CN114032282A - 一种前列腺癌检测试剂及其在前列腺癌检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种前列腺癌检测试剂及其制备方法，检测试剂由以下试剂混合而成，试剂A：浓度为10mM的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度0.5～5％的SDS配制而成；试剂B：由0.01～10U/10μL糖胺酰酶和0.01～10U/10μL唾液酸酶混合配制而成，混合溶液pH值为4～9；试剂C：由8‑氨基芘‑1,3,6‑三磺酸溶于DMSO中配制而成，浓度为0.01mM～1M；试剂D：终止液。本发明通过检测试剂测定血清中糖组图谱，将峰值量化进行统计学分析，提供一种前列腺癌血清糖组图谱的模型的建立方法来检测前列腺癌。

Description

一种前列腺癌检测试剂及其在前列腺癌检测中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种前列腺癌的检测方法，具体涉及一种基于血清糖蛋白寡糖链检测(G-Test)图谱的前列腺癌的检测方法。
背景技术
前列腺癌是发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤，是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤。前列腺癌是一种进展特别缓慢的癌症，疾病早期阶段不易发现，患者临床主要表现为排尿费力、腰痛、尿急、尿频、尿痛等尿道症状，主要通过前列腺癌根治术和手术或者药物去势等治疗，早期前列腺癌可以治愈，晚期以保守治疗为主。
对于前列腺癌发生的病因，其与遗传、环境、食物、年龄有关，有家族性前列腺癌病史，发病率相对偏高，发病的年龄也会偏年轻。前列腺癌好发于年龄大于65岁以上的老年男人、生活方式不健康的人、直系亲属中有得过前列腺癌的人，饮食、肥胖等因素则容易诱发。
在流行病学上，前列腺癌10年前在我国发病率大概在0.005％～0.006％，最近10年在我国增长率比较快。过去前列腺癌在西方国家尤其在美国是一个高发病种，在美国男性发病率居第一位，死亡率第二位。前列腺癌在全球的发病率都在持续上升，2018年全球有近130万新发病例和35.9万死亡病例，男性恶性肿瘤发病率比死亡率高很多，且随着年龄增长，患前列腺癌的几率越大。
而目前临床上，针对前列腺癌患者的辅助诊断最重要的是前列腺特异抗原检测即PSA；但该方式对早期前列腺癌不敏感，发现时，基本都处于中晚期，预后性很差；另一种方式为穿刺，进行病理解剖；这两种方式，前者不敏感，后者创伤较大。
蛋白质的糖基化(Glycosylation)是一种最常见的蛋白翻译后修饰，是在糖基转移酶作用下将糖类转移至蛋白质和蛋白质上特殊的氨基酸残基形成糖苷键的过程。大多数的糖蛋白都是分泌蛋白，广泛存在于细胞膜、细胞间质、血浆以及粘液中。有些酶和激素是糖蛋白。糖蛋白具有多种生物功能。有些糖蛋白如原胶原是结构蛋白质。许多酶和激素(如黄体生成素、促甲状腺激素等)有糖蛋白结构，血液中的许多糖蛋白担负无机离子(Fe2+、Ca2+、Cu2+等)和激素等生物活性物质的运输，血液凝固(纤维蛋白原是糖蛋白)和抗体活性等生物功能。凝集素有凝集细胞的能力，糖链还可起稳定肽链的作用。糖蛋白的另一重要功能是直接或间接地参与细胞表面的种种识别现象。由于糖蛋白中糖链对于维持机体生物学功能的重要性，糖链的改变有助于阐明炎症、肿瘤细胞对周围组织侵袭及转移等异常生物行为学的分子机理。目前，己经在多种肿瘤中发现了N-糖链的改变。
糖链是重要的生物信息分子，在许多生理和病理过程中都发挥着独特作用。糖链结构非常复杂，具有微观不均一性，其分析和结构解析一直是糖生物学研究的瓶颈。目前糖链结构的分析方法发展迅速，主要包括(1)高效液相色谱法(HPLC)：分辨率高，检测速度快，重复性高，高效液相色谱柱可以反复使用，但是柱效会随着使用次数的增加而变低，且流动相有毒，设备操作需要受过严格培训的专业人才进行，且设备相对昂贵，溶剂需要严格纯化；(2)质谱法(MS)：质谱具有灵敏度高、可获得多种结构信息和适于分析混合物等优点，是糖链定性定量分析的一种理想手段。但是质谱仪器精密，设备操作复杂，且质谱仪价格昂贵，不适合临床上普及推广使用；(3)毛细管电泳法(CE)：毛细管电泳成本低、柱效高、灵敏度高、速度快、进样量少、操作简单，但是重复性不高，稳定性不如HPLC。
G-Test检测法(Glycan-Test)是基于DNA分析仪的毛细管微电泳技术(DSA-FACE)，将前列腺液样本中糖蛋白的N-糖链进行荧光标记后，用毛细管微电泳进行分离，通过测量荧光信号得到的N-寡糖链的含量即指纹图谱(简称G-Test图谱)。该检测技术具有灵敏度高、操作简单、微量(2μL血清)、重复性高、稳定性好、高通量(96-孔板)等其他糖链分析技术无法比拟的优点，适用于一般检验科室，可望用于临床推广使用。
发明内容
发明的目的在于提供一种前列腺癌监测试剂，通过该试剂测定血清中的糖组图谱，将峰值量化，进行统计学分析，从而提供一种前列腺癌的血清糖组图谱模型的建立方法。
本发明采用的技术方案如下：
一种前列腺癌监测试剂，由以下试剂组成：
试剂A：浓度为10mM的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度0.5～5％的SDS配制而成；
试剂B：由0.01～10U/10μL糖胺酰酶和0.01～10U/10μL唾液酸酶混合配制而成，混合溶液pH值为4～9；
试剂C：由8-氨基芘-1,3,6-三磺酸溶于DMSO中配制而成，浓度为0.01mM～1M；
试剂D：终止液。
优选地，所述试剂A、试剂B与试剂C的体积比为2：2：1。
一种前列腺癌检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一 寡糖链的制备
在经过灭活处理的2μL血清样品中加入4μL试剂A，进行变性，降温到室温后，加入4μL试剂B，孵育1～6h；
步骤二 寡糖链的标记
在步骤一得到的液体中加入2μL试剂C，进行荧光标记，然后加入150μL试剂D终止标记反应；
步骤三 寡糖链分离分析
取10μL步骤二处理后的液体，用分析仪进行糖链分离，得到图谱。
优选地，所述步骤一寡糖的制备中变性温度为不低于75℃加热，孵育温度为不低于25℃。
优选地，所述步骤二中荧光标记的温度为50～90℃。
一种组合物在制备前列腺癌监测试剂中的应用，所述组合物通过NA2/NA2F的比值来检测前列腺癌。
糖基化是指N-寡聚糖能通过上百种酶、转录因子、离子通道和蛋白之间复杂的相互作用而形成的，且参与多种分子过程，如蛋白折叠、细胞粘附、分子转移、信号转导、调节受体活性等；糖蛋白上的N-寡糖链的改变与疾病相关。
通过前期大量研究发现，在前列腺癌患者血清中，N-寡聚糖NA2(bigalactobiantennary glycan)，NA2F(bigalacto core-α-1,6-fucosylated bisectingbiantennary glycan)相对含量与正常血清中相比，发生了明显变化，因此可作为检测前列腺癌的标志物。
针对现有的前列腺癌检测中，血液检测和影像学检测特异性和准确度不高，病理检查有创伤性，抽样误差性，患者依存性差的问题，本发明提供一种前列腺癌的N-寡糖链检测检测方法。
材料和方法：
一、检测样本：前列腺癌患者和正常对照人的血清。
二、实验设备：糖组分析仪，PCR，离心机。
三、试剂制备：
试剂A：浓度为10mM的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度0.5～5％的SDS配制而成；
试剂B：由0.01～10U/10μL糖胺酰酶和0.01～10U/10μL唾液酸酶混合配制而成，混合溶液pH值为4～9；
试剂C：由8-氨基芘-1,3,6-三磺酸溶于DMSO中配制而成，浓度为0.01mM～1M；
试剂D：终止液。
四、糖测序检测步骤：
步骤一 寡糖链的制备
在经过灭活处理的2μL血清样品中加入4μL试剂A，进行变性，降温到室温后，加入4μL试剂B，孵育1～6h；
步骤二 寡糖链的标记
在步骤一得到的液体中加入2μL试剂C，进行荧光标记，然后加入150μL试剂D终止标记反应；
步骤三 寡糖链分离分析
取10μL步骤二处理后的液体，用分析仪进行糖链分离，得到图谱。
五、监测对比分析
将所得到的N-糖组图谱进行峰值量化，用每个峰的峰高值与所有峰的高度的总和相比，从而定量计算出每个峰的相对含量，所述组合物通过函数NGA2F/NG1A2F进行进一步的统计学分析，来检测前列癌。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)本发明的方法是基于检测血清糖蛋白中N-寡糖链的指纹图谱，创建的一种前列腺癌诊断的检测方法和检测系统。该方法可以让众多高度怀疑前列腺癌患者接受常规、无创检测，帮助医生检测，并能够及时监测疾病的发生和发病的进展，并且与目前其他技术相比有着更加明显的准确度，对前列腺癌检测的灵敏度达到97.2％。
(2)本发明的检测方法，与现有技术相比，准确度达到97.2％，明显优于现有的检测方法。采用本发明的试剂，能够让众多高风险的人群接受常规、无创检测，帮助医生及患者及时监测前列腺癌的发生和病情进展，有望在临床中推广使用。
附图说明
图1是正常对照组N-糖组图谱；图2是前列腺癌的血清糖蛋白N-糖组图谱；图谱中的寡糖缩写分别表示为：NA2F，核心岩藻糖两天线(Bigalacto core-α-1，6-fucosylatedbiantennary)；NA2，三天线(Briantennary)。
图3是模型建立后的ROC曲线图；检测样本通过函数NA2/NA2F用于鉴别前列腺癌的ROC曲线；检测样本总数为90例，其中前列腺癌血清样本23例，非前列腺癌(前列腺炎以及前列腺增生)样本67例，得到曲线下面积AUC＝0.972。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。需要说明的是，下列实施例仅用于说明而不用于限制本发明的范围。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件试验，或按照制造厂商建议的条件，试剂都为实验室专用。
实施例1检测前列腺癌
采用的材料和方法：
一、检测样本：前列腺癌患者和正常对照人的血清。
二、实验设备：毛细管电泳分析仪，PCR，离心机。
三、试剂制备：
试剂A：浓度为10mM的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度0.5～5％的SDS配制而成；
试剂B：由0.01～10U/10μL糖胺酰酶和0.01～10U/10μL唾液酸酶混合配制而成，混合溶液pH值为4～9；
试剂C：由8-氨基芘-1,3,6-三磺酸溶于DMSO中配制而成，浓度为0.01mM～1M；
试剂D：终止液。
四、糖测序检测步骤：
步骤一 寡糖链的制备
在经过灭活处理的2μL血清样品中加入4μL试剂A，进行变性，降温到室温后，加入4μL试剂B，孵育1～6h；
步骤二 寡糖链的标记
在步骤一得到的液体中加入2μL试剂C，进行荧光标记，然后加入150μL试剂D终止标记反应；
步骤三 寡糖链分离分析
取10μL步骤二处理后的液体，用分析仪进行糖链分离，得到图谱。
五、监测对比分析
利用G-Test检测技术对收集的90例前列腺癌和正常人对照组的血清样本进行处理，其中前列腺癌样本23例，非前列腺癌(前列腺炎以及前列腺增生)样本67例。对G-Test检测技术测定样本得到的N-糖组图谱进行统计学分析。
将每个峰峰高值除以所有峰高度的总和，定量计算得到每个峰的相对含量，即N-糖组图谱进行峰值量化，然后对量化后的前列腺癌组和正常对照组N-糖组图谱中9个寡糖峰进行比对统计分析。如图1和图2所示，人血清的N-糖组图谱显示出近9个N-寡糖链峰，寡糖链因分子大小的不同而表现出不同的迁移率，即表现在N-糖组图谱上的不同的峰则代表了不同的寡糖链，所测出的峰高代表了寡糖链的相对浓度含量。N-糖组图谱通过NGA2F/NG1A2F的比值进行进一步的统计学分析来检测前列癌。
检测样本通过函数NGA2F/NG1A2F用于鉴别前列腺癌的ROC曲线；检测样本总数为90例，其中前列腺癌血清样本23例，非前列腺癌(前列腺炎以及前列腺增生)样本67例；得到曲线下面积AUC＝0.972。
本发明的检测方法，与现有技术相比，准确度达到97.2％，明显优于现有的检测方法。采用本发明的试剂，能够让众多高风险的人群接受常规、无创检测，帮助医生及患者及时监测前列癌的发生和病情进展，有望在临床中推广使用。
以上结合附图所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，凡在本发明的精神和原则之内，不需要付出创造性劳动即可做出的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种前列腺癌监测试剂，其特征在于，由以下试剂组成：
试剂A：浓度为10mM的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度0.5～5％的SDS配制而成；
试剂B：由0.01～10U/10μL糖胺酰酶和0.01～10U/10μL唾液酸酶混合配制而成，混合溶液pH值为4～9；
试剂C：由8-氨基芘-1,3,6-三磺酸溶于DMSO中配制而成，浓度为0.01mM～1M；
试剂D：终止液。
2.根据权利要求1所述的前列腺癌检测试剂，其特征在于，所述试剂A、试剂B与试剂C的体积比是2：2：1。
3.根据权利要求1所述的前列腺癌检测试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一 寡糖链的制备
在经过灭活处理的2μL血清样品中加入4μL试剂A，进行变性，降温到室温后，加入4μL试剂B，孵育1～6h；
步骤二 寡糖链的标记
在步骤一得到的液体中加入2μL试剂C，进行荧光标记，然后加入150μL试剂D终止标记反应；
步骤三 寡糖链分离分析
取10μL步骤二处理后的液体，用分析仪进行糖链分离，得到图谱。
4.根据权利要求3所述的前列腺癌检测试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤一寡糖的制备中变性温度为不低于75℃加热，孵育温度为不低于25℃。
5.根据权利要求3所述的前列腺癌检测试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤二中荧光标记的温度为50～90℃。
6.一种组合物在制备前列腺癌监测试剂中的应用，其特征在于，所述组合物通过NA2/NA2F的比值来检测前列腺癌。
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