CN105021729B - 一种健骨药物的质量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种健骨药物的质量检测方法，属于药物质量检测技术领域。采用的技术方案为：该健骨药物由人工虎骨粉和辅料制成胶囊，其质量检测方法包括以下测定步骤：1)将健骨药物水解后，测定样品中总氨基酸含量，每粒胶囊含总氨基酸不少于65mg；2)采用原子吸收分光光度法测定该健骨药物中总钙含量，每粒胶囊含钙不少于55mg。本发明建立采用微波水解、自动在线衍生，使用全自动氨基酸分析仪或者采用传统水解、PITC衍生法，使用高效液相色谱法测定制剂中总氨基酸的含量测定方法，增加了采用原子吸收分光光度法测定样品中钙的含量测定方法，保证了质量检测方法的准确性和先进性，能够有效的控制金天格胶囊的产品质量。
Description
技术领域
本发明属于药物质量检测技术领域，具体涉及一种健骨药物的质量检测方法。
背景技术
金天格胶囊是一种健骨药物，由人工虎骨粉和适量辅料制成的制剂，人工虎骨粉具有健骨作用，用于腰背疼痛，腰膝酸软，下肢痿弱，步履艰难等症状的改善。
虎骨作为一种名贵中药材并经过千百年的临床实践，它的药用价值得到了充分的证明，虎骨具有显著的抗炎、追风、镇痛、健骨等功效，主要用于治疗骨质疏松、风湿以及骨伤等。在1993年，为遵守国际公约，我国明令禁止虎骨贸易和药用后，含有虎骨成分的很多著名中成药就悄然消失了。为使具有悠久历史的以虎骨为原料的传统中药制品不在市场上消亡，2003年由中国药品生物制品检定所、金花企业(集团)股份有限公司等联合研制出了与天然虎骨所含成分基本相同的人工虎骨粉配方。经实验室检测，用该配方制成的人工虎骨指纹图谱与天然虎骨几乎相同，13项实验及30多个药理、药效及安全性指标与天然虎骨粉无明显差异。
国家食品药品监督管理局国家药品标准YBZ01592003-2009Z颁布了金天格胶囊的质量控制标准，原质量控制方法中总氨基酸的含量采用传统水解、手动衍生，使用高效液相色谱法进行测定，原质量控制方法只对总磷量进行了测定，局限性较大。同时，原方法可操作性差，误差大，效率低，操作时间为2天，专属性差。
发明内容
为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供健骨药物(金天格胶囊)的质量检测方法。
本发明是通过以下技术方案来实现：
本发明公开的一种健骨药物的质量检测方法，该健骨药物由人工虎骨粉和辅料制成胶囊，其质量检测方法包括以下测定步骤：
1)将健骨药物水解后，测定样品中总氨基酸含量，每粒胶囊含总氨基酸不少于65mg，具体选择以下任意一种测定方法：
a.采用微波水解、自动在线衍生，使用全自动氨基酸分析仪测定每粒胶囊中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量；
b.采用传统水解、PITC衍生法，用高效液相色谱法测定金天格胶囊中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量；
c.采用传统水解、自动在线衍生，使用全自动氨基酸分析仪测定金天格胶囊中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量；
d.采用微波水解、PITC手动衍生，用高效液相色谱法测定金天格胶囊中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量；
2)采用原子吸收分光光度法测定该健骨药物中总钙含量，每粒胶囊含钙不少于55mg。
步骤1)中：a.采用微波水解、自动在线衍生，使用全自动氨基酸分析仪测定每粒胶囊中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量，具体包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：精密称取氨基酸对照品：L-羟脯氨酸、脯氨酸，门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及赖氨酸，加浓度为0.02mol/L盐酸溶液配成对照品溶液，具体配制关系如下：
| 氨基酸 | 三字代码 | 称样量 | 稀释倍数 |
| 门冬氨酸 | Asp | 10～30mg | 2500 |
| 苏氨酸 | Thr | 10～30mg | 10000 |
| 丝氨酸 | Ser | 10～30mg | 10000 |
| 谷氨酸 | Glu | 10～30mg | 1000 |
| 甘氨酸 | Gly | 10～30mg | 1000 |
| 丙氨酸 | Ala | 10～30mg | 2500 |
| 缬氨酸 | Val | 10～30mg | 10000 |
| 蛋氨酸 | Met | 10～30mg | 20000 |
| 异亮氨酸 | Ile | 10～30mg | 10000 |
| 亮氨酸 | Leu | 10～30mg | 2500 |
| 酪氨酸 | Tyr | 10～30mg | 10000 |
| 苯丙氨酸 | Phe | 10～30mg | 10000 |
| 赖氨酸 | Lys | 10～30mg | 2500 |
| 组氨酸 | His | 10～30mg | 10000 |
| 精氨酸 | Arg | 10～30mg | 2500 |
| L-羟脯氨酸 | Hypro | 10～30mg | 2500 |
| 脯氨酸 | Pro | 10～30mg | 2500 |
(2)供试品溶液的制备：精密称定胶囊中的内容物人工虎骨粉0.2g，置高通量微波消解管中，精密加入10mL浓度为6mol/L的盐酸溶液，称定重量，置微波消解仪内于180℃水解15min，放冷至室温，用6mol/L的盐酸溶液补足减失的重量，加入10mL浓度为6mol/L的氢氧化钠溶液中和，并转移至100mL容量瓶中，用浓度为0.02mol/L的盐酸溶液稀释并定容至刻度；精密量取5mL置于25mL容量瓶中，用浓度为0.02mol/L的盐酸溶液稀释并定容至刻度，滤过，制得供试品溶液；
(3)总氨基酸的测定：分别精密量取制备的对照品溶液及供试品溶液各20μL，并分别注入氨基酸分析仪，测得所述健骨药物每粒胶囊中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量。
步骤1)中：b.采用传统水解、PITC衍生法，用高效液相色谱法测定健骨药物每粒胶囊中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量，具体包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：精密称取氨基酸对照品：门冬氨酸、谷氨酸、羟脯氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及盐酸赖氨酸，加浓度0.1mol/L盐酸溶液配成对照品溶液，具体配制关系如下：
| 氨基酸 | 三字代码 | 称样量 | 稀释倍数 |
| 门冬氨酸 | Asp | 10～30mg | 500 |
| 苏氨酸 | Thr | 10～30mg | 2000 |
| 丝氨酸 | Ser | 10～30mg | 2000 |
| 谷氨酸 | Glu | 10～30mg | 200 |
| 甘氨酸 | Gly | 10～30mg | 200 |
| 丙氨酸 | Ala | 10～30mg | 500 |
| 缬氨酸 | Val | 10～30mg | 2000 |
| 蛋氨酸 | Met | 10～30mg | 4000 |
| 异亮氨酸 | Ile | 10～30mg | 2000 |
| 亮氨酸 | Leu | 10～30mg | 500 |
| 酪氨酸 | Tyr | 10～30mg | 2000 |
| 苯丙氨酸 | Phe | 10～30mg | 2000 |
| 赖氨酸 | Lys | 10～30mg | 500 |
| 组氨酸 | His | 10～30mg | 2000 |
| 精氨酸 | Arg | 10～30mg | 500 |
| L-羟脯氨酸 | Hypro | 10～30mg | 500 |
| 脯氨酸 | Pro | 10～30mg | 500 |
(2)供试品溶液的制备：精密称定胶囊内容物人工虎骨粉0.2g，置耐压管中，精密加入6mL浓度为6mol/L的盐酸溶液，在110℃水解24小时，冷却至室温，氮吹干燥，精密加入0.1N氢氧化钠溶液20mL，以2500转/分钟，离心5min；然后精密量取5mL上清液，并用0.1N盐酸溶液稀释并定容至刻度；精密量取5mL置于10mL容量瓶中，用0.1N的盐酸溶液稀释并定容至刻度，滤过，制得供试品溶液；
(3)对照品溶液及供试品溶液的衍生：分别精密量取制得的对照品溶液及供试品溶液各4mL，分别置于20mL具塞试管中，并均加入0.1mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液2mL、1mol/L三乙胺乙腈溶液1mL，摇匀，室温下反应1小时后，加入8mL正己烷萃取；静置10分钟，取下层溶液并用0.45um有机滤膜过滤，取滤液，得到衍生后的对照品溶液和衍生后的供试品溶液；
(4)测定：分别精密量取上述衍生后的对照品溶液及供试品溶液各2μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；以外标法计算样品中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量；
液相色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Shim-pack VP-ODS4.6mm×250mm；以0.1mol/L醋酸钠缓冲溶液为流动相A，以甲醇：乙腈：水＝20:60:20的混合液为流动相B；检测波长为254nm，柱温为35℃，进样体积为2μL，洗脱条件如下：
所述流动相A的0.1mol/L醋酸钠缓冲溶液在使用前用用冰醋酸调节pH值为6.3±0.05。
步骤1)中：c.采用传统水解、自动在线衍生，使用全自动氨基酸分析仪测定金天格胶囊中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量，具体包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：精密称取L-羟脯氨酸、脯氨酸，门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸对照品适量，加0.02mol/L盐酸溶液配成对照品溶液，具体配制关系如下：
| 氨基酸 | 三字代码 | 称样量 | 稀释倍数 |
| 门冬氨酸 | Asp | 10～30mg | 2500 |
| 苏氨酸 | Thr | 10～30mg | 10000 |
| 丝氨酸 | Ser | 10～30mg | 10000 |
| 谷氨酸 | Glu | 10～30mg | 1000 |
| 甘氨酸 | Gly | 10～30mg | 1000 |
| 丙氨酸 | Ala | 10～30mg | 2500 |
| 缬氨酸 | Val | 10～30mg | 10000 |
| 蛋氨酸 | Met | 10～30mg | 20000 |
| 异亮氨酸 | Ile | 10～30mg | 10000 |
| 亮氨酸 | Leu | 10～30mg | 2500 |
| 酪氨酸 | Tyr | 10～30mg | 10000 |
| 苯丙氨酸 | Phe | 10～30mg | 10000 |
| 赖氨酸 | Lys | 10～30mg | 2500 |
| 组氨酸 | His | 10～30mg | 10000 |
| 精氨酸 | Arg | 10～30mg | 2500 |
| L-羟脯氨酸 | Hypro | 10～30mg | 2500 |
| 脯氨酸 | Pro | 10～30mg | 2500 |
(2)供试品溶液的制备：精密称定胶囊中内容物人工虎骨粉0.2g，置耐压管中，精密加入6mol/L的盐酸溶液10mL，称定重量，置110℃水解24小时，放冷至室温，用6mol/L的盐酸溶液补足减失的重量，加入6mol/L的氢氧化钠溶液10mL中和，并转移至100mL容量瓶中，用0.02mol/L的盐酸溶液稀释并定容至刻度；精密量取5mL，置25mL容量瓶中，用0.02mol/L的盐酸溶液稀释并定容至刻度，滤过，制得供试品溶液；
(3)总氨基酸的测定：分别精密量取上述对照品溶液及供试品溶液各20μl，分别注入氨基酸分析仪，测得所述健骨药物每粒胶囊中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量。
步骤1)中：d.采用微波水解、PITC手动衍生，用高效液相色谱法测定金天格胶囊中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：精密称取氨基酸对照品：门冬氨酸、谷氨酸、羟脯氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、盐酸赖氨酸，加0.1mol/L盐酸溶液配成对照品溶液，具体配制关系如下：
| 氨基酸 | 三字代码 | 称样量 | 稀释倍数 |
| 门冬氨酸 | Asp | 10～30mg | 500 |
| 苏氨酸 | Thr | 10～30mg | 2000 |
| 丝氨酸 | Ser | 10～30mg | 2000 |
| 谷氨酸 | Glu | 10～30mg | 200 |
| 甘氨酸 | Gly | 10～30mg | 200 |
| 丙氨酸 | Ala | 10～30mg | 500 |
| 缬氨酸 | Val | 10～30mg | 2000 |
| 蛋氨酸 | Met | 10～30mg | 4000 |
| 异亮氨酸 | Ile | 10～30mg | 2000 |
| 亮氨酸 | Leu | 10～30mg | 500 |
| 酪氨酸 | Tyr | 10～30mg | 2000 |
| 苯丙氨酸 | Phe | 10～30mg | 2000 |
| 赖氨酸 | Lys | 10～30mg | 500 |
| 组氨酸 | His | 10～30mg | 2000 |
| 精氨酸 | Arg | 10～30mg | 500 |
| L-羟脯氨酸 | Hypro | 10～30mg | 500 |
| 脯氨酸 | Pro | 10～30mg | 500 |
(2)供试品溶液的制备：精密称定胶囊内容物人工虎骨粉0.2g，置高通量微波消解管中，精密加入6mol/L的盐酸溶液6mL，称定重量，置微波消解仪内于180℃水解15min，放冷至室温，氮吹干燥，精密加入0.1N氢氧化钠溶液20mL，以2500转/分钟，离心5min；精密量取上清液5mL，用0.1N盐酸溶液稀释并定容至刻度；精密量取5mL，置10mL容量瓶中，用0.02N的盐酸溶液稀释并定容至刻度，滤过，制得供试品溶液；
(3)对照品溶液及供试品溶液的衍生：分别精密量取上述对照品溶液及供试品溶液各4mL，分别置于20mL具塞试管中，并均加入0.1mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液2mL，1mol/L三乙胺乙腈溶液1mL，摇匀，室温下反应1小时后，加入8ml正己烷萃取；静置10分钟，取下层溶液用0.45um有机滤膜过滤，取续滤液，得到衍生后的对照品溶液和衍生后的供试品溶液；
(4)测定：分别精密量取上述衍生后的对照品溶液及供试品溶液各2μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；以外标法计算样品中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量；
液相色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Shim-pack VP-ODS4.6mm×250mm；以0.1mol/L醋酸钠缓冲溶液为流动相A，以甲醇：乙腈：水＝20:60:20的混合液为流动相B；检测波长为254nm，柱温为35℃，进样体积为2μL，洗脱条件如下：
所述流动相A的0.1mol/L醋酸钠缓冲溶液在使用前用用冰醋酸调节pH值为6.3±0.05。
步骤2)所述采用原子吸收分光光度法测定每粒胶囊中总钙含量，具体包括以下步骤：
(1)标准曲线的制备：选取100μg/ml钙单元素标准溶液，精密量取0、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL，分别置于50mL量瓶中，并加氧化镧试液2mL，加超纯水稀释并定容至刻度，摇匀，即得；
(2)供试品溶液的制备：精密称定本品内容物人工虎骨粉0.2g，置高通量微波消解管中加硝酸5mL、过氧化氢1mL，于180℃消解15min，用水转移并定容至100mL容量瓶中；精密量取1mL置于50mL量瓶中，加氧化镧试液2mL，加超纯水稀释并定容至刻度，摇匀，即得；
以相同方法制备试样空白对照品溶液；
(3)测定：取空白对照品溶液及供试品溶液，照原子吸收分光光度法，在422.7nm波长处测定吸光度，计算得到健骨药物每粒胶囊中总钙含量。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明公开的健骨药物质量检测方法，是克服现有技术的不足，提高健骨药物的质量控制标准，建立采用微波水解、自动在线衍生，使用全自动氨基酸分析仪或者采用传统水解、PITC衍生法，使用高效液相色谱法测定制剂中总氨基酸的含量测定方法，增加了采用原子吸收分光光度法测定样品中钙的含量测定方法，保证了本制剂较高的质量标准水平。本发明建立了健骨药物中总氨基酸及钙的含量测定方法，测量方法精准，取样量加大，可操作性强，误差小，操作时间为1天，效率较高，且经过多次重复试验，确认方法简便，结果准确，可作为健骨药物质量控制和考察工艺的稳定性的指标。
附图说明
图1为氨基酸分析仪检测氨基酸分析色谱图
图2高效液相法分析色谱图
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
取人工虎骨粉324g、辅料76g，制成健骨药物金天格胶囊1000粒。每粒重0.4g，该药物的质量控制方法包括下列步骤：
(1)用全自动氨基酸分析仪测定健骨药物金天格胶囊中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量；
a对照品溶液的制备：精密称取L-羟脯氨酸、脯氨酸，门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸对照品适量，加0.02mol/L盐酸溶液配置成相应浓度的对照品溶液；对照品溶液配制关系如下：
| 氨基酸 | 三字代码 | 称样量 | 稀释倍数 |
| 门冬氨酸 | Asp | 10～30mg | 2500 |
| 苏氨酸 | Thr | 10～30mg | 10000 |
| 丝氨酸 | Ser | 10～30mg | 10000 |
| 谷氨酸 | Glu | 10～30mg | 1000 |
| 甘氨酸 | Gly | 10～30mg | 1000 |
| 丙氨酸 | Ala | 10～30mg | 2500 |
| 缬氨酸 | Val | 10～30mg | 10000 |
| 蛋氨酸 | Met | 10～30mg | 20000 |
| 异亮氨酸 | Ile | 10～30mg | 10000 |
| 亮氨酸 | Leu | 10～30mg | 2500 |
| 酪氨酸 | Tyr | 10～30mg | 10000 |
| 苯丙氨酸 | Phe | 10～30mg | 10000 |
| 赖氨酸 | Lys | 10～30mg | 2500 |
| 组氨酸 | His | 10～30mg | 10000 |
| 精氨酸 | Arg | 10～30mg | 2500 |
| 羟脯氨酸 | Hypro | 10～30mg | 2500 |
| 脯氨酸 | Pro | 10～30mg | 2500 |
b供试品溶液的制备：取本品内容物约相当于人工虎骨粉细粉0.2g，精密称定，置高通量微波消解管中，精密加入6mol/L的盐酸溶液10ml，称定重量，置适宜的微波消解仪内于180℃水解15min(按仪器规定的消解程序操作)，放冷至室温，用6mol/L的盐酸溶液补足减失的重量，加入6mol/L的氢氧化钠溶液10ml中和，并转移至100ml容量瓶中，用0.02mol/L的盐酸溶液稀释并定容至刻度；精密量取5ml，置25ml容量瓶中，用0.02mol/L的盐酸溶液稀释并定容至刻度，滤过，即得。
c总氨基酸的测定：分别精密量取上述对照品溶液及供试品溶液各20μl，分别注入氨基酸分析仪，测定，即得；
d每粒含总氨基酸不少于65mg。
(2)原子吸收分光光度法测定金天格胶囊中总钙含量：
a标准曲线的制备：取钙单元素标准溶液(100μg/ml)，精密量取0、1、2、3、4、5ml，分别置50ml量瓶，加氧化镧试液2ml，加超纯水稀释并定容至刻度，摇匀，即得；
b供试品溶液的制备：取本品内容物约相当于人工虎骨粉0.1g，精密称定，置高通量微波消解管中加硝酸5ml、过氧化氢1ml，于180℃消解15min，用水转移并定容至100ml容量瓶中；精密量取1ml，置50ml量瓶中，加氧化镧试液2ml，加超纯水稀释并定容至刻度，摇匀，即得；同法制备试样空白溶液。
c测定法：取对照品溶液及供试品溶液，照原子吸收(火焰法)分光光度法(中国药典2010版附录V D)，在422.7nm波长处测定吸光度，计算，即得。
d每粒含钙以(Ca)计不少于55mg。
实施例2
取人工虎骨粉324g、辅料76g，制成金天格胶囊1000粒。每粒重0.4g，该药物的质量控制方法包括下列步骤：
(1)用高效液相色谱法测定金天格胶囊中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量；
a色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Shim-pack VP-ODS4.6mm×250mm)；以0.1mol/L醋酸钠缓冲溶液(用冰醋酸调节pH值为6.3±0.05)为流动相A，甲醇-乙腈-水(20:60:20)为流动相B；照下表进行梯度洗脱：
检测波长为254nm，柱温为35℃，进样体积为2μl。
b对照品溶液的制备：精密称取以下氨基酸对照品：门冬氨酸、谷氨酸、羟脯氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、盐酸赖氨酸，加0.1mol/L盐酸溶液适量制成相应的对照品溶液，对照品溶液配制关系如下：。
| 氨基酸 | 三字代码 | 称样量 | 稀释倍数 |
| 门冬氨酸 | Asp | 10～30mg | 500 |
| 苏氨酸 | Thr | 10～30mg | 2000 |
| 丝氨酸 | Ser | 10～30mg | 2000 |
| 谷氨酸 | Glu | 10～30mg | 200 |
| 甘氨酸 | Gly | 10～30mg | 200 |
| 丙氨酸 | Ala | 10～30mg | 500 |
| 缬氨酸 | Val | 10～30mg | 2000 |
| 蛋氨酸 | Met | 10～30mg | 4000 |
| 异亮氨酸 | Ile | 10～30mg | 2000 |
| 亮氨酸 | Leu | 10～30mg | 500 |
| 酪氨酸 | Tyr | 10～30mg | 2000 |
| 苯丙氨酸 | Phe | 10～30mg | 2000 |
| 赖氨酸 | Lys | 10～30mg | 500 |
| 组氨酸 | His | 10～30mg | 2000 |
| 精氨酸 | Arg | 10～30mg | 500 |
| L-羟脯氨酸 | Hypro | 10～30mg | 500 |
| 脯氨酸 | Pro | 10～30mg | 500 |
c供试品溶液的制备：取本品内容物约相当于人工虎骨粉0.20g，精密称定，置耐压管中，精密加入6mol/L的盐酸溶液6ml，在110℃水解24小时，放冷至室温，氮吹干燥，精密加入0.1N氢氧化钠溶液20ml使溶解，离心5min(2500转/min)，精密量取上清液5ml用0.1N盐酸溶液稀释并定容至刻度；精密量取5ml，置10ml容量瓶中，用0.1N的盐酸溶液稀释并定容至刻度，滤过，即得。
d对照品溶液及供试品溶液的衍生：分别精密量取上述对照品溶液及供试品溶液各4ml，分置20ml具塞试管中；加入0.1mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液2ml，1mol/L三乙胺乙腈溶液1ml，摇匀，室温下反应1小时后，加入8ml正己烷萃取；静置10分钟，取下层溶液用0.45um有机滤膜过滤，取续滤液，即得。
e测定法：分别精密量取上述衍生后的对照品溶液及供试品溶液各2μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；以外标法计算样品中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量。
f每粒含总氨基酸不少于65mg。
(2)原子吸收分光光度法测定金天格胶囊中总钙含量：
a标准曲线的制备：取钙单元素标准溶液(100μg/ml)，精密量取0、1、2、3、4、5ml，分别置50ml量瓶，加氧化镧试液2ml，加超纯水稀释并定容至刻度，摇匀，即得；
b供试品溶液的制备：取本品内容物约相当于人工虎骨粉0.1g，精密称定，置高通量微波消解管中加硝酸5ml、过氧化氢1ml，于180℃消解15min，用水转移并定容至100ml容量瓶中；精密量取1ml，置50ml量瓶中，加氧化镧试液2ml，加超纯水稀释并定容至刻度，摇匀，即得；同法制备试样空白溶液。
c测定法：取对照品溶液及供试品溶液，照原子吸收(火焰法)分光光度法(中国药典2010版附录V D)，在422.7nm波长处测定吸光度，计算，即得。
d每粒含钙以(Ca)计不少于55mg。
实施例3
取人工虎骨粉324g、辅料76g，制成金天格胶囊1000粒。每粒重0.4g，该药物的质量控制方法包括下列步骤：
(3)采用传统水解、柱后自动在线衍生，使用全自动氨基酸分析仪测定金天格胶囊中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量；
a对照品溶液的制备：精密称取L-羟脯氨酸、脯氨酸，门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸对照品适量，加0.02mol/L盐酸溶液配置成相应浓度的对照品溶液，对照品溶液配制关系同实施例1。
b供试品溶液的制备：取本品内容物约相当于人工虎骨粉0.20g，精密称定，置耐压管中，精密加入6mol/L的盐酸溶液10ml，称定重量，置110℃水解24小时，放冷至室温，用6mol/L的盐酸溶液补足减失的重量，加入6mol/L的氢氧化钠溶液10ml中和，并转移至100ml容量瓶中，用0.02mol/L的盐酸溶液稀释并定容至刻度；精密量取5ml，置25ml容量瓶中，用0.02mol/L的盐酸溶液稀释并定容至刻度，滤过，即得。
c总氨基酸的测定：分别精密量取上述对照品溶液及供试品溶液各20μl，分别注入氨基酸分析仪，测定，即得；
d每粒含总氨基酸不少于65mg。
实施例4
取人工虎骨粉324g、辅料76g，制成金天格胶囊1000粒。每粒重0.4g，该药物的质量控制方法包括下列步骤：
(1)用高效液相色谱法测定金天格胶囊中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量；
a色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Shim-pack VP-ODS4.6mm×250mm)；以0.1mol/L醋酸钠缓冲溶液(用冰醋酸调节pH值为6.3±0.05)为流动相A，甲醇-乙腈-水(20:60:20)为流动相B；照下表进行梯度洗脱：
检测波长为254nm，柱温为35℃，进样体积为2μl。
b对照品溶液的制备：精密称取以下氨基酸对照品：门冬氨酸、谷氨酸、羟脯氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、盐酸赖氨酸，加0.1mol/L盐酸溶液适量制成相应的对照品溶液，对照品溶液配制关系同实施例2。
c供试品溶液的制备：取本品内容物约相当于人工虎骨粉细粉0.2g，精密称定，置高通量微波消解管中，精密加入6mol/L的盐酸溶液6ml，称定重量，置适宜的微波消解仪内于180℃水解15min(按仪器规定的消解程序操作)，放冷至室温，氮吹干燥，精密加入0.1N氢氧化钠溶液20ml使溶解，离心5min(2500转/min)，精密量取上清液5ml用0.1N盐酸溶液稀释并定容至刻度；精密量取5ml，置10ml容量瓶中，用0.02N的盐酸溶液稀释并定容至刻度，滤过，即得。
d对照品溶液及供试品溶液的衍生：分别精密量取上述对照品溶液及供试品溶液各4ml，分置20ml具塞试管中；加入0.1mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液2ml，1mol/L三乙胺乙腈溶液1ml，摇匀，室温下反应1小时后，加入8ml正己烷萃取；静置10分钟，取下层溶液用0.45um有机滤膜过滤，取续滤液，即得。
e测定法：分别精密量取上述衍生后的对照品溶液及供试品溶液各2μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；以外标法计算样品中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量。
f每粒含总氨基酸不少于65mg。
由上所述，原方法可操作性差，误差大，效率低，操作时间为2天，专属性差。通过图1和2，可以看出本发明的实施例1-4测量方法精准，取样量加大，可操作性强，专属性强，重现性和稳定性较好，误差小，操作时间为1天，效率较高，且该2个实施例方法也经陕西省食品药品检验所检验，方法稳定可行。
综上所述，本发明克服现有技术的不足，提高健骨药物金天格胶囊的质量控制标准，建立采用微波水解、自动在线衍生，使用全自动氨基酸分析仪或者采用传统水解、PITC衍生法，使用高效液相色谱法测定制剂中总氨基酸的含量测定方法，增加了采用原子吸收分光光度法测定样品中钙的含量测定方法，保证了质量检测方法的准确性和先进性，能够有效的控制金天格胶囊的产品质量。
Claims (3)
1.一种健骨药物的检测方法，其特征在于，该健骨药物由人工虎骨粉和辅料制成胶囊，其质量检测方法包括以下测定步骤：
1)将健骨药物水解后，测定样品中总氨基酸含量，具体选择以下任意一种测定方法：
a.采用微波水解、自动在线衍生，使用全自动氨基酸分析仪测定每粒胶囊中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量，具体包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：精密称取氨基酸对照品：L-羟脯氨酸、脯氨酸，门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及赖氨酸，加浓度为0.02mol/L盐酸溶液配成对照品溶液，具体配制关系如下：
(2)供试品溶液的制备：精密称定胶囊中的内容物人工虎骨粉0.2g，置高通量微波消解管中，精密加入10mL浓度为6mol/L的盐酸溶液，称定重量，置微波消解仪内于180℃水解15min，放冷至室温，用6mol/L的盐酸溶液补足减失的重量，加入10mL浓度为6mol/L的氢氧化钠溶液中和，并转移至100mL容量瓶中，用浓度为0.02mol/L的盐酸溶液稀释并定容至刻度；精密量取5mL置于25mL容量瓶中，用浓度为0.02mol/L的盐酸溶液稀释并定容至刻度，滤过，制得供试品溶液；
(3)总氨基酸的测定：分别精密量取制备的对照品溶液及供试品溶液各20μL，并分别注入氨基酸分析仪，测得所述健骨药物每粒胶囊中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量；
b.采用传统水解、PITC衍生法，用高效液相色谱法测定每粒胶囊中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量，具体包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：精密称取氨基酸对照品：门冬氨酸、谷氨酸、羟脯氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及盐酸赖氨酸，加浓度0.1mol/L盐酸溶液配成对照品溶液，具体配制关系如下：
(2)供试品溶液的制备：精密称定胶囊内容物人工虎骨粉0.2g，置耐压管中，精密加入6mL浓度为6mol/L的盐酸溶液，在110℃水解24小时，冷却至室温，氮吹干燥，精密加入0.1N氢氧化钠溶液20mL，以2500转/分钟，离心5min；然后精密量取5mL上清液，并用0.1N盐酸溶液稀释并定容至刻度；精密量取5mL置于10mL容量瓶中，用0.1N的盐酸溶液稀释并定容至刻度，滤过，制得供试品溶液；
(3)对照品溶液及供试品溶液的衍生：分别精密量取制得的对照品溶液及供试品溶液各4mL，分别置于20mL具塞试管中，并均加入0.1mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液2mL、1mol/L三乙胺乙腈溶液1mL，摇匀，室温下反应1小时后，加入8mL正己烷萃取；静置10分钟，取下层溶液并用0.45um有机滤膜过滤，取滤液，得到衍生后的对照品溶液和衍生后的供试品溶液；
(4)测定：分别精密量取上述衍生后的对照品溶液及供试品溶液各2μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；以外标法计算样品中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量；
液相色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Shim-packVP-ODS4.6mm×250mm；以0.1mol/L醋酸钠缓冲溶液为流动相A，以甲醇：乙腈：水＝20:60:20的混合液为流动相B；检测波长为254nm，柱温为35℃，进样体积为2μL，洗脱条件如下：
c.采用传统水解、自动在线衍生，使用全自动氨基酸分析仪测定每粒胶囊中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量，具体包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：精密称取L-羟脯氨酸、脯氨酸，门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸对照品适量，加0.02mol/L盐酸溶液配成对照品溶液，具体配制关系如下：
(2)供试品溶液的制备：精密称定胶囊中内容物人工虎骨粉0.2g，置耐压管中，精密加入6mol/L的盐酸溶液10mL，称定重量，置110℃水解24小时，放冷至室温，用6mol/L的盐酸溶液补足减失的重量，加入6mol/L的氢氧化钠溶液10mL中和，并转移至100mL容量瓶中，用0.02mol/L的盐酸溶液稀释并定容至刻度；精密量取5mL，置25mL容量瓶中，用0.02mol/L的盐酸溶液稀释并定容至刻度，滤过，制得供试品溶液；
(3)总氨基酸的测定：分别精密量取上述对照品溶液及供试品溶液各20μl，分别注入氨基酸分析仪，测得所述健骨药物每粒胶囊中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量；
d.采用微波水解、PITC手动衍生，用高效液相色谱法测定每粒胶囊中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：精密称取氨基酸对照品：门冬氨酸、谷氨酸、羟脯氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、盐酸赖氨酸，加0.1mol/L盐酸溶液配成对照品溶液，具体配制关系如下：
(2)供试品溶液的制备：精密称定胶囊内容物人工虎骨粉0.2g，置高通量微波消解管中，精密加入6mol/L的盐酸溶液6mL，称定重量，置微波消解仪内于180℃水解15min，放冷至室温，氮吹干燥，精密加入0.1N氢氧化钠溶液20mL，以2500转/分钟，离心5min；精密量取上清液5mL，用0.1N盐酸溶液稀释并定容至刻度；精密量取5mL，置10mL容量瓶中，用0.02N的盐酸溶液稀释并定容至刻度，滤过，制得供试品溶液；
(3)对照品溶液及供试品溶液的衍生：分别精密量取上述对照品溶液及供试品溶液各4mL，分别置于20mL具塞试管中，并均加入0.1mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液2mL，1mol/L三乙胺乙腈溶液1mL，摇匀，室温下反应1小时后，加入8ml正己烷萃取；静置10分钟，取下层溶液用0.45um有机滤膜过滤，取续滤液，得到衍生后的对照品溶液和衍生后的供试品溶液；
(4)测定：分别精密量取上述衍生后的对照品溶液及供试品溶液各2μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；以外标法计算样品中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量；
液相色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Shim-pack VP-ODS4.6mm×250mm；以0.1mol/L醋酸钠缓冲溶液为流动相A，以甲醇：乙腈：水＝20:60:20的混合液为流动相B；检测波长为254nm，柱温为35℃，进样体积为2μL；
2)采用原子吸收分光光度法测定该健骨药物中总钙含量，具体包括以下步骤：
(1)标准曲线的制备：选取100μg/mL钙单元素标准溶液，精密量取0、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL，分别置于50mL量瓶中，并加氧化镧试液2mL，加超纯水稀释并定容至刻度，摇匀，即得；
(2)供试品溶液的制备：精密称定本品内容物人工虎骨粉0.2g，置高通量微波消解管中加硝酸5mL、过氧化氢1mL，于180℃消解15min，用水转移并定容至100mL容量瓶中；精密量取1mL置于50mL量瓶中，加氧化镧试液2mL，加超纯水稀释并定容至刻度，摇匀，即得；
以相同方法制备试样空白对照品溶液；
(3)测定：取空白对照品溶液及供试品溶液，照原子吸收分光光度法，在422.7nm波长处测定吸光度，计算得到健骨药物每粒胶囊中总钙含量。
2.根据权利要求1所述的健骨药物的检测方法，其特征在于：采用传统水解、PITC衍生法，用高效液相色谱法测定健骨药物每粒胶囊中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量时，流动相A的0.1mol/L醋酸钠缓冲溶液在使用前用用冰醋酸调节pH值为6.3±0.05。
3.根据权利要求1所述的健骨药物的检测方法，其特征在于：采用微波水解、PITC手动衍生，用高效液相色谱法测定每粒胶囊中包含羟脯氨酸的总氨基酸含量时，流动相A的0.1mol/L醋酸钠缓冲溶液在使用前用用冰醋酸调节pH值为6.3±0.05。
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