CN116223597A - 一种基于寡糖链检测前列腺癌的检测试剂、制备方法及应用 - Google Patents
一种基于寡糖链检测前列腺癌的检测试剂、制备方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116223597A CN116223597A CN202310201788.1A CN202310201788A CN116223597A CN 116223597 A CN116223597 A CN 116223597A CN 202310201788 A CN202310201788 A CN 202310201788A CN 116223597 A CN116223597 A CN 116223597A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- reagent
- prostate cancer
- oligosaccharide
- oligosaccharide chains
- concentration
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 80
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 60
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 title claims abstract description 60
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 title claims abstract description 53
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 29
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 17
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 14
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 claims abstract description 14
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 8
- FZWIIGKQNLYDQI-UHFFFAOYSA-N 8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonic acid Chemical compound C1=C2C(N)=CC(S(O)(=O)=O)=C(C=C3)C2=C2C3=C(S(O)(=O)=O)C=C(S(O)(=O)=O)C2=C1 FZWIIGKQNLYDQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 10
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 8
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 7
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 claims description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 5
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 5
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 abstract description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 abstract description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 8
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 7
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 7
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 238000001162 G-test Methods 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 102000007066 Prostate-Specific Antigen Human genes 0.000 description 4
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 4
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical group 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004791 biological behavior Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 230000036252 glycation Effects 0.000 description 1
- 102000045442 glycosyltransferase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700014210 glycosyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-N hydroperoxyl Chemical group O[O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 230000037230 mobility Effects 0.000 description 1
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002229 urogenital system Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种基于寡糖链检测前列腺癌的检测试剂及其制备方法和应用，检测试剂由以下试剂混合而成，试剂A：浓度为10mM、pH为8.3的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度1～5％的SDS配制而成；试剂B：由0.05～10单位/10μl糖胺酰酶、质量浓度10％的NP‑40和浓度为10mM、pH为8.3的碳酸氢铵溶液混合配制而成，混合溶液pH值为5～9；试剂C：由8‑氨基芘‑1,3,6‑三磺酸溶于DMSO中配制成浓度为0.02mM～1M有机物还原剂；试剂D：终止液。本发明通过该试剂测定血清中的天然寡糖N‑糖组图谱，再将峰值量化并进行统计学分析，从而提供一种前列腺癌的血清天然寡糖N‑糖组图谱模型的建立方法，通过测定生理病理状态下蛋白质的天然糖基化修饰的改变来检测前列腺癌。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种前列腺癌的检测方法，具体涉及一种基于血清寡糖链G-Test特异指纹图谱的前列腺癌检测方法。
背景技术
前列腺癌是老年男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤之一，其发病率与死亡率分别位列全球男性恶性肿瘤发病率和死亡率的第二位和第五位，在我国男性中分别居第六位和第七位。前列腺癌患者的生存时间与其临床诊断时恶性肿瘤分期密切相关。由于前列腺癌发病隐匿，进展较慢，初诊病例以临床中晚期居多，临床局限性病例仅为30％，导致我国前列腺癌患者的总体预后较差。因此，早筛早诊是延长前列腺癌患者生存期的前提。
临床常用的筛查手段包括血清标志物前列腺特异性抗原(PSA)的检测，直肠指诊(DRE)和影像学检查。但是各种技术手段均存在一定的局限性，如PSA的筛查虽然显著提高了前列腺癌的发现率，但经筛查发现的23％～42％的患者存在过度治疗，既增加了社会医疗负担，也给患者增加了不必要的痛苦和损伤；DRE筛查虽然最为经济，但是准确性仅有30％～50％，且与操作者的经验密切相关；影像学诊断早期前列腺癌的敏感较低。上述诊断方法都有自身的局限性，目前急需探索出用于辅助诊断前列腺癌并具有较高灵敏度和特异度的新型无创性的方法。
蛋白质糖基化(Glycosylation)是一种最常见的蛋白翻译后修饰，是在糖基转移酶作用下将糖类转移至蛋白质肽链上的天冬酰胺(ASN)的胺基形成N-连接聚糖或苏氨酸/丝氨酸的羟基氧原子形成O连接聚糖，参与调控蛋白质的功能。大多数的糖蛋白都是分泌蛋白，广泛存在于细胞膜、细胞间质、血浆以及粘液中。蛋白质上N-糖链通过加工修饰来调控蛋白质的结构、稳定性和活性，所以糖蛋白中糖链对于维持机体生物学功能起重要作用，从而赋予糖蛋白具有多种生物功能。因此了解糖链的改变有助于阐明炎症、肿瘤细胞对周围组织侵袭及转移等异常生物行为学的分子机理。
目前己经在多种肿瘤中发现了蛋白质N-糖链的异常改变，而N-糖链的末端唾液酸修饰改变是其中之一。唾液酸是一类带负电荷的9碳糖化合物，广泛存在于生物体内，常位于聚糖链末端；其在唾液酸酶的作用下通过α-2,3或α-2,6糖苷键与糖链上的半乳糖或N-乙酰半乳糖胺连接形成聚唾液酸链。研究发现聚糖链末端的唾液酸在调控细胞的相互识别、分子相互作用、病毒感染、免疫响应以及信号传导起到重要的功能，且细胞表面糖蛋白质唾液酸修饰具有组织和细胞特异性。众多研究表明唾液酸修饰异常导致了多种疾病的发生发展，如感染性疾病的发生、以及肿瘤的浸润和转移有着密切关系。因此，检测唾液酸相关寡糖链的改变对前列腺癌辅助诊断具有潜在的临床价值。
发明内容
针对目前临床上使用的前列腺癌检测中存在的问题，如血清学标志物PSA筛查发现的患者存在过度治疗，直肠指诊的准确性较低，影像学诊断的敏感性较低等，本发明提供一种前列腺癌检测试剂，通过该试剂测定血清中的天然寡糖N-糖组图谱，通过将峰值量化，进行统计学分析，从而提供一种前列腺癌的血清天然寡糖N-糖组图谱模型的建立方法，通过测定生理病理状态下蛋白质的天然糖基化修饰的改变来检测前列腺癌。
本发明采用的技术方案如下：
一种基于寡糖链检测前列腺癌的检测试剂，由以下试剂组成：
试剂A：浓度为10mM、pH为8.3的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度1～5％的SDS配制而成；
试剂B：由0.05～10单位/10μl糖胺酰酶、质量浓度10％的NP-40和浓度为10mM、pH为8.3的碳酸氢铵溶液混合配制而成，混合溶液pH值为5～9；
试剂C：由8-氨基芘-1,3,6-三磺酸溶于DMSO中配制成浓度为0.02mM～1M有机物还原剂；
试剂D：终止液。
优选的，所述试剂A、试剂B与试剂C的体积比是1:1:1。
优选的，所述试剂A、试剂B与试剂C的体积都为5μl。
优选的，所述试剂D为超纯水。
一种基于寡糖链检测前列腺癌的检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一 寡糖链的制备
在经过灭活处理的5μl血清样品中加入5μl试剂A，进行变性，冷却至室温后，加入5μl试剂B，37℃反应3h，然后进行干燥；
步骤二 寡糖链的标记
在步骤一干燥后得到的样品中加入5μl试剂C，60℃反应1h后进行荧光标记，然后加入100μl试剂D终止标记反应；
步骤三 寡糖链分离分析
取10μl寡糖链标记后的液体，用分析仪进行N-寡糖链分离检测，得到天然寡糖N-糖组图谱；
步骤四 数据处理分析
N-糖组图谱的峰值量化：将每个峰的峰高值除以所有峰的高度的总和，计算得到每个峰的相对含量。
一种组合物在制备寡糖链前列腺癌检测试剂中的应用，所述组合物由血清中的G4S4、G3S3、G2S2、G2S2F、G2S1、G2S1F、G1F和G2F2组成，所述组合物通过G1S1F/G3S3+G1S1F/G2S2F的值来检测前列腺癌。
所述G1F为同分异构体。
本发明提供一种前列腺癌的血清天然寡糖N-糖组图谱模型的建立方法，通过测定血清天然寡糖链G-Test特异指纹图谱，进行统计学分析。
材料和方法：
一、检测样本：前列腺癌患者和健康人的血清。
二、实验设备：毛细管电泳分析仪，PCR，离心机。
三、试剂制备：
1、试剂A：浓度为10mM、pH为8.3的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度1～5％的SDS配制而成；
2、试剂B：由0.05～10单位/10μl糖胺酰酶、质量浓度10％的NP-40和浓度为10mM、pH为8.3的碳酸氢铵溶液混合配制而成，混合溶液pH值为5～9；
3、试剂C：由8-氨基芘-1,3,6-三磺酸溶于DMSO中配制成浓度为0.02mM～1M有机物还原剂；
4、试剂D：终止液。
四、N-糖组图谱检测
1、寡糖链的制备
在经过灭活处理的5μl血清样品中加入5μl试剂A，进行变性；待冷却至室温后，加入5μl试剂B，37℃反应3h，然后进行干燥。
2、寡糖链的标记
(1)干燥后的样品中加入5μl试剂C，60℃反应1h，进行荧光标记；
(2)荧光标记完成后，加入100μl试剂D终止标记反应。
3、寡糖链分离分析
取10μl寡糖链标记后的液体，在ABI3500dx仪器下进行N-寡糖链分离检测，从而得到天然寡糖N-糖组图谱。
4、数据处理分析
(1)N-糖组图谱的峰值量化：将每个峰的峰高值除以所有峰的高度的总和，计算得到每个峰的相对含量。
(2)前列腺癌患者与健康人群N-糖组数据分析：将前列腺癌患者与健康人N-糖组数据进行对比分析。将每个峰峰高值除以所有峰高度的总和，定量计算得到每个峰的相对含量，即N-糖组图谱的峰值量化，然后对量化后的前列腺癌组和健康对照组N-糖组图谱中9个N-寡糖链峰进行比对统计分析。N-糖组图谱的组合物由G4S4、G3S3、G2S2、G2S2F、G2S1、G2S1F、G1F和G2F2组成，其中G1F为同分异构体；通过组合物G1S1F/G3S3+G1S1F/G2S2F值来检测前列腺癌。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)将G-Test指纹图谱的各个峰值进行量化，然后将前列腺癌患者(186例)和健康人(198例)各峰相对含量结果进行对比分析，发现N-聚糖组合物G3S3，G1S1F和G2S2F在两组间存在显著的统计学差异(p<0.05)；因此，基于组合物G1S1F/G3S3+G1S1F/G2S2F建立的模型在区分前列腺癌患者时ROC曲线下AUC值达到0.854，该G1S1F/G3S3+G1S1F/G2S2F模型检测的cutoff值为5.18时，对前列腺癌的检测有81.60％的灵敏度和75.80％的特异性，表明血清中的N-聚糖组合物G1S1F/G3S3+G1S1F/G2S2F可以作为辅助诊断前列腺癌的标志物。
(2)本发明提出的G-Test检测法是基于DNA测序仪的毛细管微电泳技术(DSA-FACE)，将血清样本中糖蛋白N-糖链进行荧光标记后，用毛细管微电泳进行分离，通过测量荧光信号得到的糖蛋白的含量即天然寡糖N-糖组图谱。本发明通过检测生理病理状态下唾液酸寡糖链的变化与疾病状态的相关性，可以根据这些变化，建立N-聚糖组合物的预测模型来辅助诊断前列腺癌状态。
(3)基于本发明方法构建的G-Test天然N-糖组图谱模型，能够让众多患者接受常规、无创检测，帮助医生及患者及时监测前列腺癌的发生和疾病进展，本发明的检测技术具有灵敏度高、操作简单、微量(5μl血清)、重复性高、稳定性好、高通量(96-孔板)等优点，可在临床中推广使用。
附图说明
图1是健康人和前列腺癌患者的血清天然寡糖N-糖组图谱；
图2是基于N-糖组合物G1S1F/G3S3+G1S1F/G2S2F建立的鉴别前列腺癌状态模型ROC曲线图；检测样本总数为384例，其中前列腺癌患者血清186例，健康人血清198例，得到ROC曲线下面积AUC＝0.854。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。需要说明的是，下列实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件试验，或按照制造厂商建议的条件。
检测前列腺癌状态，通过测定血清天然寡糖N-糖组图谱，进行统计学分析，采用的材料和方法如下列实施例。
实施例一
1.检测样本：前列腺癌患者和健康人的血清。
2.实验设备：毛细管电泳分析仪，PCR，离心机。
3.试剂制备：
(1)试剂A：浓度为10mM的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度2.5％的SDS配制而成；
(2)试剂B：由3.5单位/10μl糖胺酰酶、质量浓度10％的NP-40和浓度为10mM、pH为8.3的碳酸氢铵溶液混合配制而成，溶液pH值为7；
(3)试剂C：由8-氨基芘-1,3,6-三磺酸溶于DMSO中配制而成浓度为10mM有机物还原剂；
(4)试剂D：超纯水。
4.N-糖组图谱检测：
(1)寡糖链的制备
在经过灭活处理的5μl血清样品中加入5μl试剂A，进行变性；待冷却至室温后，加入5μl试剂B，37℃反应3h，然后进行干燥。
(2)寡糖链的标记
1)干燥后的样品中加入5μl试剂C，60℃反应1h，进行荧光标记；
2)荧光标记完成后，加入100μl试剂D终止标记反应。
(3)寡糖链分离分析
取10μl寡糖链标记后的液体，在ABI3500dx仪器下进行N-寡糖链分离检测，从而得到天然寡糖N-糖组图谱。
(4)数据处理分析
1)N-糖组图谱的峰值量化：将每个峰的峰高值除以所有峰的高度的总和，计算得到每个峰的相对含量。
2)前列腺癌患者与健康人群N-糖组数据分析：将前列腺癌患者与健康人N-糖组数据进行对比分析。如图1所示，人血清的N-糖组图谱显示出近9个N-寡糖链峰，不同寡糖链因所带电荷以及分子大小的不同而表现出不同的迁移率，即表现在N-糖组图谱上的不同的峰则代表了不同的寡糖链，其峰高代表了寡糖链的相对含量。图1中A为健康人血清N-聚糖图谱，B为前列腺癌患者血清N-聚糖图谱。N-糖组图谱的组合物由G4S4、G3S3、G2S2、G2S2F、G2S1、G2S1F、G1F和G2F2组成，其中G1F为同分异构体；通过计算组合物G1S1F/G3S3+G1S1F/G2S2F值来辅助判断前列腺癌状态。
基于组合物G1S1F/G3S3+G1S1F/G2S2F建立的模型在区分前列腺癌患者时ROC曲线下AUC值达到0.854(图2)，该G1S1F/G3S3+G1S1F/G2S2F模型检测的cutoff值为5.18时，对前列腺癌的检测有81.60％的灵敏度和75.80％的特异性，表明血清中的N-聚糖组合物G1S1F/G3S3+G1S1F/G2S2F可以作为辅助诊断前列腺癌的标志物。
实施例二
1.检测样本：前列腺癌患者和健康人的血清。
2.实验设备：毛细管电泳分析仪，PCR，离心机。
3.试剂制备：
(1)试剂A：浓度为10mM的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度1％的SDS配制而成；
(2)试剂B：由0.05单位/10μl糖胺酰酶、质量浓度10％的NP-40和浓度为10mM、pH为8.3的碳酸氢铵溶液混合配制而成，溶液pH值为5；
(3)试剂C：由8-氨基芘-1,3,6-三磺酸溶于DMSO中配制而成浓度为0.02mM有机物还原剂；
(4)试剂D：超纯水。
4.N-糖组图谱检测同实施例一。
实施例三
1.检测样本：前列腺癌患者和健康人的血清。
2.实验设备：毛细管电泳分析仪，PCR，离心机。
3.试剂制备：
(1)试剂A：浓度为10mM的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度5％的SDS配制而成；
(2)试剂B：由10单位/10μl糖胺酰酶、质量浓度10％的NP-40和浓度为10mM、pH为8.3的碳酸氢铵溶液混合配制而成，溶液pH值为9；
(3)试剂C：由8-氨基芘-1,3,6-三磺酸溶于DMSO中配制而成浓度为1M有机物还原剂；
(4)试剂D：超纯水。
4.N-糖组图谱检测同实施例一。
本检测技术与现有技术相比，通过检测生理病理状态下唾液酸寡糖链的变化与疾病状态的相关性，可以根据这些变化，建立N-聚糖组合物的预测模型来辅助判断前列腺癌状态。基于本发明方法构建的G-Test天然N-糖组图谱模型，能够让众多患者接受常规、无创检测，帮助医生及患者及时监测前列腺癌的发生和疾病进展，可在临床中推广使用。
以上结合附图所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，凡在本发明的精神和原则之内，不需要付出创造性劳动即可做出的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种基于寡糖链检测前列腺癌的检测试剂，其特征在于，由以下试剂组成：
试剂A：浓度为10mM、pH为8.3的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度1～5％的SDS配制而成；
试剂B：由0.05～10单位/10μl糖胺酰酶、质量浓度10％的NP-40和浓度为10mM、pH为8.3的碳酸氢铵溶液混合配制而成，混合溶液pH值为5～9；
试剂C：由8-氨基芘-1,3,6-三磺酸溶于DMSO中配制成浓度为0.02mM～1M有机物还原剂；
试剂D：终止液。
2.根据权利要求1所述的基于寡糖链检测前列腺癌的检测试剂，其特征在于，所述试剂A、试剂B与试剂C的体积比是1:1:1。
3.根据权利要求2所述的基于寡糖链检测前列腺癌的检测试剂，其特征在于，所述试剂A、试剂B与试剂C的体积都为5μl。
4.根据权利要求1所述的基于寡糖链检测前列腺癌的检测试剂，其特征在于，所述试剂D为超纯水。
5.根据权利要求1所述的基于寡糖链检测前列腺癌的检测试剂制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一 寡糖链的制备
在经过灭活处理的5μl血清样品中加入5μl试剂A，进行变性，冷却至室温后，加入5μl试剂B，37℃反应3h，然后进行干燥；
步骤二 寡糖链的标记
在步骤一干燥后得到的样品中加入5μl试剂C，60℃反应1h后进行荧光标记，然后加入100μl试剂D终止标记反应；
步骤三 寡糖链分离分析
取10μl寡糖链标记后的液体，用分析仪进行N-寡糖链分离检测，得到天然寡糖N-糖组图谱；
步骤四 数据处理分析
N-糖组图谱的峰值量化：将每个峰的峰高值除以所有峰的高度的总和，计算得到每个峰的相对含量。
6.一种组合物在制备寡糖链前列腺癌检测试剂中的应用，其特征在于，所述组合物由血清中的G4S4、G3S3、G2S2、G2S2F、G2S1、G2S1F、G1F和G2F2组成，所述组合物通过G1S1F/G3S3+G1S1F/G2S2F的值来检测前列腺癌。
7.根据权利要求6所述的一种组合物在制备寡糖链前列腺癌检测试剂中的应用，其特征在于，所述G1F为同分异构体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/CN2023/138511 WO2024183386A1 (zh) | 2022-12-16 | 2023-12-13 | 一种基于寡糖链检测前列腺癌的检测试剂、制备方法及应用 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2022116222124 | 2022-12-16 | ||
| CN202211622212 | 2022-12-16 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116223597A true CN116223597A (zh) | 2023-06-06 |
Family
ID=86580244
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310201788.1A Pending CN116223597A (zh) | 2022-12-16 | 2023-03-03 | 一种基于寡糖链检测前列腺癌的检测试剂、制备方法及应用 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116223597A (zh) |
| WO (1) | WO2024183386A1 (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024183386A1 (zh) * | 2022-12-16 | 2024-09-12 | 先思达（南京）生物科技有限公司 | 一种基于寡糖链检测前列腺癌的检测试剂、制备方法及应用 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10753936B2 (en) * | 2016-07-22 | 2020-08-25 | Van Andel Research Institute | Method of detecting the level of a glycan |
| CN114136932A (zh) * | 2021-09-15 | 2022-03-04 | 江苏先思达生物科技有限公司 | 一种子宫内膜样腺癌检测试剂及其在子宫内膜样腺癌检测中的应用 |
| CN114032284A (zh) * | 2021-09-15 | 2022-02-11 | 陈翠英 | 一种食管癌检测试剂及其在食管癌检测中的应用 |
| CN114032282A (zh) * | 2021-09-15 | 2022-02-11 | 陈翠英 | 一种前列腺癌检测试剂及其在前列腺癌检测中的应用 |
| CN114032283A (zh) * | 2021-09-15 | 2022-02-11 | 陈翠英 | 一种肠癌检测试剂及其在肠癌检测中的应用 |
| CN114058673A (zh) * | 2021-09-15 | 2022-02-18 | 江苏先思达生物科技有限公司 | 一种脂肪肝检测试剂及其在脂肪肝检测中的应用 |
| CN114034752A (zh) * | 2021-09-15 | 2022-02-11 | 先思达（南京）生物科技有限公司 | 一种肝衰竭检测试剂及其在肝衰竭检测中的应用 |
| CN114032281A (zh) * | 2021-09-15 | 2022-02-11 | 陈翠英 | 一种丙肝肝癌检测试剂及其在丙肝肝癌检测中的应用 |
| CN116298285A (zh) * | 2022-11-11 | 2023-06-23 | 先思达（南京）生物科技有限公司 | 一种基于寡糖链检测乳腺癌的检测试剂、制备方法及应用 |
| CN116183921A (zh) * | 2022-11-11 | 2023-05-30 | 先思达（南京）生物科技有限公司 | 一种基于寡糖链检测胰腺癌的检测试剂、制备方法及应用 |
| CN116223597A (zh) * | 2022-12-16 | 2023-06-06 | 先思达（南京）生物科技有限公司 | 一种基于寡糖链检测前列腺癌的检测试剂、制备方法及应用 |
-
2023
- 2023-03-03 CN CN202310201788.1A patent/CN116223597A/zh active Pending
- 2023-12-13 WO PCT/CN2023/138511 patent/WO2024183386A1/zh unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024183386A1 (zh) * | 2022-12-16 | 2024-09-12 | 先思达（南京）生物科技有限公司 | 一种基于寡糖链检测前列腺癌的检测试剂、制备方法及应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2024183386A1 (zh) | 2024-09-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2018233617A1 (zh) | 慢性肝炎肝损伤的血清糖蛋白糖组图谱模型的建立方法 | |
| CN102565318B (zh) | 一种肝癌监测、分期以及预后风险评估的试剂及其方法 | |
| WO2018157832A1 (zh) | 一种胃癌监测试剂盒及其使用方法 | |
| JP2017502307A (ja) | 唾液の糖タンパク質糖鎖に基づいて肝疾患を識別するレクチンチップ及びその使用 | |
| WO2018233619A1 (zh) | 肝衰竭的血清糖蛋白糖组图谱模型的建立方法 | |
| CN109100410B (zh) | 肝硬化的血清糖蛋白n-糖组图谱模型的建立方法 | |
| CN107505295A (zh) | 一种肝癌监测试剂盒及其使用方法 | |
| WO2023040912A1 (zh) | 一种前列腺癌检测试剂及其在前列腺癌检测中的应用 | |
| WO2024183386A1 (zh) | 一种基于寡糖链检测前列腺癌的检测试剂、制备方法及应用 | |
| CN114032283A (zh) | 一种肠癌检测试剂及其在肠癌检测中的应用 | |
| WO2023040909A1 (zh) | 一种食管癌检测试剂及其在食管癌检测中的应用 | |
| CN114034752A (zh) | 一种肝衰竭检测试剂及其在肝衰竭检测中的应用 | |
| CN114032281A (zh) | 一种丙肝肝癌检测试剂及其在丙肝肝癌检测中的应用 | |
| WO2024183385A1 (zh) | 一种基于寡糖链检测肠癌的检测试剂、制备方法及应用 | |
| CN108796075A (zh) | 检测circRNF13和LOC284454试剂的应用及试剂盒 | |
| CN116298285A (zh) | 一种基于寡糖链检测乳腺癌的检测试剂、制备方法及应用 | |
| CN116183921A (zh) | 一种基于寡糖链检测胰腺癌的检测试剂、制备方法及应用 | |
| CN114058673A (zh) | 一种脂肪肝检测试剂及其在脂肪肝检测中的应用 | |
| CN115774109A (zh) | 一种基于寡糖链检测胃癌的检测试剂、制备方法及应用 | |
| CN108660213B (zh) | 检测三种非编码rna试剂的应用及试剂盒 | |
| CN115792002A (zh) | 一种基于寡糖链检测阿尔兹海默症的检测试剂、制备方法及应用 | |
| CN114136932A (zh) | 一种子宫内膜样腺癌检测试剂及其在子宫内膜样腺癌检测中的应用 | |
| CN115902239A (zh) | 一种基于寡糖链检测肺癌的检测试剂、制备方法及应用 | |
| CN109682975B (zh) | 一种乙型肝炎检测试剂及其在乙型肝炎检测中的应用 | |
| CN116465952A (zh) | 一种基于寡糖链检测子宫内膜癌的检测试剂、制备方法及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Country or region after: China Address after: Building G26, 6th Floor, East Side of Tai Road and North Side of Xinyang Road, China Pharmaceutical City, Taizhou City, Jiangsu Province, 225312 Applicant after: JIANGSU XIANSIDA BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Applicant after: XIANSIDA NANJING BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: 22nd Floor, Building A, Gene Building, No. 211 Pubin Road, Pukou District, Nanjing City, Jiangsu Province, 225312 Applicant before: XIANSIDA NANJING BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Country or region before: China Applicant before: JIANGSU XIANSIDA BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. |