CN117031043B - 人工虎骨粉检测标志物鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中药检测技术领域，具体涉及一种人工虎骨粉检测标志物鉴定方法。本发明提供了人工虎骨粉的5条特征多肽，序列为SEQ ID NO.1‑5。本发明还提供了对这5条特征多肽的检测方法，包括人工虎骨粉的特征多肽的超声提取，提取液利用同位素稀释质谱法进行定量分析。具有操作简单、快速、灵敏度高、定性定量准确的优点，能够有效用于人工虎骨粉的质量控制。

Description

人工虎骨粉检测标志物鉴定方法
技术领域
本发明属于中药检测技术领域，具体涉及一种人工虎骨粉检测标志物鉴定方法。
背景技术
天然虎骨来源于脊椎动物猫科虎的骨骼。虎骨作为一种传统中药，具有独特的药用价值，长春中医药大学有学者通过对古籍进行整理，从8万多个传统方剂中整理出含虎骨的药用方剂360个，总结了虎骨的主要功效约为258种，主要包括固肾益精、强筋健骨、益智延年、舒筋活血、通血脉、强筋健骨等功效。
虎的繁殖能力较弱、捕捉也很困难，属于国际重点保护的濒危野生动物。虎骨作为一种濒危动物中药，现已全面禁止了虎骨的贸易并取消了虎骨的用药标准，禁止使用虎骨及虎骨组成的制剂。于是，研究人员采用仿生研究方法，首先研究了天然虎骨的全部化学成分，根据测得的结果，再选用其他动物的骨骼进行对照分析研究，最后通过合理配比，制定出了与天然虎骨所含成分基本相似的人工虎骨的配方。
人工虎骨与虎骨的药理药效指标无明显差异，理化、生化性质及氮含量、运动黏度、旋光度等也都十分接近，在疗效上通过中国中医科学院骨伤科研究所等单位开展的660例临床双盲研究，表明人工虎骨具有和天然虎骨相同的功效。
人工虎骨粉主要由鹿骨、羊骨、猪骨等多种动物骨骼提取物组成，其中，鹿骨在《名医别录》、《唐本草》、《本草纲目》等多本中药古籍中均有记载，能够补虚赢，强筋骨，除风湿，止泻痢，常用于虚劳骨弱；风湿痹痛。而现代相关研究也表明，鹿骨胶原蛋白对去卵巢所致的骨质疏松大鼠有一定的治疗作用[1-2]。鹿骨粉具有“治疮毒，生肌收口”的功效，在治疗肛瘘术后创面愈合方面安全有效，适合在临床推广使用[3]。
关于人工虎骨粉与天然虎骨对比的资料，也只是公开了一些实验证明人工虎骨与天然虎骨匹配度非常高的综述性材料，这些资料只是公布了最后的研究结果，看不到任何关于人工虎骨和天然虎骨对比的具体指纹图谱的资料。因此，人工虎骨粉的质量成为影响药物疗效的关键因素，可以根据药物的成分特征，来检测药物的质量，保证药物质量的可靠性和稳定性。
由于人工虎骨粉物质基础的研究不够深入，所以目前现行的质量控制方法还存在诸多问题。人工虎骨粉中主要的有机成分为蛋白质和部分游离多肽，因此人工虎骨粉药效物质基础的研究主要围绕蛋白质和多肽展开。可以通过人工虎骨粉中的可靠、特征的多肽序列作为特征多肽，进行定量方法研究，以完善人工虎骨粉的质量控制体系，使药物在生产过程中的质量能够得到进一步保证。进行质量控制的多肽应为在马鹿和梅花鹿骨胶中相比于羊、猪骨胶中较为特征的多肽。
[1]牛放等. 鹿角脱盘胶原蛋白对去卵巢所致骨质疏松大鼠的治疗作用[J]. 中国现代应用药学. 2012,29(02).
[2]张鹤等. 鹿骨胶原蛋白对去卵巢所致骨质疏松大鼠的治疗作用[J]. 中药药理与临床. 2011,27(05).
[3]韩天奇. 鹿骨粉对肛瘘术后创面愈合的临床观察[D]. 长春中医药大学,2020年第02期.
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了人工虎骨粉的特征多肽SEQ ID NO.1-5，还提供了该特征多肽的检测方法，包括人工虎骨粉特征多肽的提取，采用同位素稀释质谱法对特征多肽进行定量分析。
一方面，本发明提供了一种评估人工虎骨粉质量的方法，所述的方法是通过对人工虎骨粉的标志物进行定量；所述的标志物为特征多肽SEQ ID NO.1-5。
具体地，所述的方法包括以下步骤：
（1）人工虎骨粉待测样品的制备；
（2）步骤（1）的待测样品通过LC MS/MS技术进行定量。
具体地，所述的步骤（1）的制备方法包括但不限于：溶剂超声提取，放冷，离心得上清，超滤得滤液。
进一步具体地，所述的超声温度为30-40 ℃。
优选地，所述的超声温度为35 ℃。
进一步具体地，所述的静置和离心在低温下进行。
优选地，所述的离心在4-10 ℃下进行。
进一步优选地，所述的离心在4 ℃下进行。
具体地，所述的步骤（2）LC MS/MS的色谱条件根据前述的特征多肽在色谱中的保留特性进行选择。
具体地，所述的LC MS/MS的色谱条件可以是：色谱柱为C18；流动相A选自甲酸、水中的至少一种，流动相B选自乙腈、乙醇、甲醇中的至少一种；流速为0.1-0.5 mL·min-1；柱温为25-35 ℃。
优选地，所述的色谱柱为luna Omega 1.6 um polar C18150×2.1 mm；流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈；流速为0.2 mL·min-1；柱温为30 ℃。
具体地，所述的流动相洗脱条件为：
具体地，所述的步骤（2）LC MS/MS检测方式可以是多反应监测。
具体地，所述的LC MS/MS的质谱条件可以是：纳米喷雾电离；正离子扫描；毛细管电压3200-3700 V；干燥气温度180-220 ℃；干燥气流速14-18 L /min；雾化气压力20-30psi；鞘气温度300-400 ℃；鞘气流速11-18 L /min；碎裂电压350-400 V；高压离子漏斗电压140-160 V；低压离子漏斗电压50-70 V。
优选地，所述的LC MS/MS的质谱条件为：毛细管电压3500 V；干燥气温度200 ℃；干燥气流速16 L /min；雾化气压力25 psi；鞘气温度350 ℃；鞘气流速11 L /min；碎裂电压380 V；高压离子漏斗电压150 V；低压离子漏斗电压60 V。
具体地，所述的特征多肽SEQ ID NO.1的m/z值为543.465/545.262，543.465/772.405；SEQ ID NO.2的m/z值为569.940/686.375，569.940/856.417；SEQ ID NO.3的m/z值为515.925/471.375，515.925/842.446；SEQ ID NO.4的m/z值为508.330/598.220，508.330/797.375；SEQ ID NO.5的m/z值为512.325/619.220，512.325/876.292。
本发明所取得的的技术效果：本发明提供了人工虎骨粉的5条特征多肽SEQ IDNO.1-5，作为评估人工虎骨粉质量的检测标志物，5条特征多肽的检出限为10.61 ng/L-119.94 ng/L，定量限为35.36 ng/L-399.80 ng/L，回收率为85.78%-105.5%。本发明的技术方案具有良好的线性范围，操作简单、快速、灵敏度高、定性定量准确，能够有效用于人工虎骨粉的质量控制。
附图说明
图1为混合对照品溶液总离子流图和多通道MRM色谱图，图中的a为SEQ ID NO.4；a*为标记SEQ ID NO.4；图中的b为SEQ ID NO.5；图中的b*为标记SEQ ID NO.5；图中的c为SEQ ID NO.3；图中的c*为标记SEQ ID NO.3；图中的d为SEQ ID NO.1；图中的d*为标记SEQID NO.1；图中的e为SEQ ID NO.2；图中的e*为标记SEQ ID NO.2。
图2为人工虎骨粉供试品溶液总离子流图和多通道MRM色谱，图中的a为SEQ IDNO.4；a*为标记SEQ ID NO.4；图中的b为SEQ ID NO.5；图中的b*为标记SEQ ID NO.5；图中的c为SEQ ID NO.3；图中的c*为标记SEQ ID NO.3；图中的d为SEQ ID NO.1；图中的d*为标记SEQ ID NO.1；图中的e为SEQ ID NO.2；图中的e*为标记SEQ ID NO.2。
图3为马鹿虎骨粉供试品溶液总离子流图和多通道MRM色谱，图中的a为SEQ IDNO.4；a*为标记SEQ ID NO.4；图中的b为SEQ ID NO.5；图中的b*为标记SEQ ID NO.5；图中的c为SEQ ID NO.3；图中的c*为标记SEQ ID NO.3；图中的d为SEQ ID NO.1；图中的d*为标记SEQ ID NO.1；图中的e为SEQ ID NO.2；图中的e*为标记SEQ ID NO.2。
图4为梅花鹿骨胶供试品溶液总离子流图和多通道MRM色谱，，图中的a为SEQ IDNO.4；a*为标记SEQ ID NO.4；图中的b为SEQ ID NO.5；图中的b*为标记SEQ ID NO.5；图中的c为SEQ ID NO.3；图中的c*为标记SEQ ID NO.3；图中的d为SEQ ID NO.1；图中的d*为标记SEQ ID NO.1；图中的e为SEQ ID NO.2；图中的e*为标记SEQ ID NO.2。
图5为猪骨胶供试品溶液总离子流图和多通道MRM色谱，图中的a*为标记SEQ IDNO.4；图中的b*为标记SEQ ID NO.5；图中的c*为标记SEQ ID NO.3；图中的d*为标记SEQ IDNO.1；图中的e*为标记SEQ ID NO.2。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 人工虎骨粉特征多肽的确证与定量分析
本发明提供并人工合成了工虎骨粉中5条多肽（SEQ ID NO.1-5）见表1，采用LC-MS/MS验证其在人工虎骨粉中的存在与否情况并结合同位素稀释质谱法进行定量分析。质谱多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）技术是一种基于已知或假定的反应离子信息，有针对性地选择数据进行质谱信号采集，对符合规则的离子进行信号记录，去除不符合规则离子信号的干扰，通过对数据的统计分析从而获取质谱定量信息的质谱技术。对于MRM技术而言，关键在于首先要能够检测到具有特异性的母离子，然后只将选定的特异性母离子进行碰撞诱导(collision-induced)，最后去除其他子离子的干扰，只对选定的特异子离子进行质谱信号的采集。
表1
注：该字母后的*表示该字母代表氨基酸被同位素标记。
1.1实验方法
1.1.1色谱条件
色谱条件：色谱柱为luna Omega 1.6 μm polar C18（150×2.1 mm，1.6 μm）；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B)；梯度洗脱程序见表2；流速为0.2 mL·min-1；柱温为30℃；进样体积为10 μL。
表2 梯度洗脱程序
1.1.2质谱条件
质谱条件：Thermo Scientific TSQ Endura三重四极杆质谱仪；质谱条件 离子源：纳米喷雾电离（NSI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；毛细管电压：3500 V；干燥气温度：200 ℃；干燥气流速：16 L /min；雾化气压力：172.4 kPa（25 psi）；鞘气温度：350 ℃；鞘气流速：11 L /min；碎裂电压：380 V；高压离子漏斗电压：150 V；低压离子漏斗电压：60 V。5条多肽序列的母离子、子离子碎片及其质谱数据采集参数见表3。
表3 人工虎骨粉5条特征多肽及其标记多肽的质谱参数
1.1.3样品溶液制备
马鹿骨胶、梅花鹿骨胶、羊椎骨胶、猪骨胶，人工虎骨粉，均由陕西金花企业（集团）股份有限公司提供。
（1）对照品溶液的制备：分别精密称取多肽SEQ ID NO.1、多肽SEQ ID NO.2、多肽SEQ ID NO.3、多肽SEQ ID NO.4、多肽SEQ ID NO.5和人工合成标记多肽SEQ ID NO.1、标记多肽SEQ ID NO.2、标记多肽SEQ ID NO.3、标记多肽SEQ ID NO.4、标记多肽SEQ ID NO.5适量，分别加适量0.1%甲酸水溶解，制成多肽SEQ ID NO.1浓度为100.00 ug/mL、多肽SEQ IDNO.2浓度为110.67 ug/mL、多肽SEQ ID NO.3浓度为112.50 ug/mL、多肽SEQ ID NO.4浓度为118.50 ug/mL、多肽SEQ ID NO.5浓度为100.33 ug/mL，标记多肽SEQ ID NO.1浓度为115.50 ug/mL、标记多肽SEQ ID NO.2浓度为101.25 ug/mL、标记多肽SEQ ID NO.3浓度为97.33 ug/mL、标记多肽SEQ ID NO.4浓度为96.67 ug/mL、标记多肽SEQ ID NO.5浓度为93.00 ug/mL的对照品母液。
标记多肽混合溶液的制备：分别取上述标记多肽SEQ ID NO.1、标记多肽SEQ IDNO.2、标记多肽SEQ ID NO.3、标记多肽SEQ ID NO.4、标记多肽SEQ ID NO.5的对照品母液20 uL、250 uL、50 uL、50 uL、50 uL，再用0.1%甲酸水定容至5 mL量瓶中，混匀，即得。
非标记多肽混合溶液的制备：分别取上述非标记多肽SEQ ID NO.1、多肽SEQ IDNO.2、多肽SEQ ID NO.3、多肽SEQ ID NO.4、多肽SEQ ID NO.5的对照品母液20 uL、250 uL、50 uL、50 uL、50 uL，再用0.1%甲酸水定容至5 mL量瓶中，混匀，即得。
（2）人工虎骨粉供试品溶液制备：取人工虎骨粉（211116-1）约1000 mg，精密称定，置50 mL离心管中，精密加入0.1%甲酸水 17.90 mL，精密加入标记多肽混合溶液0.10 mL，超声处理（功率100 W，频率40 kHz，35℃）30 min，放冷，离心10 min（6000 r，4℃），取上清液500 uL，加入3KD超滤离心管内管中，离心15 min(14000 r，4℃)，取外管滤出液，即得。
（3）各物种骨胶供试品溶液制备：
分别取马鹿骨胶、梅花鹿骨胶、羊骨胶、猪骨胶粉末约200 mg，精密称定，置50 mL离心管中，，精密加入0.1%甲酸水 17.90 mL，精密加入标记多肽混合溶液0.10 mL，超声处理（功率100 W，频率40 kHz，35℃）30 min，放冷，离心10 min（6000 r，4℃），取上清液500uL，加入3KD超滤离心管内管中，离心15 min(14000 r，4℃),，取外管滤出液，即得。
1.1.4方法学考察
（1）专属性考察：取人工虎骨粉供试品溶液、对照品稀释溶液及种骨胶供试品溶液，分别按照“1.1.1”与“1.1.2”项下色谱条件与质谱条件进样分析，分别记录各样品的总离子流图和多通道MRM色谱图。
（2）线性关系考察：精密吸取一定量“1.1.3”项下非标记多肽混合溶液和标记多肽混合溶液，加入0.1%甲酸水稀释成系列梯度浓度的混合对照品溶液，按照“1.1.1”与“1.1.2”项下色谱条件与质谱条件进样分析，测定各峰峰面积。
（3）检测限、定量限
取混合对照品储备液，精密量取并逐步稀释，“1.1.1”与“1.1.2”项下色谱条件与质谱条件进样检测，按信噪比3:1（S/N=3）计算检测限，按信噪比10:1（S/N=10）计算定量限。
（4）仪器精密度考察：取同一人工虎骨粉供试品溶液，按照“1.1.1”与“1.1.2”项下色谱条件和质谱条件，连续进样6次测定各成分峰面积，计算RSD值。
（5）稳定性考察：取同一供试品溶液，于4℃冷藏，按照“1.1.1”与“1.1.2”项下色谱条件与质谱条件，分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h和24 h测定特征多肽在供试品中的浓度，计算RSD值。
（6）重复性考察：取同一批次人工虎骨粉，平行称取 6 份，并按照“1.1.3”中（2）方法分别进行供试品溶液的制备，按照“1.1.1”与“1.1.2”项下色谱条件与质谱条件，进样测定各样品中多肽的含量，计算平均值与RSD值。
（7）准确度考察：以五条多肽在人工虎骨粉中的含量为本底值，分别添加相当于其含量 0.5、1、1.5 倍的标准溶液开展加标实验，计算加标回收率和RSD值。
1.2实验结果
（1）专属性考察结果：混合对照品溶液、人工虎骨粉和马鹿骨胶、梅花鹿骨胶、猪骨胶和羊骨胶供试品的总离子流图和多通道MRM色谱图见图2-图5。
（2）线性关系、检测限、定量限考察结果：以对照品进样浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，计算回归方程，按信噪比3:1（S/N=3）计算检测限，按信噪比10:1（S/N=10）计算定量限，结果见表4。
（3）仪器精密度考察结果：6次进样多肽SEQ ID NO.1-5的峰面积RSD值分别为1.29%，1.27%，3.10%，2.54%，4.51%。
（4）稳定性考察结果：0 h、2 h、4 h、8 h、12 h和24 h测定的多肽SEQ ID NO.1-5含量RSD值分别为5.44%，3.18%，3.44%，7.07%，7.69%。
（5）重复性考察结果：测定的多肽SEQ ID NO.1-5含量平均值分别为22.63 ng/g，372.95 ng/g，22.49 ng/g，36.39 ng/g，6.86ng/g，RSD值分别为2.51%，5.98%，3.77%，7.31%，5.09%。
（6）准确度考察结果：五条特征多肽的加标回收率，结果见表5。
表4 五条特征多肽及其回归方程和线性范围
表5 五条特征多肽的加标回收率
1.3结果分析
通过专属性实验结果可知，五条特征多肽序列不仅稳定存在于人工虎骨粉（图2）样品中，而且主要来源于马鹿（图3）和梅花鹿（图4）的骨胶，在羊骨胶和猪骨胶中均未检测到（图5），因此，这五条多肽可以作为人工虎骨粉的特征多肽。通过液质联用技术对这五条多肽在人工虎骨中的含量进行测定并建立定量方法学可以对人工虎骨粉的质量控制方法进行优化。通过对该定量方法的方法学验证，该方法具有良好的精密度、稳定性、重复性和加标回收率，可以做为人工虎骨粉的质量控制方法。
1.4讨论
在前期研究中，在液质联用进行人工虎骨粉特征多肽分析时，经过多次进样发现，可能是受人工虎骨粉本身复杂体系的影响，这几条特征多肽的保留时间在不同时间点进样时并不是很稳定，经常会发生保留时间的漂移。因此，普通的定量方法由于对照品和样品需要不同时间进样，在比较不同图谱的时候，目标峰周围的杂质峰经常会对目标峰的指认造成干扰。而且本品中水溶性多肽在提取时会混入大量的大分子蛋白，后续往往需要进行复杂的除杂操作，过程中一定会造成目标多肽的损失，使得测量结果不准确。本发明通过用一种名为同位素稀释质谱法（isotope dilution mass spectrometry）的新方法来进行定量。同位素稀释质谱法是2015年公布的计量学名词，出自《计量学名词》第一版。即在试样中加入已知量的、与被测元素相同但同位素丰度不同的物质（称“稀释剂”），混合均匀达到平衡后，根据质谱测量标记多肽与目标多肽的比值，由此计算出被测目标多肽含量的方法。其原理主要是：同位素标记多肽和目标多肽具有相同的理化性质，因此，两者在色谱柱上保留性能完全相同，而且在复杂的前处理时，两者的损失程度也会完全一致，只是在质谱分析中，由于质量数的不同，会在质谱中区分开来。依据样品中目标多肽和标记多肽在复杂的前处理过程中具有相同保留率建立方程：
m标测/m标总=m测/m总；
即 C标测*V/m标总=C测*V/m总；
所以 C标测/m标总=C测/m总；
即 m总=C测*m标总/C标测。
其中m标测表示供试品溶液中测得的标记多肽的质量；m标总表示供试品制备过程中加入标记多肽总质量；m测表示供试品溶液中待测多肽的质量，m总表示样品中待测多肽的总质量；C标测表示供试品溶液中测得的标记多肽的浓度；C测表示供试品溶液中待测多肽的浓度；V表示供试品溶液的体积。
对比例
本发明还合成了人工虎骨粉中其他10条多肽（序列及质谱条件见表6），参照实施例1的方法对马鹿骨胶、梅花鹿骨胶、羊椎骨胶、猪骨胶，人工虎骨粉进行检测分析。结果表明其中6条多肽序列（SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9，SEQ IDNO.10，SEQ ID NO.11）不仅存在于人工虎骨粉样品、马鹿骨胶和梅花鹿的骨胶中，而且还存在于羊骨胶和猪骨胶中，不具有特征性。以上多肽通过定性分析确定其不具有较好的特异性，不需要进行定量分析。因此，以上对比例，没有必要进一步合成同位素标记的多肽进行定量分析方法学的建立；还有4条多肽序列（SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.13，SEQ ID NO.14，SEQ ID NO.15）因其含量低于检测限，无法实现在人工虎骨粉中进行定量检测，因此，以上对比例，也没有必要进一步合成同位素标记的多肽进行定量分析方法学的建立。
表6
表7
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Claims (4)

1.一种人工虎骨粉的特征多肽的检测方法，其特征在于，所述的方法是通过对人工虎骨粉的标志物进行定量；所述的标志物为特征多肽SEQ ID NO.1-5；
所述的方法包括以下步骤：
（1）人工虎骨粉待测样品的制备；
（2）步骤（1）的待测样品通过LC-MS/MS技术进行定量；
所述的步骤（1）的制备方法为：加入0.1%甲酸水溶液，加入同位素标记的多肽SEQ IDNO.1-5混合溶液，超声提取，放冷，离心，超滤得滤液；
步骤（2）所述的LC-MS/MS的色谱条件为：色谱柱为1.6 um polar C18 150×2.1 mm；流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B选自乙腈和甲醇中的一种；流速为0.1-0.5 mL·min-1；柱温为25-35 ℃；流动相洗脱条件为：
；
所述的LC-MS/MS的质谱条件为：多反应监测；纳米喷雾电离；正离子扫描；
所述的特征多肽SEQ ID NO.1的m/z值为543.465/545.262，543.465/772.405；SEQ IDNO.2的m/z值为569.940/686.375，569.940/856.417；SEQ ID NO.3的m/z值为515.925/471.375，515.925/842.446；SEQ ID NO.4的m/z值为508.330/598.220，508.330/797.375；SEQ ID NO.5的m/z值为512.325/619.220，512.325/876.292。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的超声温度为30-40 ℃；所述的离心在低温下进行。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的色谱柱为luna Omega 1.6 umpolar C18 150×2.1 mm ；流动相B为乙腈；流速为0.2 mL·min-1；柱温为30 ℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的LC-MS/MS的质谱条件为：毛细管电压3200-3700 V；干燥气温度180-220 ℃；干燥气流速14-18 L /min；雾化气压力20-30psi；鞘气温度300-400 ℃；鞘气流速11-18 L /min；碎裂电压350-400 V；高压离子漏斗电压140-160 V；低压离子漏斗电压50-70 V。
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