品溶液加入的体积比为1-3:1。进一步优选地，所述正己烷与供试品溶液加入的体积比为2:1。

优选地，所述静置分层时间为5-15min。更优选地，所述静置分层时间为10min。

优选地，所述下层溶液与供试品溶液加入的体积比为1:1。

优选地，所述下层溶液要用水稀释定容。

3)测定：采用高效液相色谱法测定经步骤2)衍生化的供试品溶液，获得供试品溶液的指纹图谱。

优选地，所述高效液相色谱法的色谱条件为：

色谱柱：Venusil AA色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；柱温：30-45℃；检测波长：250-260nm；流速：0.8-1.2mL/min；进样量：5-20μL；流动相：乙腈水溶液-醋酸钠水溶液，其中，A相为乙腈水溶液(乙腈与水的体积之比为80:15-25)，B相为40-100mmol/L醋酸钠水溶液(醋酸调pH＝6.0-7.5)；分析时间：50min；梯度洗脱。

更优选地，所述高效液相色谱法的色谱条件为：

色谱柱：Venusil AA色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；柱温：40℃；检测波长：254nm；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；流动相：乙腈水溶液-醋酸钠水溶液，其中，A相为乙腈水溶液(乙腈与水的体积之比为80:20)，B相为100mmol/L醋酸钠水溶液(醋酸调pH＝6.5)；分析时间：50min；梯度洗脱。

最优选地，所述梯度洗脱的具体程序为(见表1)：

0-15min，A相：B相体积比为0:100-8:92；

15-25min，A相：B相体积比为8:92-22:78；

25-36min，A相：B相体积比为22:78-36:64；

36-38min，A相：B相体积比为36:64-100:0；

38-43min，A相：B相体积比为100:0-100:0；

43-43.1min，A相：B相体积比为100:0-0:100；

43.1-50min，A相：B相体积比为0:100-0:100。

表1梯度洗脱程序

上述胃可宁片指纹图谱的检测方法可用于胃可宁片的质量检测。

本发明还提供一种胃可宁片中氨基酸类成分指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：

A1)供试品溶液的制备：与胃可宁片指纹图谱的检测方法的步骤1)相同；

A2)对照品溶液的制备：分别称取胃可宁片中氨基酸类成分对照品，加0.05-0.2mol/L稀盐酸溶解并定容，摇匀，得到对照品溶液；

优选地，所述胃可宁片中氨基酸类成分选自甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸中一种或多种。

更优选地，所述对照品溶液中甘氨酸的CAS号为56-40-6；精氨酸的CAS号为74-79-3；丙氨酸的CAS号为56-41-7；亮氨酸的CAS号为61-90-5；苯丙氨酸的CAS号为63-91-2。

更优选地，所述对照品溶液中各成分的含量范围为：甘氨酸10-200μg/ml、精氨酸10-200μg/ml、丙氨酸10-200μg/ml、亮氨酸10-200μg/ml、苯丙氨酸10-200μg/ml。

进一步优选地，所述对照品溶液中甘氨酸，精氨酸，丙氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸的含量均为100μg/ml。

优选地，所述对照品溶液是将对照品逐级稀释后配制。

更优选地，所述逐级稀释，包括以下步骤：

Ⅰ、分别称取甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸对照品，加0.05-0.2mol/L稀盐酸溶解、稀释并定容，配成对照品储备液；

Ⅱ、将对照品储备液再加0.05-0.2mol/L稀盐酸溶解、稀释并定容，配成对照品溶液。

A3)空白对照溶液的制备：取0.05-0.2mol/L稀盐酸作为空白对照溶液；

A4)衍生化：将步骤A1)中的供试品溶液、步骤A2)中的对照品溶液、步骤A3)中的空白对照溶液，分别加入三乙胺的乙腈溶液和异硫氰酸苯酯的乙腈溶液，摇匀后进行衍生，再加入有机溶剂摇匀后静置分层，取下层溶液过滤后，待用；

优选地，所述三乙胺的乙腈溶液的浓度为0.5-2.0mol/L。更优选地，所述三乙胺的乙腈溶液的浓度为1mol/L。

优选地，所述异硫氰酸苯酯的乙腈溶液的浓度为0.05-0.2mol/L。更优选地，所述异硫氰酸苯酯的乙腈溶液的浓度为0.1mol/L。

优选地，所述三乙胺的乙腈溶液与供试品溶液加入的体积比为1:4-3:4。更优选地，所述三乙胺的乙腈溶液与供试品溶液加入的体积比为1:2。

优选地，所述异硫氰酸苯酯的乙腈溶液与供试品溶液加入的体积比为1:4-3:4。更优选地，所述异硫氰酸苯酯的乙腈溶液与供试品溶液加入的体积比为1:2。

更优选地，所述供试品溶液、对照品溶液、空白对照溶液加入的体积比为1:1:1。

优选地，所述衍生条件为：衍生温度：室温；衍生时间：0.5-2h。

更优选地，所述衍生条件为：衍生温度：20-25℃；衍生静置时间：1h。

优选地，所述有机溶剂为正己烷。

更优选地，所述正己烷与供试品溶液加入的体积比为1-3:1。进一步优选地，所述正己烷与供试品溶液加入的体积比为2:1。

优选地，所述静置分层时间为5-15min。

更优选地，所述静置分层时间为10min。

优选地，所述下层溶液与供试品溶液加入的体积比为1:1。

优选地，所述下层溶液要用水稀释定容。

上述所用水为超纯水。

A5)测定：采用与胃可宁片指纹图谱的检测方法中相同色谱条件的高效液相色谱法，分别测定经步骤A4)衍生化的供试品溶液、对照品溶液和空白对照溶液，将获得的供试品溶液的液相色谱图，与对照品溶液和空白对照溶液的液相色谱图进行比较，根据相对保留时间，指认出共有特征峰，从而获得供试品溶液中氨基酸类成分的指纹图谱。

上述胃可宁片中氨基酸类成分指纹图谱的检测方法可用于胃可宁片的质量检测或胃可宁片中氨基酸类成分的含量测定。

本发明还提供了一种胃可宁片中氨基酸类成分含量的测定方法，包括以下步骤：

B1)供试品溶液的制备：与胃可宁片中氨基酸类成分指纹图谱的检测方法的步骤A1)相同；

B2)对照品溶液的制备：与胃可宁片中氨基酸类成分指纹图谱的检测方法的步骤A2)相同；

B3)衍生化：与胃可宁片中氨基酸类成分指纹图谱的检测方法的步骤A4)相同；

B4)测定：采用与胃可宁片中氨基酸类成分指纹图谱的检测方法中相同色谱条件的高效液相色谱法，分别测定经步骤B3)衍生化的供试品溶液和对照品溶液，并采用外标法计算供试品溶液中氨基酸类成分的含量。

优选地，所述外标法选自外标一点法或标准曲线法中的一种。

所述外标一点法是指：移取一个一定体积的步骤B2)所述对照品，配成一个一定浓度的对照品溶液，采用高效液相色谱仪进样分析，获得对照品溶液中氨基酸类成分含量与峰面积的线性关系，以每一种氨基酸类成分色谱峰面积对应其相应的含量，绘制相应的工作曲线，计算得到各工作曲线的回归方程。再将供试品溶液采用高效液相色谱仪检测，将获得的供试品溶液中氨基酸类成分的色谱峰面积，分别代入所述各工作曲线的回归方程中，可得到相应氨基酸类成分的含量。

所述标准曲线法是指：分别移取一系列不同体积的步骤B2)所述对照品，配成一系列不同浓度的对照品溶液，采用高效液相色谱仪进样分析，获得对照品溶液中氨基酸类成分含量与峰面积的线性关系，以每一种氨基酸类成分色谱峰面积对应其相应的含量，绘制相应的标准工作曲线，计算得到各标准工作曲线的回归方程。再将供试品溶液采用高效液相色谱仪检测，将获得的供试品溶液中氨基酸类成分的色谱峰面积，分别代入所述各标准工作曲线的回归方程中，可得到相应氨基酸类成分的含量。

本发明还提供一种胃可宁片的质量检测方法，包括采用前述指纹图谱的检测方法获得供试品的指纹图谱，将得到的供试品的指纹图谱与相同指纹图谱检测条件下获得的胃可宁片的标准指纹图谱进行特征峰的比对、指纹图谱相似度计算。

优选地，所述指纹图谱选自胃可宁片指纹图谱、胃可宁片中氨基酸类成分指纹图谱中的一种或多种组合。

更优选地，所述指纹图谱为胃可宁片中氨基酸类成分指纹图谱。

优选地，所述胃可宁片的标准指纹图谱是指，将同一种至少10个批次的胃可宁片，按照相同指纹图谱检测条件下获得的指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(国家药典委员会，版本2009)，生成对照指纹图谱，从而确定胃可宁片的标准指纹图谱。

所述标准指纹图谱以12号峰为内参比峰，包括符合下列特征的12个共有指纹峰：

优选地，所述特征峰的比对所获得的共有特征峰共12个(见图5)。其中1号峰和4号峰来源于浙贝母，5号峰来源于珍珠层粉，而其余9个峰共同来源了浙贝母和珍珠层粉(见图3-4)。其中，2号峰为甘氨酸(Glu)、3号峰为精氨酸(Arg)，6号峰为丙氨酸(Ala)，11号峰为亮氨酸(Leu)，12号峰为苯丙氨酸(Phe)(见图2、5)。

优选地，所述指纹图谱相似度≥0.95。即在实际检测时，当被检样品与标准指纹图谱进行相似度比较，当相似度≥0.95，即为合格质量的胃可宁片。

如上所述，本发明提供的一种胃可宁片中氨基酸类成分指纹图谱的检测方法及其应用，采用优化反应条件的前处理及仪器分析方法，建立了胃可宁片及其胃可宁片中氨基酸类成分指纹图谱，同时此方法又可以对胃可宁片中氨基酸类成分进行定量分析，实现一次样品分析，同时完成定性和定量分析。该方法的精密度和重复性试验的峰面积和保留时间RSD值均小于3％，精密度、重复性良好。并能保持供试品溶液在8h内稳定，稳定性的峰面积和保留时间RSD值均小于3％，稳定性良好。因此，本发明中方法测定胃可宁片中氨基酸类成分结果可靠，样品测定方法简便易行，可作为胃可宁片的质控方法，实现多成分定量控制胃可宁片质量，提高胃可宁片质控水平。

附图说明

图1显示为本发明中的空白对照溶液的液相色谱图。

图2显示为本发明中的对照品溶液的液相色谱图，其中，a，甘氨酸(Glu)；b，精氨酸(Arg)；c，丙氨酸(Ala)；d，亮氨酸(Leu)；e，苯丙氨酸(Phe)。

图3显示为本发明中的未添加珍珠层粉的胃可宁片供试品溶液的液相色谱图。

图4显示为本发明中的未添加浙贝母的胃可宁片供试品溶液的液相色谱图。

图5显示为本发明中的胃可宁片供试品溶液的液相色谱图，其中，2(a)，甘氨酸(Glu)；3(b)，精氨酸(Arg)；6(c)，丙氨酸(Ala)；11(d)，亮氨酸(Leu)；12(e)，苯丙氨酸(Phe)。

图6显示为本发明中的10批胃可宁片供试品溶液的对照液相色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

以下实施例使用的试剂和仪器如下：

1、试剂

胃可宁片(市售，批号：151109、160112、160118、160220、160303、160314、160325、160407、160425、160509，上海和黄药业有限公司)；甘氨酸(Gly)、精氨酸(Arg)、丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)(纯度均＞99％，中国食品药品检定研究院)；乙腈(色谱纯，美国TEDIA公司)；醋酸(色谱纯，德国CNW公司)；三乙胺(TEA，色谱纯，德国CNW公司)；异硫氰酸苯酯(PITC，纯度98％，中国上海阿拉丁试剂公司)；盐酸(HCl，纯度36％～38％，上海豪申化学试剂有限公司)；无水醋酸钠(分析纯，上海豪申化学试剂有限公司)；超纯水(Millipore超纯水发生器自制)；正己烷(分析纯，上海豪申化学试剂有限公司)。

2、仪器

Agilent1100高效液相色谱仪(配DAD检测器，美国Agilent公司)；SB-5200超声波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；Milli-Q超纯水发生器(美国Millipore公司)；数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)。

实施例1

1、实验部分

1.1样品前处理

供试品溶液的制备：准确称取胃可宁片2g，置于100mL锥形瓶中，加入6mol/L盐酸25mL溶解，然后置于100±1℃水浴中水解8小时，取出冷却，取水溶液10mL，置于蒸发皿中，100±1℃水浴浓缩至干，加入5mL的0.1mol/L稀盐酸溶解，用0.45μm滤膜的针式过滤器过滤后，取清液，供衍生待用。

1.2衍生化

准确量取供试品溶液400μL，置于2mL离心管中，加入1mol/L三乙胺的乙腈溶液200μL和0.1mol/L异硫氰酸苯酯的乙腈溶液200μL，摇匀室温静置衍生1小时。衍生结束后加入800μL正己烷，振摇并静置10min，取下层溶液400μL并用水稀释到1mL，混合均匀后用0.22μm滤膜的针式过滤器过滤，即得所需待测溶液。

1.3色谱条件

高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱：Venusil AA色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；柱温：40℃；检测波长：254nm；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；流动相：乙腈水溶液-醋酸钠水溶液，其中，A相为乙腈水溶液(乙腈与水的体积之比为80：20)，B相为100mmol/L醋酸钠水溶液(醋酸调pH＝6.5)；分析时间：50min；梯度洗脱。

梯度洗脱的具体程序为：

0-15min，A相：B相体积比为0:100-8:92；

15-25min，A相：B相体积比为8:92-22:78；

25-36min，A相：B相体积比为22:78-36:64；

36-38min，A相：B相体积比为36:64-100:0；

38-43min，A相：B相体积比为100:0-100:0；

43-43.1min，A相：B相体积比为100:0-0:100；

43.1-50min，A相：B相体积比为0:100-0:100。

1.4测定

采用步骤1.3中的高效液相色谱法测定经步骤1.2衍生化的供试品溶液，获得供试品溶液的指纹图谱。

2、指纹图谱

将步骤1.4获得供试品的指纹图谱，与相同指纹图谱检测条件下获得的胃可宁片的标准指纹图谱进行特征峰的比对、指纹图谱相似度计算，从而对胃可宁片进行质量控制。其中，胃可宁片的标准指纹图谱，是将上述至少10个批次的同一种供试品，按照相同指纹图谱检测条件下获得的指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(国家药典委员会，版本2009)，生成对照指纹图谱获得的。通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统)的计算，得到10批次胃可宁片样品的整体相似度评价结果，整体相似度可以体现不同批次样品间各成分在种类及其相对含量上的相似程度，结果见表2。结果显示，10批胃可宁片的相似度均大于0.95以上，表明此指纹图谱作为胃可宁片的标准指纹图谱，可用于胃可宁片质量控制。

当被检样品与标准指纹图谱进行相似度比较，当相似度≥0.95，即为合格质量的胃可宁片。

表2 10批胃可宁片指纹图谱相似度结果

实施例2

1、实验部分

1.1样品前处理

供试品溶液的制备：准确称取一定量的胃可宁片，置于100mL锥形瓶中，加入5-7mol/L盐酸溶解，胃可宁片加入的重量与5-7mol/L盐酸加入的体积之比为1:10-15(g/ml)。然后置于100±5℃水浴中水解7-9小时，取出冷却。取水溶液置于蒸发皿中，100±5℃水浴浓缩至干，水溶液与5-7mol/L盐酸加入的体积比为1:2-3。再加入0.05-0.2mol/L稀盐酸溶解，0.05-0.2mol/L稀盐酸与5-7mol/L盐酸加入的体积比为1:1-3。用0.45μm滤膜的针式过滤器过滤后，取清液贮存于4℃冰箱中，供衍生待用。

1.2衍生化

准确量取一定量的供试品溶液，置于2mL离心管中，分别加入0.5-2.0mol/L三乙胺的乙腈溶液和0.05-0.2mol/L异硫氰酸苯酯的乙腈溶液，摇匀室温静置衍生0.5-2.0小时。三乙胺的乙腈溶液与供试品溶液加入的体积比为1:4-3:4。异硫氰酸苯酯的乙腈溶液与供试品溶液加入的体积比为1:4-3:4。衍生结束后加入正己烷，振摇并静置5-15min，正己烷与供试品溶液加入的体积比为1-3:1。取下层溶液并用水稀释到一定体积，混合均匀，所取的下层溶液与供试品溶液加入的体积比为1:1。再用0.22μm滤膜的针式过滤器过滤，即得所需待测溶液。

1.3色谱条件

高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱：Venusil AA色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；柱温：30-45℃；检测波长：250-260nm；流速：0.8-1.2mL/min；进样量：5-20μL；流动相：乙腈水溶液-醋酸钠水溶液，其中，A相为乙腈水溶液(乙腈与水的体积之比为80:15-25)，B相为40-100mmol/L醋酸钠水溶液(醋酸调pH＝6.0-7.5)；分析时间：50min；梯度洗脱。

梯度洗脱的具体程序为：

0-15min，A相：B相体积比为0:100-8:92；

15-25min，A相：B相体积比为8:92-22:78；

25-36min，A相：B相体积比为22:78-36:64；

36-38min，A相：B相体积比为36:64-100:0；

38-43min，A相：B相体积比为100:0-100:0；

43-43.1min，A相：B相体积比为100:0-0:100；

43.1-50min，A相：B相体积比为0:100-0:100。

1.4测定

采用步骤1.3中的高效液相色谱法测定经步骤1.2衍生化的供试品溶液，获得供试品溶液的指纹图谱。

2、指纹图谱

将步骤1.4获得供试品的指纹图谱，与相同指纹图谱检测条件下获得的胃可宁片的标准指纹图谱进行特征峰的比对、指纹图谱相似度计算，从而对胃可宁片进行质量控制。其中，胃可宁片的标准指纹图谱，是将上述至少10个批次的同一种供试品，按照相同指纹图谱检测条件下获得的指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(国家药典委员会，版本2009)，生成对照指纹图谱获得的。通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统)的计算，得到10批次胃可宁片样品的整体相似度评价结果，整体相似度可以体现不同批次样品间各成分在种类及其相对含量上的相似程度。当10批胃可宁片的相似度均大于0.95以上，表明此指纹图谱作为胃可宁片的标准指纹图谱，可用于胃可宁片质量控制。

当被检样品与标准指纹图谱进行相似度比较，当相似度≥0.95，即为合格质量的胃可宁片。

实施例3

1、实验部分

1.1样品前处理

供试品溶液的制备：与实施例1中的步骤1.1中的供试品溶液的制备过程相同。

1.2对照品前处理

对照品溶液的制备：分别精密称取甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸对照品20mg，用0.1mol/L盐酸溶解并定容，摇匀，逐级稀释后，由对照品储备液得到对照品溶液。对照品溶液中甘氨酸，精氨酸，丙氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸的含量均为100μg/ml。

1.3衍生化

供试品溶液的衍生化与实施例1的步骤1.2中的供试品溶液的衍生化过程相同。

准确量取步骤1.2中的对照品溶液400μL，置于2mL离心管中，加入1mol/L三乙胺的乙腈溶液200μL和0.1mol/L异硫氰酸苯酯的乙腈溶液200μL，摇匀室温静置衍生1小时。衍生结束后加入800μL正己烷，振摇并静置10min，取下层溶液400μL并用水稀释到1mL，混合均匀后用0.22μm滤膜的针式过滤器过滤，即得所需待测对照品溶液。

1.4比较溶液

取0.1mol/L盐酸400μL作为空白对照溶液，按步骤1.3中的衍生化方法进行衍生化，得到所需待测空白对照溶液。

取未添加珍珠层粉的胃可宁片样品，按步骤1.1中的方法进行前处理，获得未添加珍珠层粉的阴性样品溶液。再取未添加珍珠层粉的阴性样品溶液400μL，按步骤1.3中的衍生化方法进行衍生化，得到所需待测未添加珍珠层粉的阴性样品溶液。

取未添加浙贝母的胃可宁片样品，按步骤1.1中的方法进行前处理，获得未添加浙贝母的阴性样品溶液。再取未添加浙贝母的阴性样品溶液400μL，按步骤1.3中的衍生化方法进行衍生化，得到所需待测未添加浙贝母的阴性样品溶液。

1.5色谱条件

高效液相色谱法的色谱条件与实施例1的步骤1.3中的高效液相色谱法的色谱条件相同。

1.6测定

采用步骤1.5中的高效液相色谱法测定经步骤1.3衍生化的供试品溶液和对照品溶液，将获得的供试品溶液的液相色谱图，与对照品溶液的液相色谱图进行比较，根据相对保留时间，指认出共有特征峰，从而获得供试品溶液中氨基酸类成分的指纹图谱。

同时，采用步骤1.5中的高效液相色谱法测定经步骤1.4衍生化的空白溶液、未添加珍珠层粉的阴性样品溶液、未添加浙贝母的阴性样品溶液，获得的空白溶液、未添加珍珠层粉的阴性样品溶液、未添加浙贝母的阴性样品溶液的液相色谱图，作为参考。

2、指纹图谱

将步骤1.6获得供试品的指纹图谱，与相同指纹图谱检测条件下获得的胃可宁片的标准指纹图谱进行特征峰的比对、指纹图谱相似度计算，从而对胃可宁片进行质量控制。其中，胃可宁片的标准指纹图谱，是将上述至少10个批次的同一种供试品，按照相同指纹图谱检测条件下获得的指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(国家药典委员会，版本2009)，生成对照指纹图谱获得的，具体图谱见图6。通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统的计算，得到10批次胃可宁片样品的整体相似度评价结果，整体相似度可以体现不同批次样品间各成分在种类及其相对含量上的相似程度，结果见表2。结果显示，10批胃可宁片的相似度均大于0.95以上，表明此指纹图谱作为胃可宁片的标准指纹图谱，可用于胃可宁片质量控制。当被检样品与标准指纹图谱进行相似度比较，当相似度≥0.95，即为合格质量的胃可宁片。

同时，如图5所示，此指纹图谱中具有分离度较好和稳定性较高的12个共有峰。通过与空白溶液(见图1)、未添加珍珠层粉的阴性样品溶液(见图3)、未添加浙贝母的阴性样品溶液的液相色谱图(见图4)对比，确定了12个共有峰的来源，其中1号峰和4号峰来源于浙贝母，5号峰来源于珍珠层粉，而其余9个峰共同来源了浙贝母和珍珠层粉。再通过与图2中对照品溶液的液相色谱图进行比较，确定图5中2号峰为甘氨酸(Glu)、3号峰为精氨酸(Arg)，6号峰为丙氨酸(Ala)，11号峰为亮氨酸(Leu)，12号峰为苯丙氨酸(Phe)。

3、方法学验证

3.1精密度

取批号为151109的胃可宁片样品1份，按步骤1.1制备供试品溶液，并按步骤1.3对供试品溶液进行衍生化，再按步骤1.5的液相色谱条件进行测定，连续进样6次，以12号峰为参照峰，分别计算12个共有峰的相对保留时间和相对峰面积，精密度具体结果见表3、4。结果表明，12个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值，均小于3％，说明该指纹图谱的精密度良好。

表3精密度相对保留时间结果

表4精密度相对峰面积结果

3.2重复性

取批号为151109的胃可宁片样品6份，按步骤1.1制备供试品溶液，并按步骤1.3对供试品溶液进行衍生化，再按步骤1.5的液相色谱条件进行测定，以12号峰为参照峰，分别计算12个共有峰的相对保留时间和相对峰面积，重复性具体结果见表5、6。

结果表明，12个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值，均小于3％，说明该指纹图谱的重复性良好。

表5重复性相对保留时间结果

表6重复性相对峰面积结果

3.3稳定性

取批号为151109的胃可宁片样品1份，按步骤1.1制备供试品溶液，并按步骤1.3对供试品溶液进行衍生化，再按步骤1.5的液相色谱条件进行测定，分别在0、1、2、4、6、8h测定，以12号峰为参照峰，分别计算12个共有峰的相对保留时间和相对峰面积，重复性具体结果见表7、8。

结果表明，12个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值，均小于3％，说明该指纹图谱在8h内稳定性良好。

表7稳定性相对保留时间结果

表8稳定性相对峰面积结果

实施例4

1、实验部分

1.1样品前处理

供试品溶液的制备：与实施例2中的步骤1.1中的供试品溶液的制备过程相同。

1.2对照品前处理

对照品溶液的制备：分别精密称取甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸对照品20mg，用0.05-0.2mol/L盐酸溶解并定容，摇匀，逐级稀释后，由对照品储备液得到对照品溶液。对照品溶液中甘氨酸，精氨酸，丙氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸的含量范围均为10-200μg/ml。

1.3衍生化

供试品溶液的衍生化与实施例2的步骤1.2中的供试品溶液的衍生化过程相同。

准确量取一定量的对照品溶液，置于2mL离心管中，分别加入0.5-2.0mol/L三乙胺的乙腈溶液和0.05-0.2mol/L异硫氰酸苯酯的乙腈溶液，摇匀室温静置衍生0.5-2.0小时。三乙胺的乙腈溶液与对照品溶液加入的体积比为1:4-3:4。异硫氰酸苯酯的乙腈溶液与对照品溶液加入的体积比为1:4-3:4。衍生结束后加入正己烷，振摇并静置5-15min，正己烷与对照品溶液加入的体积比为1-3:1。取下层溶液并用水稀释到一定体积，混合均匀，所取的下层溶液与对照品溶液加入的体积比为1:1。再用0.22μm滤膜的针式过滤器过滤，即得所需待测对照品溶液。

1.4比较溶液

取一定量0.1mol/L盐酸作为空白溶液，按步骤1.3中的衍生化方法进行衍生化，得到所需待测空白溶液。

取未添加珍珠层粉的胃可宁片样品，按步骤1.1中的方法进行前处理，获得未添加珍珠层粉的阴性样品溶液。再取一定量未添加珍珠层粉的阴性样品溶液，按步骤1.3中的衍生化方法进行衍生化，得到所需待测未添加珍珠层粉的阴性样品溶液。

取未添加浙贝母的胃可宁片样品，按步骤1.1中的方法进行前处理，获得未添加浙贝母的阴性样品溶液。再取一定量未添加浙贝母的阴性样品溶液，按步骤1.3中的衍生化方法进行衍生化，得到所需待测未添加浙贝母的阴性样品溶液。

1.5色谱条件

高效液相色谱法的色谱条件与实施例2的步骤1.3中的高效液相色谱法的色谱条件相同。

1.6测定

采用步骤1.5中的高效液相色谱法测定经步骤1.3衍生化的供试品溶液和对照品溶液，将获得的供试品溶液的液相色谱图，与对照品溶液的液相色谱图进行比较，根据相对保留时间，指认出共有特征峰，从而获得供试品溶液中氨基酸类成分的指纹图谱。

同时，采用步骤1.5中的高效液相色谱法测定经步骤1.4衍生化的空白溶液、未添加珍珠层粉的阴性样品溶液、未添加浙贝母的阴性样品溶液，获得的空白溶液、未添加珍珠层粉的阴性样品溶液、未添加浙贝母的阴性样品溶液的液相色谱图，作为参考。

2、指纹图谱

将步骤1.6获得供试品的指纹图谱，与相同指纹图谱检测条件下获得的胃可宁片的标准指纹图谱进行特征峰的比对、指纹图谱相似度计算，从而对胃可宁片进行质量控制。其中，胃可宁片的标准指纹图谱，是将上述至少10个批次的同一种供试品，按照相同指纹图谱检测条件下获得的指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(国家药典委员会，版本2009)，生成对照指纹图谱获得的。通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统的计算，得到10批次胃可宁片样品的整体相似度评价结果，整体相似度可以体现不同批次样品间各成分在种类及其相对含量上的相似程度。当10批胃可宁片的相似度均大于0.95以上，表明此指纹图谱作为胃可宁片的标准指纹图谱，可用于胃可宁片质量控制。当被检样品与标准指纹图谱进行相似度比较，当相似度≥0.95，即为合格质量的胃可宁片。

同时，此指纹图谱中具有分离度较好和稳定性较高的12个共有峰。通过与空白溶液、未添加珍珠层粉的阴性样品溶液、未添加浙贝母的阴性样品溶液的液相色谱图对比，确定了12个共有峰的来源，其中1号峰和4号峰来源于浙贝母，5号峰来源于珍珠层粉，而其余9个峰共同来源了浙贝母和珍珠层粉。

实施例5

1、实验部分

1.1样品前处理

供试品溶液的制备：与实施例1中的步骤1.1中的供试品溶液的制备过程相同。

1.2对照品前处理

对照品溶液的制备：与实施例3中的步骤1.2中的对照品溶液的制备过程相同。

1.3衍生化

供试品溶液的衍生化与实施例1的步骤1.2中的供试品溶液的衍生化过程相同。

对照品溶液的衍生化与实施例3的步骤1.3中的对照品溶液的衍生化过程相同。

1.4色谱条件

高效液相色谱法的色谱条件与实施例1的步骤1.3中的高效液相色谱法的色谱条件相同。

1.5测定

采用步骤1.4中的高效液相色谱法测定经步骤1.3衍生化的供试品溶液和对照品溶液，采用外标一点法计算供试品溶液中氨基酸类成分的含量，供试品溶液的液相色谱图见图5。通过与图2中对照品溶液的液相色谱图进行比较，确定图5中2号峰为甘氨酸(Glu)、3号峰为精氨酸(Arg)，6号峰为丙氨酸(Ala)，11号峰为亮氨酸(Leu)，12号峰为苯丙氨酸(Phe)。

2、方法学验证

2.1精密度

取批号为1501109的胃可宁片样品1份，按步骤1.1制备供试品溶液，并按步骤1.3对供试品溶液进行衍生化，再按步骤1.4的液相色谱条件进行测定，连续进样6次。将测定结果与步骤1.5中的对照品溶液的液相色谱图，进行比较，从而获得供试品溶液中氨基酸类成分的测定精密度。精密度具体结果见表3、4。结果表明，供试品溶液中氨基酸类成分所在特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值，均小于3％，供试品溶液中氨基酸类成分的测定精密度良好。

3.2重复性

取批号为1501109的胃可宁片样品6份，按步骤1.1制备供试品溶液，并按步骤1.3对供试品溶液进行衍生化，再按步骤1.4的液相色谱条件进行测定。将测定结果与步骤1.5中的对照品溶液的液相色谱图，进行比较，从而获得供试品溶液中氨基酸类成分的测定重复性。重复性具体结果见表5、6。结果表明，供试品溶液中氨基酸类成分所在特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值，均小于3％，供试品溶液中氨基酸类成分的测定重复性良好。

3.3稳定性

取批号为1501109的胃可宁片样品1份，按步骤1.1制备供试品溶液，并按步骤1.3对供试品溶液进行衍生化，再按步骤1.4的液相色谱条件进行测定，分别在0、1、2、4、6、8h测定。将测定结果与步骤1.5中的对照品溶液的液相色谱图，进行比较，从而获得供试品溶液中氨基酸类成分的测定稳定性。稳定性具体结果见表7、8。结果表明，供试品溶液中氨基酸类成分所在特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值，均小于3％，供试品溶液中氨基酸类成分的测定稳定性良好，可以在8h内保持稳定。

实施例6

1、实验部分

1.1样品前处理

供试品溶液的制备：与实施例2中的步骤1.1中的供试品溶液的制备过程相同。

1.2对照品前处理

对照品溶液的制备：与实施例4中的步骤1.2中的对照品溶液的制备过程相同。

1.3衍生化

供试品溶液的衍生化与实施例2的步骤1.2中的供试品溶液的衍生化过程相同。

对照品溶液的衍生化与实施例4的步骤1.3中的对照品溶液的衍生化过程相同。

1.4色谱条件

高效液相色谱法的色谱条件与实施例2的步骤1.3中的高效液相色谱法的色谱条件相同。

1.5测定

采用步骤1.4中的高效液相色谱法测定经步骤1.3衍生化的供试品溶液和对照品溶液，采用外标一点法计算供试品溶液中氨基酸类成分的含量，供试品溶液的液相色谱图见图5。通过与图2中对照品溶液的液相色谱图进行比较，确定图5中2号峰为甘氨酸(Glu)、3号峰为精氨酸(Arg)，6号峰为丙氨酸(Ala)，11号峰为亮氨酸(Leu)，12号峰为苯丙氨酸(Phe)。

所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (8)

1.一种胃可宁片指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：

1)供试品溶液的制备：称取胃可宁片样品，加入5-7mol/L浓盐酸溶解，再进行水解后冷却，取水溶液浓缩至干，再加0.05-0.2mol/L稀盐酸溶解后过滤，取清液，即得供试品溶液；

2)衍生化：在步骤1)中的供试品溶液中分别加入三乙胺的乙腈溶液和异硫氰酸苯酯的乙腈溶液，摇匀后进行衍生，再加入有机溶剂摇匀后静置分层，取下层溶液过滤后，待用；

3)测定：采用高效液相色谱法测定经步骤2)衍生化的供试品溶液，获得供试品溶液的指纹图谱；

步骤3)中，所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱：Venusil AA色谱柱，4.6mm×250mm,5μm；柱温：30-45℃；检测波长：250-260nm；流速：0.8-1.2mL/min；进样量：5-20μL；流动相：乙腈水溶液-醋酸钠水溶液，其中，A相为乙腈水溶液，乙腈与水的体积之比为80:15-25，B相为40-100mmol/L醋酸钠水溶液，醋酸调pH＝6.0-7.5；分析时间：50min；

梯度洗脱；

所述梯度洗脱的具体程序为：0-15min，A相：B相体积比为0:100-8:92；15-25min，A相：B相体积比为8:92-22:78；25-36min，A相：B相体积比为22:78-36:64；36-38min，A相：B相体积比为36:64-100:0；38-43min，A相：B相体积比为100:0-100:0；43-43.1min，A相：B相体积比为100:0-0:100；43.1-50min，A相：B相体积比为0:100-0:100。

2.根据权利要求1所述的一种胃可宁片指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤1)中，包括以下条件中任一项或多项：

a1)所述胃可宁片样品加入的重量与所述浓盐酸加入的体积之比为1:10-15，g/ml；

a2)所述水解条件为：水解设备：水浴；水解温度：95-105℃；水解时间：7-9h；

a3)所述水溶液与浓盐酸加入的体积比为1:2-3；

a4)所述浓缩条件为：浓缩设备：水浴；浓缩温度：95-105℃；

a5)所述稀盐酸与浓盐酸加入的体积比为1:1-3。

3.根据权利要求1所述的一种胃可宁片指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤2)中，包括以下条件中任一项或多项：

b1)所述三乙胺的乙腈溶液的浓度为0.5-2.0mol/L；

b2)所述异硫氰酸苯酯的乙腈溶液的浓度为0.05-0.2mol/L；

b3)所述三乙胺的乙腈溶液与供试品溶液加入的体积比为1:4-3:4；

b4)所述异硫氰酸苯酯的乙腈溶液与供试品溶液加入的体积比为1:4-3:4；

b5)所述衍生条件为：衍生温度：室温；衍生时间：0.5-2h；

b6)所述有机溶剂为正己烷；所述正己烷与供试品溶液加入的体积比为1-3:1。

4.一种胃可宁片中氨基酸类成分指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：

A1)供试品溶液的制备：采用权利要求1-3任一权利要求所述胃可宁片指纹图谱的检测方法的步骤1)制备；

A2)对照品溶液的制备：分别称取胃可宁片中氨基酸类成分对照品，加0.05-0.2mol/L稀盐酸溶解并定容，摇匀，得到对照品溶液，所述胃可宁片中氨基酸类成分对照品选自甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸中一种或多种；

A3)空白对照溶液的制备：取0.05-0.2mol/L稀盐酸作为空白对照溶液；

A4)衍生化：将步骤A1)中的供试品溶液、步骤A2)中的对照品溶液、步骤A3)中的空白对照溶液，分别加入三乙胺的乙腈溶液和异硫氰酸苯酯的乙腈溶液，摇匀后进行衍生，再加入有机溶剂摇匀后静置分层，取下层溶液过滤后，待用；

A5)采用与权利要求1-3任一权利要求所述胃可宁片指纹图谱的检测方法中相同色谱条件的高效液相色谱法，分别测定经步骤A4)衍生化的供试品溶液、对照品溶液和空白对照溶液，将获得的供试品溶液的液相色谱图，与对照品溶液和空白对照溶液的液相色谱图进行比较，根据相对保留时间，指认出共有特征峰，从而获得供试品溶液中氨基酸类成分的指纹图谱。

5.根据权利要求1-3任一权利要求所述的胃可宁片指纹图谱的检测方法或权利要求4所述胃可宁片中氨基酸类成分指纹图谱的检测方法的用途，其特征在于，将所述检测方法用于胃可宁片的质量检测或胃可宁片中氨基酸类成分的含量测定。

6.一种胃可宁片的质量检测方法，包括采用权利要求1-3任一权利要求所述的胃可宁片指纹图谱的检测方法或权利要求4所述胃可宁片中氨基酸类成分指纹图谱的检测方法，获得供试品的指纹图谱，将得到的供试品的指纹图谱与相同指纹图谱检测条件下获得的胃可宁片的标准指纹图谱进行特征峰的比对、指纹图谱相似度计算。

7.根据权利要求6所述的一种胃可宁片的质量检测方法，其特征在于，所述标准指纹图谱以12号峰为内参比峰，包括符合下列特征的12个共有指纹峰：

8.一种胃可宁片中氨基酸类成分含量的测定方法，包括以下步骤：

B1)供试品溶液的制备：采用权利要求4所述胃可宁片中氨基酸类成分指纹图谱的检测方法的步骤A1)制备；

B2)对照品溶液的制备：采用权利要求4所述胃可宁片中氨基酸类成分指纹图谱的检测方法的步骤A2)制备；

B3)衍生化：采用权利要求4所述胃可宁片中氨基酸类成分指纹图谱的检测方法的步骤A4)制备；

B4)测定：采用与权利要求4所述胃可宁片中氨基酸类成分指纹图谱的检测方法中相同色谱条件的高效液相色谱法，分别测定经步骤B3)衍生化的供试品溶液和对照品溶液，并采用外标法计算供试品溶液中氨基酸类成分的含量。