CN114032281A - 一种丙肝肝癌检测试剂及其在丙肝肝癌检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种丙肝肝癌检测试剂及其制备方法，检测试剂由以下试剂混合而成，试剂A：浓度为10mM的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度0.5～5％的SDS配制而成；试剂B：由0.01～10U/10μL糖胺酰酶和0.01～10U/10μL唾液酸酶混合配制而成，混合溶液pH值为4～9；试剂C：由8‑氨基芘‑1,3,6‑三磺酸溶于DMSO中配制而成，浓度为0.01mM～1M；试剂D：终止液。本发明通过检测试剂测定血清中糖组图谱，将峰值量化进行统计学分析，提供一种丙肝肝癌血清糖组图谱的模型的建立方法来检测丙肝肝癌。

Description

一种丙肝肝癌检测试剂及其在丙肝肝癌检测中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种丙肝肝癌的检测方法，具体涉及一种基于血清糖蛋白寡糖链检测(G-Test)特异指纹图谱的丙肝肝癌检测方法。
背景技术
慢性丙型病毒性肝炎(Chronic Hepatitis C Virus-HCV)是导致肝硬化与肝癌的主要原因之一。丙型病毒性肝炎，简称为丙型肝炎是一种由丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的病毒性肝炎，主要经输血、针刺、吸毒等途径传播。丙肝的病理改变与乙肝极为相似，以肝细胞坏死和淋巴细胞浸润为主。慢性肝炎可出现汇管区纤维组织增生，导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌(HCC)。丙肝肝炎与肝癌的发生密切相关，两者间的转变是一个较漫长的过程，分为四个阶段：急性感染—慢性感染—肝硬化—肝癌。HCV感染初期(2～12周)为急性期，感染者可无明显症状。感染HCV后1～3周，在外周血可检测到HCV RNA，只有少数人可自行清除病毒而痊愈。慢性期50％～85％的患者会进入慢性炎症阶段，发展为慢性丙肝。HCV慢性感染者具有较高发生肝癌的风险。HCV慢性感染者发生肝癌的风险是普通人群的15～20倍。目前全球有1.3亿～2.1亿的HCV慢性感染者。10％～40％的慢性丙肝患者将进展为肝硬化，其中，又有1％～5％最终进展为肝癌。目前丙肝抗体是诊断丙型病毒性肝炎的主要指标。但因感染HCV后，抗HCV抗体出现较慢，一般在发病后2～6个月，甚至1年才转阳，故不能作为早期诊断的方法。
当各型病毒性肝炎特异性标志检测阴性，临床症状及单项谷丙转氨酶(ALT)升高，提示急性病毒性肝炎时，应考虑是否为丙型病毒性肝炎。鉴别诊断主要依据特异性血清学检查：1.肝功能：包括血清ALT、谷草转氨酶(AST)、总胆红素、直接胆红素、间接胆红素、白蛋白、球蛋白，胆碱酯酶、碱性磷酸酶、转肽酶等。2.丙肝病毒抗体抗HCV。3.丙肝病毒定量血清HCV RNA。4.影像学：腹部肝胆脾超声检查了解肝脏有无慢性损伤，必要时行腹部增强电子计算机断层扫描(CT)或核磁共振成像(MRI)检查，以了解病情损伤程度。5.肝脏瞬时弹性波扫描，是一种无创检查可用于慢性丙型肝炎患者肝脏纤维化程度评估。丙型肝炎患者评估肝脏纤维化程度对于确定治疗方案非常重要。6.肝组织活检，是评估患者肝脏炎症分级与纤维化分期的金标准。
目前用聚合酶链式反应(PCR)方法可以直接检测血中的HCV-RNA，可用于HCV感染的早期诊断。HCV-RNA及抗HCV抗体均阳性或HCV-RNA单独阳性即可确诊为丙型病毒性肝炎。和乙肝一样，慢性丙肝患者属于肝癌高危人群。肝癌高危人群是指年龄在35岁以上，有HBV或HCV感染的血清学证据，或有慢性肝炎病史者，甲胎蛋白(AFP)检测+肝脏超声检查，用于肝癌早发现。但是由于AFP检测和肝脏超声检查的灵敏度不高，容易造成假阴性，延误诊断。因此急需高灵敏度和高特异度的方法用于丙肝肝癌的早期检测。
蛋白质的糖基化(Glycosylation)是一种最常见的蛋白翻译后修饰，是在糖基转移酶作用下将糖类转移至蛋白质和蛋白质上特殊的氨基酸残基形成糖苷键的过程。大多数的糖蛋白都是分泌蛋白，广泛存在于细胞膜、细胞间质、血浆以及粘液中。有些酶和激素是糖蛋白。糖蛋白具有多种生物功能。有些糖蛋白如原胶原是结构蛋白质。许多酶和激素(如黄体生成素、促甲状腺激素等)有糖蛋白结构，血液中的许多糖蛋白担负无机离子(Fe2+、Ca2+、Cu2+等)和激素等生物活性物质的运输，血液凝固(纤维蛋白原是糖蛋白)和抗体活性等生物功能。凝集素有凝集细胞的能力，糖链还可起稳定肽链的作用。糖蛋白的另一重要功能是直接或间接地参与细胞表面的种种识别现象。由于糖蛋白中糖链对于维持机体生物学功能的重要性，糖链的改变有助于阐明炎症、肿瘤细胞对周围组织侵袭及转移等异常生物行为学的分子机理。目前，己经在多种肿瘤中发现了N-糖链的改变。
糖链是重要的生物信息分子，在许多生理和病理过程中都发挥着独特作用。糖链结构非常复杂，具有微观不均一性，其分析和结构解析一直是糖生物学研究的瓶颈。目前糖链结构的分析方法发展迅速，主要包括：(1)高效液相色谱法(HPLC)：分辨率高，检测速度快，重复性高，高效液相色谱柱可以反复使用，但是柱效会随着使用次数的增加而变低，且流动相有毒，设备操作需要受过严格培训的专业人才进行，且设备相对昂贵，溶剂需要严格纯化；(2)质谱法(MS)：质谱具有灵敏度高、可获得多种结构信息和适于分析混合物等优点，是糖链定性定量分析的一种理想手段。但是质谱仪器精密，设备操作复杂，且质谱仪价格昂贵，不适合临床上普及推广使用；(3)毛细管电泳法(CE)：毛细管电泳成本低、柱效高、灵敏度高、速度快、进样量少、操作简单，但是重复性不高，稳定性不如HPLC。
G-Test检测法(Glycan-Test)是基于DNA分析仪的毛细管微电泳技术(DSA-FACE)，将前列腺液样本中糖蛋白的N-糖链进行荧光标记后，用毛细管微电泳进行分离，通过测量荧光信号得到的N-寡糖链的含量即指纹图谱(简称G-Test图谱)。该检测技术具有灵敏度高、操作简单、微量(2μL血清)、重复性高、稳定性好、高通量(96-孔板)等其他糖链分析技术无法比拟的优点，适用于一般检验科室，可望用于临床推广使用。
发明内容
本发明目的在于提供一种丙肝肝癌检测试剂，通过试剂测定血清中糖组图谱，将峰值量化，进行统计学分析，从而提供一种丙肝肝癌血清糖组图谱的模型的建立方法。
本发明采用的技术方案如下：
一种丙肝肝癌检测试剂，由以下试剂混合而成：
试剂A：浓度为10mM的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度0.5～5％的SDS配制而成；
试剂B：由0.01～10U/10μL糖胺酰酶和0.01～10U/10μL唾液酸酶混合配制而成，混合溶液pH值为4～9；
试剂C：由8-氨基芘-1,3,6-三磺酸溶于DMSO中配制而成，浓度为0.01mM～1M；
试剂D：终止液。
优选地，所述试剂A、试剂B与试剂C的体积比为2：2：1。
一种丙肝肝癌检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一 寡糖链的制备
在经过灭活处理的2μL血清样品中加入4μL试剂A，进行变性，降温到室温后，加入4μL试剂B，孵育1～6h；
步骤二 寡糖链的标记
在步骤一得到的液体中加入2μL试剂C，进行荧光标记，然后加入150μL试剂D终止标记反应；
步骤三 寡糖链分离分析
取10μL步骤二处理后的液体，用分析仪进行糖链分离，得到图谱。
优选地，所述步骤一寡糖的制备中变性温度为不低于75℃加热，孵育温度为不低于25℃。
优选地，所述步骤二中荧光标记的温度为50～90℃。
一种组合物在制备丙肝肝癌检测试剂中的应用，所述组合物通过(NGA2F+NA2F)/NA3的比值来检测丙肝肝癌。
本发明提供一种丙肝肝癌的血清糖蛋白N-糖组图谱模型的建立方法，通过测定血清糖蛋白寡糖链G-Test特异指纹图谱，进行统计学分析。
材料和方法：
一、检测样本：丙肝病毒引起的丙肝肝癌患者与正常对照人的血清。
二、实验设备：糖组分析仪，PCR，离心机。
三、试剂制备：
试剂A：浓度为10mM的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度0.5～5％的SDS配制而成；
试剂B：由0.01～10U/10μL糖胺酰酶和0.01～10U/10μL唾液酸酶混合配制而成，混合溶液pH值为4～9；
试剂C：由8-氨基芘-1,3,6-三磺酸溶于DMSO中配制而成，浓度为0.01mM～1M；
试剂D：终止液。
四、糖测序检测步骤：
步骤一 寡糖链的制备
在经过灭活处理的2μL血清样品中加入4μL试剂A，进行变性，降温到室温后，加入4μL试剂B，孵育1～6h；
步骤二 寡糖链的标记
在步骤一得到的液体中加入2μL试剂C，进行荧光标记，然后加入150μL试剂D终止标记反应；
步骤三 寡糖链分离分析
取10μL步骤二处理后的液体，用分析仪进行糖链分离，得到图谱。
五、监测对比分析
将每个峰峰高值除以所有峰高度的总和，定量计算得到每个峰的相对含量，即N-糖组图谱的峰值量化，然后对量化后的丙肝肝癌组和正常对照组N-糖组图谱中9个寡糖峰进行比对统计分析。所述组合物通过(NGA2F+NA2F)/NA3的比值来检测丙肝肝癌。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)本发明方法采用灵敏度高、操作简单、仅需微量样品、重复性高、稳定性好和高通量的G-Test检测方法，建立了丙肝肝癌患者和正常对照人具有显著差异的N-糖组图谱模型。在后续应用中，待检测血清的N-糖组图谱用本方法建立的图谱模型来计算，能够检测样本是否具有丙肝肝癌。与现有技术相比，具有更高的准确度，对丙肝肝癌检测模型所做ROC曲线的AUC面积达到0.864。
(2)基于本发明方法构建的N-糖组图谱模型，能够让众多患者接受常规、无创检测，帮助医生及患者及时检测丙肝病毒引起的肝癌的发生和病情进展，有望在临床中推广使用。
附图说明
图1是正常对照组和丙肝肝癌组的血清糖蛋白N-糖组图谱；图谱中的寡糖缩写分别表示为：NGA2F，半乳糖缺失含核心岩藻糖两天线(Agalacto core-α-1，6-fucosylatedbiantennary)；NA2F，核心岩藻糖两天线(Bigalacto core-α-1，6-fucosylatedbiantennary)；NA3，三天线(Triantennary)。
图2是模型建立后的ROC曲线图；检测样本通过函数(NGA2F+NA2F)/NA3用于鉴别丙肝肝癌的ROC曲线；检测样本总数为66例，其中丙肝肝癌患者血清36例，正常人对照组血清30例，得到曲线下面积AUC＝0.864。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。需要说明的是，下列实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件试验，或按照制造厂商建议的条件。
实施例1检测丙肝肝癌
通过测定血清糖蛋白寡糖链G-Test特异指纹图谱，进行统计学分析，采用的材料和方法：
一、检测样本：丙肝病毒引起的丙肝肝癌患者与正常对照人的血清。
二、实验设备：糖组分析仪，PCR，离心机。
三、试剂制备：
试剂A：浓度为10mM的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度0.5～5％的SDS配制而成；
试剂B：由0.01～10U/10μL糖胺酰酶和0.01～10U/10μL唾液酸酶混合配制而成，混合溶液pH值为4～9；
试剂C：由8-氨基芘-1,3,6-三磺酸溶于DMSO中配制而成，浓度为0.01mM～1M；
试剂D：终止液。
四、糖测序检测步骤：
步骤一 寡糖链的制备
在经过灭活处理的2μL血清样品中加入4μL试剂A，进行变性，降温到室温后，加入4μL试剂B，孵育1～6h；
步骤二 寡糖链的标记
在步骤一得到的液体中加入2μL试剂C，进行荧光标记，然后加入150μL试剂D终止标记反应；
步骤三 寡糖链分离分析
取10μL步骤二处理后的液体，用分析仪进行糖链分离，得到图谱。
五、检测对比分析
利用G-Test检测技术对收集的66例丙肝肝癌患者和正常人对照组的血清样本进行处理，其中丙肝肝癌患者血清36例，正常人对照组血清30例。对G-Test检测技术测定样本得到的N-糖组图谱进行统计学分析。
将每个峰峰高值除以所有峰高度的总和，定量计算得到每个峰的相对含量，即N-糖组图谱峰值量化，然后对量化后的丙肝肝癌组和正常对照组N-糖组图谱中9个糖峰进行比对统计分析。如图1所示，血清N-糖组图谱大概显示出9个N-糖链峰，糖链因分子大小的不同而表现出不同的迁移率，即表现在N-糖组图谱上的不同的峰则代表了不同的寡糖链，所测出的峰高代表了寡糖链的相对浓度含量，图1A为正常对照组，图1B为丙肝肝癌组。N-糖组图谱的组合物通过(NGA2F+NA2F)/NA3的比值来检测丙肝肝癌。
对G-Test指纹图谱的各个峰值进行量化，然后对丙肝肝癌组(36例)和正常对照组(30例)进行统计学分析，通过九个峰建立模型来预测丙肝肝癌，发现两组的区分上具有统计学意义(p＜0.05)。ROC曲线分析显示，模型在检测丙肝肝癌患者时具有显著的临床意义，即AUC可达0.864(图2)。由此说明血清中九个寡糖峰可以作为丙肝肝癌的标志物。
以上所述的具体实施例，结合附图对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，本领域技术人员所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种丙肝肝癌检测试剂，其特征在于，由以下试剂混合而成：
试剂A：浓度为10mM的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度0.5～5％的SDS配制而成；
试剂B：由0.01～10U/10μL糖胺酰酶和0.01～10U/10μL唾液酸酶混合配制而成，混合溶液pH值为4～9；
试剂C：由8-氨基芘-1,3,6-三磺酸溶于DMSO中配制而成，浓度为0.01mM～1M；
试剂D：终止液。
2.根据权利要求1所述的丙肝肝癌检测试剂，其特征在于，所述试剂A、试剂B与试剂C的体积比是2：2：1。
3.根据权利要求1所述的丙肝肝癌检测试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一 寡糖链的制备
在经过灭活处理的2μL血清样品中加入4μL试剂A，进行变性，降温到室温后，加入4μL试剂B，孵育1～6h；
步骤二 寡糖链的标记
在步骤一得到的液体中加入2μL试剂C，进行荧光标记，然后加入150μL试剂D终止标记反应；
步骤三 寡糖链分离分析
取10μL步骤二处理后的液体，用分析仪进行糖链分离，得到图谱。
4.根据权利要求3所述的丙肝肝癌检测试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤一寡糖的制备中变性温度为不低于75℃加热，孵育温度为不低于25℃。
5.根据权利要求3所述的丙肝肝癌检测试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤二中荧光标记的温度为50～90℃。
6.一种组合物在制备丙肝肝癌检测试剂中的应用，其特征在于，所述组合物通过(NGA2F+NA2F)/NA3的比值来检测丙肝肝癌。
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