一种适合质谱检测的糖链结构异常蛋白的前处理组合物、前
处理方法及应用
技术领域
本发明属于医疗器械及体外诊断的技术领域,涉及一种适合质谱检测的糖链结构异常蛋白的前处理组合物、前处理方法及应用。
背景技术
质谱检测(mass spectrometry,MS)的基本原理是:使分子或原子等粒子在离子源中发生电离,并在加速电场的作用下,让所发生电离对的分子或原子进入质量分析器,利用电场、磁场使各种离子按质荷比发生色散和聚焦,从而确定其质量,并根据质量及图谱分析确定待测样品的类型和数量。
从20世纪40年代开始,质谱广泛用于有机物质分析,并相继出现了气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术、场解析(FD)技术、等离子体解析(PD)技术、快速原子轰击(FAB)、热喷雾(TS)等离子化技术,实现了对复杂混合物、极性较大的生物分子的分析和鉴定,可分析和鉴定的相对分子质量范围达到了千道尔顿(KDa)级别及以上。
电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解析电离(MALDI)两大软电离技术的实现,使蛋白质、核酸和聚糖这样高极性、难挥发、热不稳定、质量可高达几十万的生物大分子高效、持续、稳定地生成准分子离子;电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解析电离(MALDI)与离子阱质谱分析仪(IT)、三重串联四极杆质谱分析仪(QQQ)、飞行时间质谱分析仪(TOF)和傅里叶变换离子回旋共振质谱分析仪(FTICR)等高性能质谱分析器联合使用后,可以实现生物大分子的质谱分析、定量分析和相对分子质量测定,并且检出限可达到皮摩尔级(ppm)甚至更低。
糖基化是蛋白质形成过程中一种最常见的蛋白翻译后修饰,人体样本中50%以上的蛋白都具有糖基化修饰,对蛋白的结构和功能有着重要影响。其中两种主要类型的糖基化为:N-糖基化和粘蛋白型O-糖基化。其中:
1、N-糖基化蛋白的N-糖基化发生在蛋白特征序列Asn-Xaa-Ser/Thr,即N-X-S/T,糖链的还原末端通过Asn的侧链氨基与蛋白质相连。N-糖链由五糖核心和分支(或天线)两部分构成,其中,五糖核心由两个乙酰葡糖胺(GlcNAc)和三个甘露糖(Man)组成,某些情况下,还原末端的乙酰葡糖胺(GlcNAc)还会与一个岩藻糖(Fuc)连接,形成核心岩藻糖结构。五糖核心通常连接2-4条分支,根据分支类型的不同,N糖基化蛋白细分为三种亚型,即:高甘露糖型、复杂型和杂合型。其中:(1)高甘露糖型N糖基化蛋白的糖链分支均由甘露糖组成;(2)复杂型N糖基化蛋白的糖链分支由乙酰葡糖胺、半乳糖(Gal)、唾液酸(Sia)等单糖按照特定的顺序依次连接而成;(3)杂合型N糖基化蛋白的糖链分支同时含有上述两种分支。
2、O-糖基化蛋白的O-糖基化发生在氨基酸残基Ser/Thr上,糖链还原末端与Ser/Thr的侧链羟基相连。与N-糖基化蛋白相比,O-糖基化蛋白的糖基化位点不具有保守性的蛋白特征序列,且存在多种核心结构。O-糖基化蛋白的糖链的单糖组成较为简单,但连接方式和亚型多,因此结构更为复杂,常见O-糖基化蛋白有以乙酰半乳糖胺(GalNAc)为还原末端的O-糖基化蛋白。
大量研究发现,异常的糖基化现象往往与疾病密切相关,包括癌症和先天性糖链缺陷等。糖基化修饰过程中形成的糖链结构异常蛋白已经被确定为病毒性疾病、糖尿病、自身免疫疾病、癌症、遗传性疾病等疾病的一种标志物,它在疾病的发生、进展和转移方面具有重要意义,也为疾病诊断和研究提供了一个新的诊断方法。目前,已发现的糖链结构异常蛋白包括:用于肝癌的AFP,用于卵巢癌的CA125,用于结肠癌的CEA和用于前列腺癌的PSA、与聚糖相关的标志物例如CA19-9、转铁蛋白、碱性磷酸酶、r-谷氨酰转移酶、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、T抗原、a1抗胰蛋白酶、前列腺酸性磷酸酶、结合珠蛋白、免疫球蛋白IgG、球蛋白A、血浆铜蓝蛋白等。
质谱检测(MS)是一种常用的对糖基化蛋白进行研究的方法,但是,目前采用质谱检测对糖基化蛋白(包括糖链结构异常蛋白)进行研究的手段主要包括将蛋白质水解成肽段和/或将蛋白质、肽段上的糖链解离成独立的糖链结构后,对肽段或糖链进行检测分析。另外,常见质谱检测分析仪在使用过程中均不能直接检测含有无机盐离子的蛋白质溶液,或使用含无机盐离子的液体作为流动相,无机盐离子在质谱检测雾化过程中会大量残留在质谱仪内部,从而影响质谱检测的准确性和质谱仪的使用寿命;而蛋白质分离、纯化常用的蛋白质保护溶液均含有无机盐离子,如:磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液等无机盐离子缓冲液;因此,蛋白质溶液在进行质谱检测前,必须通过各种手段或方法进行脱盐处理,如化学纯化法、色谱纯化法、蛋白电泳分离纯化法等;而不能直接进行质谱检测。所以,目前对糖基化蛋白采用质谱检测进行研究时,样本前处理的主要步骤包括:糖基化蛋白分离纯化、脱盐处理、蛋白酶水解成小片段肽段,和/或将蛋白质上的糖链进行解离成独立的糖链结构,再进行相应的质谱检测分析等。
上述各种糖基化蛋白质谱检测的前处理方法,必须经过酶切、糖链解离、脱盐等多步处理,才能对糖基化蛋白的糖链或糖肽进行质谱检测分析,操作复杂且价格昂贵,极大限制了作为质谱前处理方法的应用。
而且经过上述前处理方法后,质谱不是直接检测糖基化蛋白这类的大分子蛋白,例如直接检测相对分子量大于10000道尔顿(10KDa)的糖链结构异常蛋白,而是对糖基化蛋白的糖链或糖肽进行质谱检测分析,但是糖链的检测对疾病的诊断应用具有较大的限制作用,不适合直接用于相关疾病的诊断。有报道显示,通过释放糖链并进行质谱检测可以鉴别多种不同类型的糖链;然而,疾病的发生往往与特定蛋白的异常糖基化有关,单独的糖链分析无法准确识别是否为特定蛋白的异常糖基化糖链,对疾病的诊断应用具有较大的限制作用。
发明内容
针对上述问题和为了克服上述现有技术的不足,本发明提供了一种适合质谱检测的糖链结构异常蛋白的前处理组合物、前处理方法及应用;通过本发明提供的糖链结构异常蛋白的前处理组合物、方法及应用,所得到的糖链结构异常蛋白溶液无需经过再次的蛋白纯化、脱盐处理,酶切得到肽段、或糖链解离等步骤的单独处理或组合处理,即可直接进行质谱检测(MS)分析;对应用质谱检测(MS)检测人血液样本中大分子量的糖链结构异常蛋白提供重大且有效支持,并对质谱检测(MS)的快速发展,在临床疾病诊断的分级诊疗的推广应用均有着重要的应用价值和社会效益。
本发明提供一种适合质谱检测的糖链结构异常蛋白的前处理组合物,一种适合质谱检测的糖链结构异常蛋白的前处理组合物,其包括偶联有凝集素的载体和洗脱液,所述偶联有凝集素的载体用于特异性分离待测样本中的目标糖链结构异常蛋白,所述洗脱液用于洗脱偶联有凝集素的载体上吸附的目标糖链结构异常蛋白;其中:用于偶联凝集素的载体为高分子材料微球,所述洗脱液洗脱获得的目标糖链结构异常蛋白溶液直接用于质谱检测分析。所述偶联有凝集素的载体当然包括用于偶联凝集素的载体和与所述用于偶联凝集素的载体发生偶联的凝集素。
上述前处理组合物在某些实施方式中,所述目标糖链结构异常蛋白包括N-糖基化糖链结构异常蛋白、O-糖基化糖链结构异常蛋白中的至少一种。
上述前处理组合物在某些实施方式中,所述N-糖基化糖链结构异常蛋白包括高甘露糖型N糖基化糖链结构异常蛋白、复杂型N糖基化糖链结构异常蛋白和杂合型N糖基化糖链结构异常蛋白中的至少一种。
上述前处理组合物在某些实施方式中,所述N-糖基化糖链结构异常蛋白进一步可选为核心岩藻糖基化的N糖基化糖链结构异常蛋白。
上述前处理组合物在某些实施方式中,所述核心岩藻糖基化的N糖基化糖链结构异常蛋白更进一步可选为α-1,6-核心岩藻糖基化的N糖基化糖链结构异常蛋白。
上述前处理组合物在某些实施方式中,所述O-糖基化糖链结构异常蛋白进一步可选为以乙酰半乳糖胺(GalNAc)为还原末端的O-糖基化蛋白。
上述前处理组合物在某些实施方式中,所述糖链结构异常蛋白优选相对分子量大于等于10000道尔顿(10KDa)大分子量的糖链结构异常蛋白。
上述前处理组合物在某些实施方式中,所述目标糖链结构异常蛋白包括:用于肝癌诊断的核心岩藻糖基化糖链结构异常蛋白AFP-L3、用于类风湿性关节炎早期诊断的IgG糖链结构异常蛋白IgG0、用于IgA肾病诊断的IgA糖链结构异常蛋白IgA1、用于妊娠反应和肿瘤标志物诊断的人绒毛膜促性腺激素HCG中的至少一种。
上述前处理组合物在某些实施方式中,所述目标糖链结构异常蛋白同时包括:用于肝癌诊断的核心岩藻糖基化糖链结构异常蛋白AFP-L3、用于类风湿性关节炎早期诊断的IgG糖链结构异常蛋白IgG0、用于IgA肾病诊断的IgA糖链结构异常蛋白IgA1和用于妊娠反应和肿瘤标志物诊断的人绒毛膜促性腺激素HCG。
上述前处理组合物在某些实施方式中,每1ml用于偶联凝集素的高分子材料微球上偶联有1-30mg的凝集素。
上述前处理组合物在某些实施方式中,所述高分子材料微球的粒径分布范围为0.1μm-200μm。
上述前处理组合物在某些实施方式中,所述高分子材料微球的粒径分布范围为1μm-200μm或20μm-200μm。
上述前处理组合物在某些实施方式中,所述高分子材料微球的材质为环氧树脂、硅化物、聚苯乙烯、葡聚糖、琼脂糖、树脂、纤维素中的任意一种。
上述前处理组合物在某些实施方式中,所述高分子材料微球的材质还包括上述两种及以上高分子材料微球的复合物。
上述前处理组合物在某些实施方式中,所述偶联有凝集素的载体通过包括以下步骤的方法获得:将经过活化、已完全溶胀并清洗干净的高分子材料微球与凝集素混合反应;可选地,每1ml高分子材料微球要加入1-30mg凝集素;进一步可选地,所述高分子材料微球为琼脂糖微球;更进一步可选地,反应的条件为在0.1-1M碳酸盐缓冲液溶液中,室温条件下反应0.5-5h。
上述前处理组合物在某些实施方式中,所述凝集素包括:植物凝集素、动物凝集素。
上述前处理组合物在某些实施方式中,所述植物凝集素进一步可选为木菠萝凝集素(Jacalin)、花生凝集素(PNA)、豌豆凝集素(VVA和/或VVL)、刀豆凝集素A(ConA)、小扁豆凝集素(LCA)、麦胚素(WGA)、大豆凝集素(SBA)、芸豆凝集素(PVL)的任意一种。
上述前处理组合物在某些实施方式中,所述动物凝集素进一步可选为蜗牛凝集素(HAA和/或HPA)。
上述前处理组合物在某些实施方式中,所述凝集素还包括上述两种及以上凝集素的复合物。
上述前处理组合物在某些实施方式中,所述偶联有凝集素的载体包括偶联有小扁豆凝集素(LCA)的载体、偶联有芸豆凝集素(PVL)的载体、偶联有刀豆凝集素A(ConA)的载体或偶联有蜗牛凝集素(HAA)的载体中的至少一种。
上述前处理组合物在某些实施方式中,所述偶联有凝集素的载体同时包括偶联有小扁豆凝集素(LCA)的载体、偶联有芸豆凝集素(PVL)的载体、偶联有刀豆凝集素A(ConA)的载体和偶联有蜗牛凝集素的载体。
上述前处理组合物在某些实施方式中,所述分别偶联有小扁豆凝集素(LCA)、芸豆凝集素(PVL)、刀豆凝集素A(ConA)或蜗牛凝集素(HAA)的载体之间的体积比为1-2:1-2:1-2:1-2。即任意一偶联凝集素载体的体积不大于最小体积的偶联凝集素载体体积的2倍。
上述前处理组合物在某些实施方式中,所述洗脱液包括分析纯级以上的甲酸铵、乙酸铵、甲酸、乙酸、氨水、碳酸氢铵、碳酸铵、乙腈的任意一种水溶液。
上述前处理组合物在某些实施方式中,所述洗脱液包括分析纯级以上的甲酸铵、乙酸铵、甲酸、乙酸、氨水、碳酸氢铵、碳酸铵、乙腈的两种及以上的化学试剂的混合水溶液。
上述前处理组合物在某些实施方式中,所述前处理组合物还包括清洗液,用于清洗偶联有凝集素的载体上非特异性吸附的其他杂质。
上述前处理组合物在某些实施方式中,所述前处理组合物还包括人血白蛋白抗体-载体复合物(简称为HSA-载体复合物),用于去除洗脱液中因非特异性结合而残留的微量人血白蛋白。所述HSA-载体复合物包括用于偶联人血白蛋白(HSA)抗体的载体和与所述用于偶联人血白蛋白(HSA)抗体的载体发生偶联的人血白蛋白(HSA)抗体。
上述前处理组合物在某些实施方式中,所述人血白蛋白(HSA)抗体进一步优选为人血白蛋白(HSA)单克隆抗体。
上述前处理组合物在某些实施方式中,每1000ml用于偶联人血白蛋白(HSA)抗体的载体上至少偶联有1mg人血白蛋白(HSA)抗体。
上述前处理组合物在某些实施方式中,所述用于偶联人血白蛋白(HSA)抗体的载体包括高分子材料微球,可选地为粒径分布范围为0.1μm-200μm的高分子材料微球。
上述前处理组合物在某些实施方式中,所述用于偶联人血白蛋白(HSA)抗体的载体进一步可选为粒径分布范围为1μm-150μm或20μm-200μm的高分子材料微球。
上述前处理组合物在某些实施方式中,所述高分子材料微球的材质为环氧树脂、硅化物、聚苯乙烯、葡聚糖、琼脂糖、树脂、纤维素中的任意一种。
上述前处理组合物在某些实施方式中,所述高分子材料微球的材质还包括上述两种及以上高分子材料微球的复合物。
上述前处理组合物在某些实施方式中,所述偶联有人血白蛋白(HSA)抗体的载体通过包括以下步骤的方法获得:将经过活化、已完全溶胀并清洗干净的高分子材料微球与人血白蛋白抗体混合反应;可选地,人血白蛋白抗体的浓度不低于1mg/ml,每1ml人血白蛋白抗体与不超过1000ml的高分子材料微球混合;进一步可选地,所述高分子材料微球为琼脂糖微球;更进一步可选地,反应的条件为在0.1-1M碳酸盐缓冲液溶液中,室温条件下反应0.5-5h。
本发明还提供了一种适合质谱检测的糖链结构异常蛋白的前处理方法,所述前处理方法是应用上述前处理组合物的前处理方法,包括以下步骤:(1)使用前处理组合物中的偶联有凝集素的载体分离待测样本中的目标糖链结构异常蛋白的步骤;(2)使用前处理组合物中的洗脱液,洗脱偶联有凝集素的载体上特异性吸附的糖链结构异常蛋白的步骤;洗脱液洗脱后的糖链结构异常蛋白溶液直接用于质谱检测(MS)分析,即无需进行蛋白纯化,和/或脱盐处理,和/或酶切肽段,和/或糖链等步骤,即可直接进行质谱检测(MS)分析。
上述前处理方法在某些实施方式中,所述还包括使用前处理组合物中的清洗液,清洗偶联有凝集素的载体上非特异性吸附的其他类型蛋白质、糖、脂类等杂质的步骤。
上述前处理方法在某些实施方式中,还包括使用前处理组合物中的人血白蛋白抗体-载体复合物去除洗脱液中因非特异性结合而残留的微量人血白蛋白(HSA)的步骤;通过实施本步骤,能有效去除洗脱液中残留的微量人血白蛋白(HSA);由于质谱检测灵敏度非常高,分析灵敏度达到ppm级别,分离样本中的微量人血白蛋白(HSA)残留造成的质谱基线升高,对低丰度的样本分析造成干扰或形成漏检;且HSA和岩藻糖基化糖链结构异常蛋白分子量接近,均为66KDa,微量HSA残留容易造成岩藻糖基化糖链结构异常蛋白质谱检测分析的假阳性发生。
上述前处理方法在某些实施方式中,所述待测样本为人血液样本。
上述前处理方法在某些实施方式中,所述人血液样本进一步优选为人血清、血浆的任意一种样本类型。
本发明还提供了一种适合质谱检测的糖链结构异常蛋白的前处理组合物和前处理方法的应用,所述应用包括应用上述发明内容,即应用糖链结构异常蛋白前处理组合物和前处理方法处理样本中的糖链结构异常蛋白,前处理所得糖链结构异常蛋白溶液直接进行质谱检测分析的应用。
上述应用在某些实施方式中,所述质谱检测分析包括应用电喷雾电离技术(ESI)和基质辅助激光解析电离(MALDI)技术任意一种电离技术进行的质谱检测分析。
上述应用在某些实施方式中,所述质谱检测分析进一步优选为:包括应用双聚焦质谱仪检测分析,四极杆质谱仪检测分析,飞行时间质谱仪检测分析(TOF),离子阱质谱仪检测分析(IT),傅立叶变换质谱仪检测分析(FTICR)的任意一种质谱仪检测分析。
上述应用在某些实施方式中,所述质谱检测分析包括质谱检测的数据处理,优选为质谱图分析、质谱峰型面积计算、质谱图信息化处理的任意一种数据处理或上述两种及以上数据处理的组合处理分析。
有益效果:
与现有技术相比,应用本发明前处理组合物、前处理方法获得的样本中的糖链结构异常蛋白溶液具有以下优点:
(1)可以直接用于质谱检测分析,无需经过脱盐步骤、蛋白纯化步骤、糖链酶切解离或释放,多肽酶切等任意一步或多步的联合处理进行糖链结构异常蛋白溶液的脱盐、蛋白纯化、糖链结构的酶切解离或释放、多肽酶切等多个步骤后进行糖链的质谱检测;
(2)可以使用质谱直接识别所得糖链结构异常蛋白溶液中对应疾病类型的糖链结构异常蛋白,尤其是大分子糖链结构异常蛋白,从而进行疾病的诊断,而无需通过糖链进行分析;
(3)所得糖链结构异常蛋白溶液对质谱检测分析仪要求简单且不会因为无机盐离子的残留造成质谱检测分析仪测量不准确或仪器故障;此外,应用本发明还可以适配全自动磁珠法蛋白质分离纯化仪进行糖链结构异常蛋白的自动化分离纯化,为应用质谱检测方法检测糖链结构异常蛋白提供重大且有效支持,对质谱检测分析的快速发展,在临床疾病诊断中的推广应用有着重要的应用价值和社会效益。
(4)通过HAS-载体复合物的使用,在质谱检测分析前可进一步去除少量HSA因非特异性结合形成的残留,消除HSA对质谱分析的基线水平、核心岩藻糖基化糖链结构异常蛋白的特异性分析产生的影响。
(5)通过使用偶联有不同凝集素的载体,可实现一次性对全糖链、多种糖链结构异常蛋白的分离前处理。
附图说明
图1:AFP-L3阳性和健康正常人血清样本质谱检测对比图,横坐标为m/z,纵坐标为信号强度,目标糖链结构异常蛋白位于66KD处。
图2:健康正常人血清样本HSA-载体复合物处理前后质谱检测对比图,横坐标为m/z,纵坐标为信号强度,目标糖链结构异常蛋白位于66KD处。
图3:AFP-L3阳性样本血清、血浆质谱检测结果一致性分析,其中横坐标对应10例AFP-L3阳性血清样本的信号强度,纵坐标对应10例AFP-L3阳性血浆样本的信号强度。
图4:AFP-L3阳性样本血清、血浆质谱检测结果质谱对比图,横坐标为m/z,纵坐标为信号强度,目标糖链结构异常蛋白位于66KD处。
图5:HCG阳性样本中分别用N-糖基化和O-糖基化糖链结构异常蛋白的分离组合物分离和质谱检测结果一致性分析,其中横坐标对应采用O-糖基化糖链结构异常蛋白的前处理组合物处理检测的信号强度,纵坐标对应采用N-糖基化糖链结构异常蛋白的前处理组合物处理检测的信号强度。
图6:AFP-L3阳性样本两种前处理方法的质谱检测一致性分析,其中横坐标对应实施例5前处理组合物对样本处理检测获得的信号强度,纵坐标对应采用全糖链结构异常蛋白的前处理组合物处理检测的信号强度。
图7:IgG0阳性样本两种前处理方法的质谱检测一致性分析,其中横坐标对应实施例6前处理组合物对样本处理检测获得的信号强度,纵坐标对应采用全糖链结构异常蛋白的前处理组合物处理检测的信号强度。
图8:IgA1阳性样本两种前处理方法的质谱检测一致性分析,其中横坐标对应实施例7前处理组合物对样本处理检测获得的信号强度,纵坐标对应采用全糖链结构异常蛋白的前处理组合物处理检测的信号强度。
图9:HCG阳性样本两种前处理方法的质谱检测一致性分析,其中横坐标对应实施例8前处理组合物对样本处理检测获得的信号强度,纵坐标对应采用全糖链结构异常蛋白的前处理组合物处理检测的信号强度。
图10:阴性样本两种前处理方法的质谱检测一致性分析。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施案例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等,均为开放性的用语,即意指包含但不限于。
除非特殊说明,以下所用到的各种试剂均为商品化试剂,其中所用的化学试剂不低于分析纯。
本发明提供了一种适合质谱检测的糖链结构异常蛋白的前处理组合物、前处理方法及应用,应用本发明的前处理组合物、前处理方法获得的样本中的糖链结构异常蛋白溶液具有以下优点:(1)可以直接用于质谱检测分析,无需经过脱盐步骤、蛋白纯化步骤、糖链酶切解离或释放,多肽酶切等任意一步或多步的联合处理进行糖链结构异常蛋白溶液的脱盐、蛋白纯化、糖链结构的酶切解离或释放、多肽酶切等多个步骤后进行糖链的质谱检测;(2)可以使用质谱直接识别所得糖链结构异常蛋白溶液中对应疾病类型的糖链结构异常蛋白,从而进行疾病的诊断,而无需通过糖链进行分析;(3)所得糖链结构异常蛋白溶液对质谱检测分析仪要求简单且不会因为无机盐离子的残留造成质谱检测分析仪测量不准确或仪器故障,为应用质谱检测方法检测糖链结构异常蛋白提供有效支持。
糖基化是蛋白质形成过程中一种最常见的蛋白翻译后修饰,人体样本中50%以上的蛋白都具有糖基化修饰,对蛋白的结构和功能有着重要影响。其中两种主要类型的糖基化为:N-糖基化和粘蛋白型O-糖基化。其中:N-糖基化蛋白的N-糖基化发生在蛋白特征序列Asn-Xaa-Ser/Thr,糖链的还原末端通过Asn的侧链氨基与蛋白质相连。根据五糖核心的分支类型的不同,N糖基化蛋白细分为三种亚型,即:高甘露糖型、复杂型和杂合型;其中复杂型和杂合型的N-糖基化还原末端的乙酰葡糖胺(GlcNAc)与一个岩藻糖(Fuc)连接,形成核心岩藻糖结构的核心岩藻糖基化糖链结构异常蛋白。O-糖基化蛋白的O-糖基化发生在氨基酸残基Ser/Thr上,糖链还原末端与Ser/Thr的侧链羟基相连,常见O-糖基化蛋白以乙酰半乳糖胺(GalNAc)为还原末端的O-糖基化蛋白。
大量研究发现,异常的糖基化现象往往与疾病密切相关,包括癌症和先天性糖链缺陷等。糖基化修饰过程中形成的糖链结构异常蛋白已经被确定为病毒性疾病、糖尿病、自身免疫疾病、癌症、遗传性疾病等疾病的一种标志物,它在疾病的发生、进展和转移方面具有重要意义,也为疾病诊断和研究提供了一个新的诊断方法。目前,已发现的糖链结构异常蛋白包括:用于肝癌早期诊断的甲胎蛋白异质体(AFP-L3),即α-1,6-核心岩藻糖基化的N糖基化糖链结构异常蛋白;用于类风湿性关节炎(RA)早期诊断的IgG糖链结构异常蛋白(IgG0),其与N-糖链末端半乳糖缺失有关,属于复杂型N-糖基化糖链结构异常蛋白;用于IgA肾病早期诊断的IgA糖链结构异常蛋白(IgA1),其是IgA1分子铰链区O-糖链半乳糖基减少使IgA1发生异常糖基化,属于O-糖基化糖链结构异常蛋白(GalNAc);用于妊娠反应和肿瘤标志物诊断的人绒毛膜促性腺激素(HCG),其是一种N-糖基化和O-糖基化同时存在的糖基化异常蛋白,包括HCG的α亚基的2个N-糖基化和β亚基上的2个N-糖基化和4个O-糖基化。此外,还有用于前列腺癌诊断的前列腺特异性抗原(PSA),用于胰腺癌监测的癌抗原(CA19-9)和α-抗胰蛋白酶糖基化蛋白,用于乳腺癌监测的癌抗原15-3(CA15-3)、癌抗原(27-29)和人类表皮生长因子受体(HER-2),用于卵巢癌的CA125,用于结肠癌的CEA,以及与聚糖相关的标志物转铁蛋白、碱性磷酸酶、r-谷氨酰转移酶、T抗原、a1抗胰蛋白酶、前列腺酸性磷酸酶、结合珠蛋白、免疫球蛋白IgG、球蛋白A、血浆铜蓝蛋白等多种疾病的相关糖基化蛋白。
综上所述,为更好的说明本发明,下述实施案例均采用用于肝癌诊断的核心岩藻糖基化糖链结构异常蛋白(AFP-L3)、用于类风湿性关节炎(RA)早期诊断的IgG糖链结构异常蛋白(IgG0)、用于IgA肾病早期诊断的IgA糖链结构异常蛋白(IgA1)、用于妊娠反应和肿瘤标志物诊断的人绒毛膜促性腺激素(HCG)进行说明。
实施案例1前处理组合物中各部分的制备或组成
以下对本发明前处理组合物中可能包括的各部分的制备或组成进行说明,本发明前处理组合物中包括但不限于以下部分的一种或几种不同搭配。需要注意的是,本发明前处理组合物中的各部分相当于各自独立但使用时相互关联的组件,而非混合物中的各个组分。
1、偶联凝集素的载体制备
偶联凝集素载体、偶联有凝集素的载体均是指载体本体与凝集素发生偶联后形成的载体-凝集素偶联复合物。载体本体是指用于偶联凝集素的载体。
其中,用于偶联凝集素的载体包括高分子材料微球,可选地为粒径分布范围为0.1μm-200μm的高分子材料微球,进一步可选为粒径分布范围为1μm-150μm或20μm-200μm的高分子材料微球。
其中,高分子材料微球的材质为环氧树脂、硅化物、聚苯乙烯、葡聚糖、琼脂糖、树脂、纤维素中的任意一种。
其中,高分子材料微球的材质还包括上述两种及以上高分子材料微球的复合物。
其中凝集素包括:植物凝集素、动物凝集素和微生物凝集素。
其中,植物凝集素包括:木菠萝凝集素(Jacalin)、花生凝集素(PNA)、豌豆凝集素(VVA和/或VVL)、刀豆凝集素A(ConA)、小扁豆凝集素(LCA)、麦胚素(WGA)、大豆凝集素(SBA)、芸豆凝集素(PVL)、橘果孢粉凝集素(AAL)、蓖麻凝集素(RCA)、接骨木凝集素(SNA)等多种植物凝集素。动物凝集素包括:蜗牛凝集素(HAA和/或HPA)等。不同凝集素与对不同糖链异常蛋白具有不同的分离作用,单独使用特定的凝集素可以实现特定糖链异常蛋白的特定分离,不同凝集素之间的组合可以实现全糖链范围的糖链异常蛋白的分离。如:LCA、AAL对岩藻糖基化糖链异常蛋白的分离纯化;ConA、PVL、SBA、WGA、AAL等凝集素对N-糖链异常蛋白分离纯化;HAA、HPA、VVA、PNA、Jacalin等凝集素对O-糖基化蛋白的分离纯化。
其中,高分子材料微球直接与凝集素结合,形成高分子材料微球-凝集素偶联复合物,不同高分子材料微球通过微调节用于浸泡、冲洗、清洗、保存等步骤,均能达到与凝集素相结合的相同效果。
为更进一步说明本发明,以下实施案例均采用粒径分布范围20μm-200μm的琼脂糖高分子材料微球进行说明,所述琼脂糖高分子材料微球均为商品化的溴化氰活化的琼脂糖微球;所述溴化氰活化的琼脂糖微球优选为:琼脂糖4B(sephrose4B)、琼脂糖6B(sephrose6B)、琼脂糖FF(sephrose FF)琼脂糖CL-4B(sephrose CL-4B)琼脂糖CL-6B(sephrose CL-6B);为更进一步说明本发明,以下实施案例均以粒径为20μm-200μm,溴化氢活化的琼脂糖4B(sephrose 4B)为例进行说明,其购自瑞典Pharmacia公司。
针对不同糖链异常结构蛋白的主要形式,采用LCA、ConA、PVL、HAA(购自美国sigma公司)为代表,并通过LCA、ConA、PVL、HAA单独使用和组合使用实现用于肝癌诊断的核心岩藻糖基化糖链结构异常蛋白(AFP-L3)、用于类风湿性关节炎(RA)早期诊断的IgG糖链结构异常蛋白(IgG0)、用于IgA肾病早期诊断的IgA糖链结构异常蛋白(IgA1)、用于妊娠反应和肿瘤标志物诊断的人绒毛膜促性腺激素(HCG)等具有代表性的糖链结构异常蛋白的前处理和质谱检测,对本发明进行更进一步说明。
(1)LCA-琼脂糖高分子材料微球偶联凝集素载体的制备。
LCA和琼脂糖高分子材料微球通过以下步骤制备成LCA-琼脂糖高分子材料微球偶联凝集素载体:
a、称取溴化氢活化的琼脂糖4B 1g,加入pH2-3的1mM HCl溶液不少于200ml,混匀浸泡直至完全溶胀,用pH2-3的1mM HCl溶液在玻璃砂芯漏斗中清洗不低于15min,清洗结束后,收集完全溶胀的琼脂糖4B备用,完全溶胀的琼脂糖4B约3-5ml。
b、取0.1-1.0M的碳酸盐缓冲液溶液15ml,加入小扁豆凝集素,然后加入步骤a中收集的完全溶胀的琼脂糖4B,其中完全溶胀的琼脂糖4B体积(ml)与小扁豆凝集素(LCA,mg)的比例为1:1-1:30(即每1ml完全溶胀的琼脂糖4B与1-30mg小扁豆凝集素混合),室温混匀反应时间0.5h-5h,去上清;为更好的说明本发明,本实施案例中碳酸盐缓冲液溶液的使用浓度为0.1M,完全溶胀的琼脂糖4B体积(ml)与小扁豆凝集素(LCA,mg)的比例为1:10,即15ml碳酸盐缓冲液溶液加入5ml完全溶胀的琼脂糖4B和50mg LCA。
c、加入100ml 0.1M碳酸盐缓冲液,混匀去上清;然后加入200ml纯化水,混匀去上清。
d、加入1mol/L的乙醇胺(或0.2mol/L的甘氨酸溶液)20ml,室温混匀0.5-5h,封闭剩余活化基团。
e、用不少于完全溶胀的琼脂糖4B体积10倍体积的0.1mol/L pH4.0的醋酸盐缓冲液(含0.5mol/L的NaCL)和0.1mol/L pH8.0的Tris-HCl缓冲液(含0.5mol/L的NaCL)洗涤至少3次。
f、加入含0.1%BSA、1mmol/L CaCl2、0.1mmol/L MnCl2的PBS缓冲液洗涤一次,收集洗涤后的完全溶胀的琼脂糖4B,2-8℃保存备用。
(2)PVL-琼脂糖高分子材料微球偶联凝集素载体的制备。
PVL和琼脂糖高分子材料微球通过以下步骤制备成PVL-琼脂糖高分子材料微球偶联凝集素载体:
a、称取溴化氢活化的琼脂糖4B 1g,加入pH2-3的1mM HCl溶液不少于200ml,混匀浸泡直至完全溶胀,用pH2-3的1mM HCl溶液在玻璃砂芯漏斗中清洗不低于15min,清洗结束后,收集完全溶胀的琼脂糖4B备用,完全溶胀的琼脂糖4B约3-5ml。
b、取0.1-1.0M的碳酸盐缓冲液溶液15ml,加入芸豆凝集素,然后加入步骤a中收集的完全溶胀的琼脂糖4B,其中完全溶胀的琼脂糖4B体积(ml)与芸豆凝集素(PVL,mg)的比例为1:1-1:30(即每1ml完全溶胀的琼脂糖4B与1-30mg芸豆凝集素混合),室温混匀反应时间0.5h-5h,去上清;为更好的说明本发明,本实施案例中碳酸盐缓冲液溶液的使用浓度为0.1M,完全溶胀的琼脂糖4B体积(ml)与芸豆凝集素(PVL,mg)的比例为1:10,即15ml碳酸盐缓冲液溶液加入5ml完全溶胀的琼脂糖4B和50mg PVL。
c、加入100ml 0.1M碳酸盐缓冲液,混匀去上清;然后加入200ml纯化水,混匀去上清。
d、加入1mol/L的乙醇胺(或0.2mol/L的甘氨酸溶液)20ml,室温混匀0.5-5h,封闭剩余活化基团。
e、用不少于完全溶胀的琼脂糖4B体积10倍体积的0.1mol/L pH4.0的醋酸盐缓冲液(含0.5mol/L的NaCL)和0.1mol/L pH8.0的Tris-HCl缓冲液(含0.5mol/L的NaCL)洗涤至少3次。
f、加入含0.1%BSA、1mmol/L CaCl2、0.1mmol/L MnCl2的PBS缓冲液洗涤一次,收集洗涤后的完全溶胀的琼脂糖4B,2-8℃保存备用。
(3)HAA-琼脂糖高分子材料微球偶联凝集素载体的制备
HAA和琼脂糖高分子材料微球通过以下步骤制备成HAA-琼脂糖高分子材料微球偶联凝集素载体:
a、称取溴化氢活化的琼脂糖4B 1g,加入pH2-3的1mM HCl溶液不少于200ml,混匀浸泡直至完全溶胀,用pH2-3的1mM HCl溶液在玻璃砂芯漏斗中清洗不低于15min,清洗结束后,收集完全溶胀的琼脂糖4B备用,完全溶胀的琼脂糖4B约3-5ml。
b、取0.1-1.0M的碳酸盐缓冲液溶液15ml,加入蜗牛凝集素(HAA),然后加入步骤a中收集的完全溶胀的琼脂糖4B,其中完全溶胀的琼脂糖4B体积(ml)与蜗牛凝集素(HAA,mg)的比例为1:1-1:30(即每1ml完全溶胀的琼脂糖4B与1-30mg蜗牛凝集素HAA混合),室温混匀反应时间0.5h-5h,去上清;为更好的说明本发明,本实施案例中碳酸盐缓冲液溶液的使用浓度为0.1M,完全溶胀的琼脂糖4B体积(ml)与蜗牛凝集素(HAA,mg)的比例为1:10,即15ml碳酸盐缓冲液溶液加入5ml完全溶胀的琼脂糖4B和50mg HAA。
c、加入100ml 0.1M碳酸盐缓冲液,混匀去上清;然后加入200ml纯化水,混匀去上清。
d、加入1mol/L的乙醇胺(或0.2mol/L的甘氨酸溶液)20ml,室温混匀0.5-5h,封闭剩余活化基团。
e、用不少于完全溶胀的琼脂糖4B体积10倍体积的0.1mol/L pH4.0的醋酸盐缓冲液(含0.5mol/L的NaCL)和0.1mol/L pH8.0的Tris-HCl缓冲液(含0.5mol/L的NaCL)洗涤至少3次。
f、加入含0.1%BSA、1mmol/L CaCl2、0.1mmol/L MnCl2的PBS缓冲液洗涤一次,收集洗涤后的完全溶胀的琼脂糖4B,2-8℃保存备用。
(4)ConA-琼脂糖高分子材料微球偶联凝集素载体的制备
ConA和琼脂糖高分子材料微球通过以下步骤制备成ConA-琼脂糖高分子材料微球偶联凝集素载体:
a、称取溴化氢活化的琼脂糖4B 1g,加入pH2-3的1mM HCl溶液不少于200ml,混匀浸泡直至完全溶胀,用pH2-3的1mM HCl溶液在玻璃砂芯漏斗中清洗不低于15min,清洗结束后,收集完全溶胀的琼脂糖4B备用,完全溶胀的琼脂糖4B约3-5ml。
b、取0.1-1.0M的碳酸盐缓冲液溶液15ml,加入刀豆凝集素A(ConA),然后加入步骤a中收集的完全溶胀的琼脂糖4B,其中完全溶胀的琼脂糖4B体积(ml)与刀豆凝集素A(ConA,mg)的比例为1:1-1:30(即每1ml完全溶胀的琼脂糖4B与1-30mg刀豆凝集素A混合),室温混匀反应时间0.5h-5h,去上清;为更好的说明本发明,本实施案例中碳酸盐缓冲液溶液的使用浓度为0.1M,完全溶胀的琼脂糖4B体积(ml)与刀豆凝集素(ConA,mg)的比例为1:10,即15ml碳酸盐缓冲液溶液加入5ml完全溶胀的琼脂糖4B和50mg。
c、加入100ml 0.1M碳酸盐缓冲液,混匀去上清;然后加入200ml纯化水,混匀去上清。
d、加入1mol/L的乙醇胺(或0.2mol/L的甘氨酸溶液)20ml,室温混匀0.5-5h,封闭剩余活化基团。
e、用不低于完全溶胀的琼脂糖4B体积10倍体积的0.1mol/L pH4.0的醋酸盐缓冲液(含0.5mol/L的NaCL)和0.1mol/L pH8.0的Tris-HCl缓冲液(含0.5mol/L的NaCL)洗涤至少3次。
f、加入含0.1%BSA、1mmol/L CaCl2、0.1mmol/L MnCl2的PBS缓冲液洗涤一次,收集洗涤后的完全溶胀的琼脂糖4B,2-8℃保存备用。
(5)混合琼脂糖高分子材料微球偶联凝集素载体的制备
将上述(1)、(2)、(3)、(4)中制备的LCA-琼脂糖高分子材料微球偶联凝集素载体、PVL-琼脂糖高分子材料微球偶联凝集素载体、HAA-琼脂糖高分子材料微球偶联凝集素载体、ConA-琼脂糖高分子材料微球偶联凝集素载体以适当比例混合制备而成。为进一步说明本实施案例,采用琼脂糖高分子材料微球偶联凝集素载体的体积比为1:1:1:1的(分别偶联有LCA、PVL、HAA、ConA)混合琼脂糖高分子材料微球偶联凝集素载体进行说明。
2、偶联凝集素载体的清洗液制备
偶联凝集素载体的清洗液为20mmol TRIS-HCl或PBS缓冲液,PH值6.0-9.0,为更进一步说明本发明,以下实施案例采用20mmol TRIS-HCl缓冲液,PH值6.5。
3、偶联凝集素载体洗脱液制备
众所周知,由于质谱检测(MS)时禁止使用含有无机盐离子的溶液作为流动相,无机盐离子在质谱检测时由于其不挥发性,易度塞质谱检测的柱体,致使检测结果不准确,且对质谱仪本身具有着比较大的伤害,因此质谱检测前,分离的糖蛋白溶液会经过脱盐步骤处理,常用的脱盐处理步骤包括蛋白电泳,色谱技术分离,透析分离等多个步骤环节,操作过程比较复杂,且色谱分离价格比较昂贵,极大限制色谱质谱检测的联合使用。
因此,本发明为克服上述困难,在通过偶联凝集素载体分离糖链结构异常蛋白过程中采用分析纯级以上的甲酸铵、乙酸铵、甲酸、乙酸、氨水、碳酸氢铵、醋酸铵的任意一种,或两种及以上的化学试剂混合物的水溶液,进行洗脱,洗脱后的糖链结构异常蛋白溶液可以直接用于色谱分析,对色谱检测柱无损伤,且对糖链结构异常蛋白结构及糖链结构无影响,保证了检测结果的准确性。
分析纯级以上的甲酸铵、乙酸铵、甲酸、乙酸、氨水、碳酸氢铵、碳酸铵、乙腈等共同具有易挥发性,且在质谱检测雾化过程中没有无机盐离子残留,对色谱检测柱无损伤,且对糖链结构异常蛋白结构及糖链结构无影响,保证了检测结果的准确性。上述不同化学试剂之间以及任意两种及以上化学试剂混合物溶液均能达到同样的糖链结构异常蛋白分离洗脱效果。所述偶联凝集素载体的洗脱液的浓度为0.01%-1%之间,优选浓度为0.05%-0.5%。
为更进一步说明本发明,以下实施案例采用0.2%乙酸铵水溶液作为偶联凝集素载体的洗脱液进行说明。
4、HSA-载体复合物制备
由于人体血液样本中成分异常复杂,且含有大量的人血白蛋白(HSA)、球蛋白、纤维蛋白等20余种高丰度蛋白,占蛋白总量的99%以上;其中,HSA在健康人血液样本中的含量约为42mg/ml,占总蛋白含量中约占60%左右,分子量为66KD,与核心岩藻糖基化糖链结构异常蛋白分子量相似;在使用偶联凝集素载体富集糖基化蛋白过程中会有少量HSA因非特异性结合形成残留,残留的HSA对质谱分析的基线水平、核心岩藻糖基化糖链结构异常蛋白的特异性分析有影响,容易在低浓度下形成假阳性,因此在质谱检测分析前可进一步去除HSA残留。
HSA抗体与用于偶联HAS抗体的载体发生偶联制备形成HSA载体复合物。HSA抗体为商品化的HSA抗体,HSA抗体的浓度不低于1mg/ml;为更好的说明本发明,本实施案例HSA抗体为来源开景基因的HSA单克隆抗体,抗体标识浓度为2mg/ml。
HSA载体复合物的载体为高分子材料微球,所述高分子材料微球可以是粒径分布范围与实施案例1的步骤1中高分子材料微球相同或相近、或同一粒径和材质的高分子材料微球。为进一步说明本实施案例,本步骤采用的与步骤1中相同且粒径为20μm-200μm的溴化氢活化的琼脂糖4B进行说明。
HSA-载体复合物制的制备步骤如下:
a、称取溴化氢活化的琼脂糖4B 1g,加入pH2-3的1mM HCl溶液不少于200ml,混匀浸泡直至完全溶胀,用pH2-3的1mM HCl溶液在玻璃砂芯漏斗中清洗不低于15min,清洗结束后,收集完全溶胀的琼脂糖4B备用,完全溶胀的琼脂糖4B约3-5ml。
b、取0.1-1.0M的碳酸盐缓冲液溶液50ml,加入HSA单克隆抗体,然后加入步骤a中收集的完全溶胀的琼脂糖4B;其中每1ml HSA单克隆抗体与不超过1000ml的琼脂糖磁珠混匀备用,室温混匀反应时间0.5h-5h,去上清;为更好的说明本发明,本实施案例中碳酸盐缓冲液溶液的使用浓度为0.1M,HSA单克隆抗体(ml)与完全溶胀的琼脂糖4B体积(ml)的比例为1:1000,即50ml碳酸盐缓冲液溶液中加入5ml完全溶胀的琼脂糖4B和5ul HSA单克隆抗体。
c、加入100ml 0.1M碳酸盐缓冲液,混匀去上清;然后加入200ml纯化水,混匀去上清。
d、加入1mol/L的乙醇胺(或0.2mol/L的甘氨酸溶液)20ml,室温混匀0.5-5h,封闭剩余活化基团。
e、用不低于完全溶胀的琼脂糖4B体积10倍体积的0.1mol/L pH4.0的醋酸盐缓冲液(含0.5mol/L的NaCL)和0.1mol/L pH8.0的Tris-HCl缓冲液(含0.5mol/L的NaCL)洗涤至少3次。
f、加入含0.1%BSA、1mmol/L CaCl2、0.1mmol/L MnCl2的PBS缓冲液洗涤一次,收集洗涤后的完全溶胀的琼脂糖4B,2-8℃保存备用。
实施案例2适合质谱检测的糖链结构异常蛋白的前处理组合物
本发明提供了一种适合质谱检测的糖链结构异常蛋白的前处理组合物,所述前处理组合物包含实施案例1中所得的偶联凝集素载体、偶联凝集素载体的洗脱液。
其中,适合质谱检测的糖链结构异常蛋白的前处理组合物,进一步还可以包含实施案例1中所得的偶联凝集素载体清洗液。
其中,适合质谱检测的糖链结构异常蛋白的前处理组合物,进一步还可以包含实施案例1中所得的HSA-载体复合物。
其中,糖链结构异常蛋白包括N-糖基化糖链结构异常蛋白、O-糖基化糖链结构异常蛋白中的至少一种。
其中,所述N-糖基化糖链结构异常蛋白包括高甘露糖型N糖基化糖链结构异常蛋白、复杂型N糖基化糖链结构异常蛋白和杂合型N糖基化糖链结构异常蛋白中的至少一种。
其中,所述N-糖基化糖链结构异常蛋白进一步可选为核心岩藻糖基化的N糖基化糖链结构异常蛋白。
其中,所述核心岩藻糖基化的N糖基化糖链结构异常蛋白更进一步可选为α-1,6-核心岩藻糖基化的N糖基化糖链结构异常蛋白。
其中,所述O-糖基化糖链结构异常蛋白进一步可选为以乙酰半乳糖胺(GalNAc)为还原末端的O-糖基化蛋白。
其中,所述糖链结构异常蛋白优选相对分子量大于等于10000道尔顿(10KDa)大分子量的糖链结构异常蛋白。
为更进一步说明本发明,以下实施案例中均采用下述组合物做进一步说明:
1、N-糖基化糖链结构异常蛋白的前处理组合物包括实施案例1中的:PVL-琼脂糖高分子材料微球偶联凝集素载体和/或ConA-琼脂糖高分子材料微球偶联凝集素载体,偶联凝集素载体的清洗液、偶联凝集素载体的洗脱液、HSA-载体复合物。
2、N-糖基化中岩藻糖基化糖链结构异常蛋白的前处理组合物,将其单独列举出来,但本领域技术人员知道其属于N-糖基化蛋白前处理组合物中的一种,包括实施案例1中的:LCA-琼脂糖高分子材料微球偶联凝集素载体、偶联凝集素载体的清洗液、偶联凝集素载体的洗脱液、HSA-载体复合物。
3、O-糖基化糖链结构异常蛋白的前处理组合物包括实施案例1中的:HAA-琼脂糖高分子材料微球偶联凝集素载体、偶联凝集素载体的清洗液、偶联凝集素载体的洗脱液、HSA-载体复合物。
4、N-糖基化、O-糖基化的全糖链结构异常蛋白的前处理组合物包括实施案例1中的:(LCA、ConA、PVL、HAA)混合琼脂糖高分子材料微球偶联凝集素载体、偶联凝集素载体的清洗液、偶联凝集素载体的洗脱液、HSA-载体复合物。
5、其他形式的前处理组合物:每种前处理组合物中均包含偶联凝集素载体的清洗液、偶联凝集素载体的洗脱液、HSA-载体复合物,不同的是实施案例1中不同种偶联凝集素载体的组合形式,即可以是实施案例1中两种偶联凝集素载体的组合,也可以是实施案例1中三种偶联凝集素载体的组合。
实施案例3适合质谱检测的糖链结构异常蛋白的前处理方法
本发明提供了一种适合质谱检测的糖链结构异常蛋白的前处理方法,包括应用实施案例2中所述的糖链结构异常蛋白的前处理组合物对目标样本进行前处理的各个步骤,进一步包括以下步骤:将目标样本与实施案例2中前处理组合物中的偶联凝集素载体混匀、孵育以吸附目标糖链结构异常蛋白,之后从样本中将偶联凝集素载体分离出来,用前处理组合物中的清洗液对其进行清洗,再用前处理组合物中的洗脱液对其进行洗脱;可选地,洗脱后的溶液进一步采用前处理组合物中的HSA-载体复合物处理。所得处理后溶液可直接用于各类质谱检测分析,无需经过其他步骤处理。实施案例2中的不同糖基化蛋白前处理组合物的操作步骤均相同,所述前处理步骤均严格按照说明书或操作SOP进行。
其中,目标样本包括分离后的血清或血浆样本。
其中,糖链结构异常蛋白的相对分子量优选为相对分子量不小于10000道尔顿(10KDa)大分子量的糖链结构异常蛋白。
其中,所述糖链结构异常蛋白的前处理方法包括使用实施例案例2(1)-(5)中的至少一种组合物进行糖链结构异常蛋白的前处理方法:
(1)N-糖基化糖链结构异常蛋白的前处理组合物;
(2)岩藻糖基化糖链结构异常蛋白的前处理组合物;
(3)O-糖基化糖链结构异常蛋白的前处理组合物;
(4)全糖基化糖链结构异常蛋白的前处理组合物;
(5)其他形式的前处理组合物。
(1)所述糖链结构异常蛋白前处理步骤包括:
应用上述(1)-(5)前处理组合物对目标样本进行前处理的步骤包括:
(1)取分离套管一套,内部套管底部有孔径小于所述琼脂糖高分子材料微球的粒径的过滤装置,在分离套管的内部套管中加入混匀的琼脂糖高分子材料微球偶联凝集素载体0.5-2ml,静置3-10min,使琼脂糖高分子材料微球偶联凝集素载体完全沉降,且琼脂糖高分子材料微球偶联凝集素载体的保护液完全流出,放入外部套管备用。
(2)取分离后的血清或血浆样本50-500ul,加入不低于1倍体积的清洗液混匀,将混匀后的样本加入到步骤1的分离套管中,静置,37℃孵育10-30min。
(3)取下外部套管,将套管内残留液体弃去,加入不低于500ul清洗液,静置,待清洗液全部流出。
(4)重复步骤(3)1-5次,必要时,每次清洗后,均使用离心机不超过5000rpm离心1min。
(5)加入不低于步骤(2)中混合溶液体积的洗脱液,静置,收集静置过程流出洗脱液备用;必要时,为洗脱更为充分,将加入洗脱液的分离套管置37℃孵育10-30min静置,不超过5000rpm离心1min,收集洗脱液备用。
(6)取分离套管一套,内部套管底部有孔径小于所述琼脂糖高分子材料微球的粒径的过滤装置,在分离套管的内部套管中加入混匀的HSA-载体复合物0.5-2ml,静置1-10min,使HSA-载体复合物完全沉降,且HSA-载体复合物的保护液完全流出。
(7)加入不低于HSA-载体复合物体积的洗脱液,冲洗HSA-载体复合物1-5次,放入外部套管备用。
(8)将步骤(5)中的洗脱液加入步骤(7)中,室温静置不超过30min,收集静置过程流出洗脱液备用;必要时,将加入洗脱液的分离套管置37℃孵育不超过30民,使用离心机不超过5000rpm离心1min,收集洗脱液备用。
步骤(8)收集的洗脱液可直接用于各类质谱检测分析,无需经过其他步骤处理,且检测结果无高浓度的HSA因非特异性吸附造成的假阳性。
所述的不同的糖基化糖链结构异常蛋白前处理试剂盒操作步骤均相同,所述前处理步骤及均严格按照说明书或操作SOP进行。
为更进一步说明本实施案例,所述糖链结构异常蛋白前处理步骤均采用下述具体步骤说明:
(1)取分离套管一套,内部套管底部有孔径小于所述琼脂糖高分子材料微球的粒径的过滤装置,在分离套管的内部套管中加入混匀的琼脂糖高分子材料微球偶联凝集素载体1.0ml,静置5min,使琼脂糖高分子材料微球偶联凝集素载体完全沉降,且琼脂糖高分子材料微球偶联凝集素载体的保护液完全流出,放入外部套管备用。
(2)取分离后的血清或血浆样本200ul,加入400ul清洗液混匀,将混匀后的样本加入到步骤1的分离套管中,静置,37℃孵育10min。
(3)取下外部套管,将套管内残留液体弃去,加入1ml清洗液,静置,待清洗液全部流出;重复3次,然后3000rpm离心1min,弃去液体。
(5)加入600ul洗脱液,37℃静置孵育10min,3000rpm离心1min,收集洗脱液备用。
(6)取分离套管一套,内部套管底部有孔径小于所述琼脂糖高分子材料微球的粒径的过滤装置,在分离套管的内部套管中加入混匀的HSA-载体复合物1.0ml,静置5min,使HSA-载体复合物完全沉降,且HSA-载体复合物的保护液完全流出。
(7)加入1ml洗脱液,冲洗HSA-载体复合物3次,放入外部套管备用。
(8)将步骤(5)中的洗脱液加入步骤(7)中,37℃静置5min,3000rpm离心1min,收集洗脱液备用。
实施案例4
本发明提供了一种适合质谱检测的糖链结构异常蛋白的前处理组合物、前处理方法及应用,通过上述实施案例,实现了对样本中的糖链结构异常蛋白精准分离纯化,且分离纯化后的样本可以直接用于各类质谱检测(MS),无需经过脱盐步骤、蛋白纯化步骤、糖链酶切解离或释放,多肽酶切等任意一步或多步的联合处理进行糖链结构异常蛋白溶液的脱盐、蛋白纯化、糖链结构的酶切解离或释放、多肽酶切等多个步骤,可直接进行质谱检测,对质谱检测分析仪要求简单且不会因为因无机盐离子的残留造成的质谱检测分析仪测量不准确或仪器故障,为应用质谱检测方法检测糖链结构异常蛋白提供重大而且有效的支持,对因糖链结构异常蛋白引起的病毒性疾病、糖尿病、自身免疫疾病、癌症、遗传性疾病等的筛查和体外诊断是一种重大突破,引起重大变革。
通过本发明及实施案例3所获得的糖链结构异常蛋白溶液可直接用于质谱检测分析(MS),所述质谱检测分析(MS)包括应用电喷雾电离技术(ESI)和基质辅助激光解析电离(MALDI)技术任意一种电离技术进行的质谱检测分析,所述质谱检测分析进一步优选为:包括应用双聚焦质谱仪检测分析,四极杆质谱仪检测分析,飞行时间质谱仪检测分析(TOF),离子阱质谱仪检测分析(IT),傅立叶变换质谱仪检测分析(FTICR)的任意一种质谱仪检测分析,包括使用所述试剂盒质谱检测后的数据处理步骤,包括:质谱图分析、质谱峰型面积计算、质谱图信息化处理的任意一种或者两种以上处理步骤的的组合分析。
不同质谱检测分析仪对适用样本要求相同,均不能使用包含无机盐离子的糖链结果异常蛋白质溶液,但是质谱检测对样本的最终质谱结果分析均是相同的。
因此,以下实施案例采用基于基质辅助激光解析电离(MALDI)技术的飞行时间质谱仪检测分析仪(MALDI-TOF)进行样本的质谱检测与分析。
实施案例5
本发明提供了一种适合质谱检测的糖链结构异常蛋白的前处理组合物、前处理方法及应用,为进一步说明本发明,以下各实施案例分别收集不同类型的糖链结构异常蛋白呈阳性的患者样本各10例,将收集的样本按照实施案例1-4中提供的前处理组合物和前处理方法进行样本的前处理和质谱检测分析。
本实施案例以收集AFP-L3阳性血清样本和正常健康人血清样本各10例为例进行说明。
将AFP-L3阳性血清样本和正常健康人血清样本各10例按照实施案例1-4中提供的前处理组合物和前处理方法进行样本的前处理和质谱检测分析;前处理使用的是实施案例2中的岩藻糖基化糖链结构异常蛋白的前处理组合物,即含有LCA-琼脂糖高分子材料微球偶联凝集素载体的前处理组合物。
同时收集与血清样本为相同来源的AFP-L3阳性血浆样本,用于评价血清、血浆样本前处理和质谱检测的效果;AFP-L3阳性血浆样本前处理使用的也是实施案例2中的岩藻糖基化糖链结构异常蛋白的前处理组合物之一,即含有LCA-琼脂糖高分子材料微球偶联凝集素载体的前处理组合物。
AFP-L3阳性血清样本和AFP-L3阳性血浆样本在使用实施例2中的岩藻糖基化蛋白前处理组合物进行前处理时,都使用了HSA-载体复合物。
正常健康人血清样本在前处理时,每份血清样本同时处理2份样品,其中一份样品在样品前处理时不使用HSA-载体复合物去除微量HSA残留,直接使用洗脱液进行质谱检测,用于评价HSA-载体复合物去除微量HSA残留的效果;正常健康人血清样本前处理使用的也是实施案例2中的岩藻糖基化糖链结构异常蛋白的前处理组合物,即含有LCA-琼脂糖高分子材料微球偶联凝集素载体的前处理组合物。
AFP-L3阳性血清样本和血浆样本及正常健康人血清样本前处理后的质谱检测分析结果详见表1、表2、图1和图2。
表1:10例AFP-L3阳性血清样本和健康正常人血清样本前处理后质谱检测结果
表2:10例健康正常人血清样本HSA-载体复合物处理前后质谱检测结果
根据结果详见表1、表2、图1和图2结果分析,应用本发明方法,能有效分离样本中α-1,6-岩藻糖基化糖链结构异常蛋白,即AFP-L3(分子量66KD),对分离后的糖链结构异常蛋白进行质谱检测分析(MS),杂峰很少,图谱清晰,在66KD处能有效检测AFP-L3,且能有效区分肝癌确诊患者(HCC)和健康正常人的分析结果。如果使用了HAS-载体复合物,其能有效去除样本中残留的HAS(分子量66KD)干扰,使HSA检测结果降到基线水平,对肝癌临床早期诊断应用具有非常高的诊断应用价值。
使用岩藻糖基化糖链结构异常蛋白前处理组合物对10例AFP-L3阳性的相同来源血清、血浆样本分别进行前处理,收集前处理后的溶液进行质谱分析;分析血清血浆样本之间检测差异;结果详见表3和图3、、图4。
表3:AFP-L3阳性样本血清、血浆前处理后质谱检测对比表
根据表3和图3、图4结果显示,AFP-L3阳性样本血清、血浆质谱检测无差异,相关系数R2为0.991;因此,人血清、血浆样本通过实施案例1-4的糖链结构异常蛋白的前处理组合物、方法得到的蛋白质溶液,通过质谱检测分析无差异,具有相同的效果。
以上所有样本均同时使用热景生物技术股份有限公司化学发光试剂盒进行检测,检测结果完全符合。
实施案例6
本实施案例以收集IgG0阳性血清样本和正常健康人血清样本各10例为例进行说明。
将IgG0阳性血清样本和正常健康人血清样本各10例按照实施案例1-4提供的前处理组合物和前处理方法进行样本的前处理和质谱检测分析;由于IgG0(分子量146KD)属于复杂型N-糖基化糖链结构异常蛋白,本次实施例前处理使用的前处理组合物是N-糖基化糖链结构异常蛋白前处理组合物之一,其中包括PVL-琼脂糖高分子材料微球偶联凝集素载体,而不包括ConA-琼脂糖磁珠偶联凝集素载体。
IgG0阳性血清样本和正常健康人血清样本在使用实施例2中的N-糖基化糖链结构异常蛋白前处理组合物进行前处理时,都使用了HSA-载体复合物。
IgG0阳性血清样本和正常健康人血清样本前处理后的质谱检测分析结果详见表4。
表4IgG0阳性血清样本与健康人血清样本前处理后质谱检测结果
根据表4中前处理组合物对样本中IgG0的前处理及质谱检测分析,在146KD处能有效分离IgG0阳性样本中的IgG0,与健康人群在146KD处能有效区分,且在146KD处无其他杂峰。将上述两种血清样本更换为相同来源的血浆样本,能得到同样的结论。因此,N-糖基化糖链结构异常蛋白前处理组合物能有效富集样本中的IgG0,并直接进行质谱检测,为由IgG0糖链异常蛋白引起的类风湿类疾病的质谱检测建立新的、有效的前处理方法。
以上所有样本的检测结果与类风湿病的临床诊断完全符合。
实施案例7
本实施案例以收集IgA1阳性样本和正常健康人血清样本各10例为例进行说明。
将IgA1阳性血清样本和正常健康人血清样本各10例按照实施案例1-4的前处理组合物和前处理方法进行样本的前处理和质谱检测分析。由于IgA1(分子量150KD)属于O-糖基化糖链结构异常蛋白,本实施例样本前处理使用的是实施例2中的O-糖基化糖链结构异常蛋白前处理组合物,即含有HAA-琼脂糖高分子材料微球偶联凝集素载体。
IgA1阳性血清样本和正常健康人血清样本在使用实施例2中的N-糖基化蛋白前处理组合物进行前处理时,都使用了HSA-载体复合物。
IgA1阳性血清样本和正常健康人血清样本前处理后的质谱检测分析结果详见表5。
表5 IgA1阳性血清样本与健康人样本前处理后质谱检测结果
根据表5中前处理组合物对样本中IgA1的前处理及质谱检测分析,在150KD处能有效分离IgA1阳性样本中的IgA1,与健康人群在150KD处能有效区分,且在150KD处无其他杂峰。将上述两种血清样本更换为相同来源的血浆样本,能得到同样的结论。因此,O-糖基化糖链结构异常蛋白前处理组合物能有效富集样本中的IgA1,并直接进行质谱检测,为由IgA1糖链结构异常蛋白引起的IgA肾病的质谱检测建立新的、有效的前处理方法。
实施案例8
本实施案例以收集HCG阳性血清样本和正常健康人血清样本各10例为例进行说明。
由于HCG是一种N-糖基化和O-糖基化同时存在的糖链结构异常蛋白,包括HCG的α亚基的2个N-糖基化和β亚基上的2个N-糖基化和4个O-糖基化,分子量为36.7KD。本实施案例分别使用实施案例2中的N糖基化糖链结构异常蛋白的前处理组合物和O-糖基化糖链结构异常蛋白的前处理组合物按照实施案例3-4提供的前处理方法对10例HCG阳性血清样本和10例健康正常人血清样本分别进行前处理,其中,N-糖基化糖链结构异常蛋白的前处理组合物包含ConA和PVL两种凝集素载体(体积比1:1),O-糖基化糖链结构异常蛋白前处理组合物包含HAA-琼脂糖高分子材料微球偶联凝集素载体,并且在进行前处理时,都使用了HSA-载体复合物。收集前处理后的溶液进行质谱分析,并对N-糖基化和O-糖基化两种糖链结构异常蛋白的前处理样品的质谱检测结果进分析,分析N-糖基化和O-糖基化针对HCG样品的检测结果的一致性。
将各10例HCG阳性血清样本和正常健康人血清样本按照实施案例1-4的步骤进行样本的前处理和质谱检测分析。HCG阳性血清样本和正常健康人血清样本前处理后的质谱检测分析结果详见结果详见表6、表7和图5。
表6:HCG阳性血清样本与健康人样本N-糖基化糖链结构异常蛋白的前处理组合物进行前处理后质谱检测结果
表7:HCG阳性血清样本与健康人样本O-糖基化糖链结构异常蛋白的前处理组合物进行前处理后质谱检测结果
根据表6、表7和图5的糖链结构异常蛋白前处理组合物对样本中HCG的前处理及质谱检测分析,N-糖基化和O-糖基化在36.7KD处均能有效分离HCG阳性血清样本中的HCG,与健康人群在36.7KD处能有效区分,且在36.7KD处无其他杂峰。N-糖基化糖链结构异常蛋白前处理组合物和O-糖基化糖链结构异常蛋白前处理组合物在分离富集HCG阳性样本中的HCG的分离效果时无差别,相关性R2=0.9908,分离后的糖链结构异常蛋白溶液均能满足直接质谱检测分析的需求。将上述两种血清样本更换为相同来源的血浆样本,能得到同样的结论。
因此,针对HCG此类的N-糖基化和O-糖基化同时存在的糖链结构异常蛋白的分离、富集可选择N-糖基化和O-糖基化对应的糖链结构异常蛋白前处理组合物的任意一种糖链结构异常蛋白前处理组合物即可完成对应糖链结构异常蛋白的前处理,并可直接用于质谱检测分析,无HSA残留的干扰;为由HCG糖基化蛋白升高引起的相关疾病,尤其是滋养细泡肿瘤、异位HCG的肿瘤如:肺部肿瘤、干母细胞癌、肾癌、肾上腺皮质癌等的质谱检测建立新的、有效的前处理方法,使得质谱检测在此类疾病诊断中的应用得以快速发展。
实施案例9
本实施案例使用实施案例2中的N-糖基化、O-糖基化的全糖链结构异常蛋白前处理的组合物,即包括LCA、ConA、PVL、HAA的混合琼脂糖高分子材料微球偶联凝集素载体的糖链结构异常蛋白的前处理组合物,按照实施案例1-4的步骤分别处理上述各10例的AFP-L3阳性血清样本、IgG0阳性血清样本、IgA1阳性血清样本、HCG阳性血清样本和正常健康人血清样本,收集前处理后的溶液进行质谱检测分析,并与实施案例5-8的质谱检测结果进行一致性分析,结果详见图6、图7、图8、图9。正常健康人血清样本对4种糖链结构异常蛋白都做了检测,结果相类似,仅以其中之一为例。
根据图6-图9检测结果分析,使用全糖链结构异常蛋白前处理组合物、和分别使用N-糖基化糖链结构异常蛋白前处理组合物、岩藻糖基化糖链结构异常蛋白前处理组合物、O-糖基化糖链结构异常蛋白前处理组合物对同一样本进行前处理,并对前处理收集的样本直接进行质谱检测,分析样本中特定的糖链结构异常蛋白的质谱检测结果,检测结果一致性较好,其中AFP-L3阳性样本、IgG0阳性样本、IgA1阳性样本、HCG阳性样本的R2分别为:0.9879、0.9934、0.9903、0.9887。正常健康人样本两种前处理方法的质谱检测结果无相关性,但所有检测结果均在基线范围内(信号强度不大于1000),如图10所示。
将上述血清样本更换为相同来源的血浆样本,能得到同样的结论。
由此可见,应用本发明,针对不同疾病诊断对应的特异性糖链结构异常蛋白的前处理,应用不同类型的,并与之相对应的糖链结构异常蛋白前处理组合物及前处理方法,均能达到同样的前处理效果和质谱检测分析方法。
上述说明示出并描述了本发明的优选实施案例,如前所述,应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式,不应看作是对其他实施案例的排除,而可用于各种其他组合、修改和环境,并能够在本文所述发明构想范围内,通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围,则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。