WO2024001249A1 - 一种定性检测母乳中中性低聚糖的方法 - Google Patents

一种定性检测母乳中中性低聚糖的方法 Download PDF

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neutral oligosaccharides
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qualitatively detecting
detecting neutral
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张明辉
乔为仓
赵军英
贾舸
王亚玲
刘妍
陈璟瑶
刘茜
杨宝雨
杨轶涵
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Definitions

  • the present application relates to the field of detection, and in particular to a method for qualitative detection of neutral oligosaccharides in breast milk.
  • HMOs human milk oligosaccharides
  • Gal galactose
  • Glc glucose
  • GlcNAc N-acety lglucosamine
  • Fuc fucose
  • Sia sialic acid It is polymerized from basic monosaccharides [17].
  • the form of sialic acid in breast milk is N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac).
  • HMOs are generally divided into two categories based on their chemical charge: neutral oligosaccharides composed of uncharged monosaccharides (Glu, Gal, GlcNAc, Fuc) and acidic oligosaccharides with negatively charged residues of Neu5Ac.
  • Neutral oligosaccharides account for 86-88% of the total HMOs.
  • Breast milk oligosaccharides have functions such as promoting brain development, regulating intestinal flora, antiviral, preventing necrotizing enterocolitis, and regulating epithelial cells and immune cells.
  • Breast milk may contain thousands of oligosaccharides, but due to geographical differences, lactation stage, mode of delivery, genetics and other factors, the types and contents of HMOs will vary.
  • HMOs can be detected qualitatively and quantitatively through methods such as capillary electrophoresis, liquid chromatography, liquid chromatography-mass spectrometry, and ion chromatography.
  • methods such as capillary electrophoresis, liquid chromatography, liquid chromatography-mass spectrometry, and ion chromatography.
  • HMOs can be detected qualitatively and quantitatively through methods such as capillary electrophoresis, liquid chromatography, liquid chromatography-mass spectrometry, and ion chromatography.
  • the purpose of this application is to provide a method for qualitative detection of neutral oligosaccharides in breast milk, which can achieve the separation, extraction and qualitative detection of neutral oligosaccharides in breast milk.
  • this application provides a method for qualitative detection of neutral oligosaccharides in breast milk, which has the characteristics of Yes, follow the steps below:
  • step (6) Analyze the eluate collected in step (5) by liquid chromatography, wherein post-column liquid addition is performed during the liquid chromatography process, and the added reagent is a methanol solution of formic acid.
  • the specific centrifugation conditions in step (1) are centrifugation at 8000-10000 rpm for 25-35 minutes at 3-5°C.
  • the centrifugation conditions are centrifugation at 10000 rpm for 30 minutes at 4°C.
  • step (2) the volume ratio of the volume of ethanol added to the intermediate layer product obtained in step (1) is 2-3:1, preferably 2:1.
  • the ambient temperature for the static reaction is minus 17 to minus 23°C, and the reaction time is 25-35 min.
  • the ambient temperature is minus 20°C, and the reaction time is 30 min.
  • the specific centrifugation conditions are centrifugation at 3000-5000g for 25-35 minutes at 3-5°C.
  • the centrifugation conditions are centrifugation at 4000g for 30 minutes at 4°C.
  • the first chromatography column used is Cleanert IC-A, and is activated with ultrapure water before adsorption.
  • the second chromatography column used is Sep-Pak C18, and is equilibrated with methanol and rinsed with an ultrapure aqueous solution of 0.1-0.5% TFA before adsorption.
  • the concentration of the methanol solution of formic acid is 1-2%.
  • the method provided by this application for the qualitative detection of neutral oligosaccharides in breast milk allows the method to characterize 17 neutral oligosaccharides in breast milk and accurately Mass spectrometry fragment information, 7 of which were accurately and qualitatively determined. Suitable for large-scale analysis of breast milk samples.
  • Figure 1 is the total ion current diagram of Comparative Example 2 in positive ion mode
  • Figure 2 is a total ion current diagram of Example 1 in positive ion mode
  • Figure 3 is the total ion current diagram of Comparative Example 3.
  • Figure 4 is a total ion current diagram of Example 1;
  • Figure 5 is the total ion current diagram of Comparative Example 4.
  • Figure 6 shows the secondary mass spectrum of the neutral oligosaccharide numbered N1 when the collision energy is 20V.
  • Figure 7 is the secondary mass spectrum of the neutral oligosaccharide numbered N2 when the collision energy is 20V;
  • Figure 8 is the secondary mass spectrum of the neutral oligosaccharide numbered N3 when the collision energy is 20V;
  • Figure 9 is the secondary mass spectrum of the neutral oligosaccharide numbered N4 when the collision energy is 20V;
  • Figure 10 is the secondary mass spectrum of the neutral oligosaccharide numbered N5 when the collision energy is 25V;
  • Figure 11 is the secondary mass spectrum of the neutral oligosaccharide numbered N6 when the collision energy is 25V;
  • Figure 12 is the secondary mass spectrum of the neutral oligosaccharide numbered N7 when the collision energy is 25V.
  • the breast milk samples in this application come from an equal volume mixture of breast milk from 50 different healthy mothers who gave birth at full term and voluntarily participated. All of them have been approved by the ethics committee of their respective hospitals, and all of them have signed an "Informed Consent".
  • the embodiments of this application provide a method for qualitatively detecting neutral oligosaccharides in breast milk.
  • the collected eluate was analyzed by liquid mass spectrometry.
  • the parameters of the liquid chromatography are: analytical column Dionex IonPacTMAS19 (2 ⁇ 250mm), guard column Dionex IonPacTMAG19 (2 ⁇ 50mm), electrochemical detector, column temperature: 35°C.
  • Mobile phase A ultrapure water
  • mobile phase D 200mmol/L NaOH solution.
  • Suppressor current 495mA
  • flow rate 2mL/min.
  • Elution conditions 0-2 min, 95% A and 5% D; 25 min, 80% A and 20% D; 45 min, 70% A and 30% D; 45.1 min, 95% A and 5% D.
  • a methanol solution of 1% concentration of formic acid was added after the column, with a flow rate of 0.012 mL/min.
  • the parameters of the mass spectrometry are: detection using Q Exactive detector.
  • the spray voltage is 3.5kV
  • the sheath gas pressure is 35arb
  • the auxiliary gas pressure is 10arb
  • the heating temperature is 350°C
  • the capillary temperature is 320°C
  • the collision energy is 20-25V
  • 500 -2000m/z substances are scanned in Full MS/dd-MS2 mode.
  • the remaining steps in this comparative example are the same as those in Example 1, and the only difference lies in the elution conditions of liquid chromatography.
  • the elution conditions of this comparative example are 0-2 min, 95% A and 5% D; 2.1-40 min, 85% A and 15% D; 40.1-45 min. time, 95% A and 5% D.
  • Example 1 The total ion chromatograms of Example 1 and Comparative Example 2 were measured respectively, as shown in Figures 1-2. It can be seen from Figure 1-2 that most of the neutral oligosaccharides in Comparative Example 2 were eluted within the first 17 minutes, but the separation effect between them was not obvious. However, in the technical solution in Example 1, each The separation effect of sexual oligosaccharides is obvious. That is, this application makes the separation effect of each neutral oligosaccharide more significant through the specific selection of liquid chromatography elution conditions.
  • the remaining steps in this comparative example are the same as those in Example 1. The only difference lies in the scanning mode of the mass spectrometer.
  • the scanning mode in this comparative example is the negative ion mode.
  • Example 1 of the present application can achieve the separation of 17 neutral breast milk oligosaccharides in breast milk.
  • the method provided in Example 1 of the present application can achieve the qualitative analysis of 7 of the above 17 neutral breast milk oligosaccharides.
  • Figures 5-11 are respectively the secondary mass spectra of numbers N1-N7 when the collision energy is 20 or 25V. From the above-mentioned secondary mass spectra, it can be seen that the method described in Example 1 of the present application is effective for the neutrality of numbers N1-N7. All oligosaccharides can be qualitatively analyzed by producing characteristic fragment ions. This neutral oligosaccharide can be qualitatively analyzed.

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Abstract

一种定性检测母乳中中性低聚糖的方法，依次按下述步骤进行：(1)将母乳离心，去除上层脂肪和蛋白质，取离心产物的中间层；(2)加入乙醇，静置反应；(3)离心，取上清；(4)上样至第一层析柱吸附，用超纯水洗脱，收集洗脱液，氮吹干燥；(5)将干燥的洗脱产物复溶，上样至第二层析柱，用0.1-0.5％TFA的超纯水溶液洗脱，收集洗脱液；(6)将步骤(5)收集的洗脱液通过液质联用进行分析，其中，在液相色谱的过程中进行柱后加液，所添加的试剂为甲酸的甲醇溶液。通过对提取工艺以及液相色谱和质谱参数的特定选择，使得可以定性母乳中的17种中性低聚糖，并通过精确质谱碎片信息，准确定性测定其中的7种。

Description

一种定性检测母乳中中性低聚糖的方法
交叉引用
本申请要求在中国专利局提交的、申请号为202210758976.X、申请日为2022年06月30日、申请名称为“一种定性检测母乳中中性低聚糖的方法”的中国专利申请的优先权，该申请的全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本申请涉及检测领域，特别涉及一种定性检测母乳中中性低聚糖的方法。
背景技术
在母乳中，母乳低聚糖(HMOs)是3-10个单糖由共价键连接组成的短链聚合物。HMOs由半乳糖(Galactose,Gal)，葡萄糖(Glucose,Glc)，N-乙酰氨基葡萄糖(N-acety lglucosamine,GlcNAc)，岩藻糖(Fucose,Fuc)和唾液酸(Sialic acid,Sia)五种基础单糖聚合而成[17]。其中唾液酸在母乳中存在形式是N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)。HMOs通常根据其化学电荷可分为两类：不含电荷的单糖(Glu，Gal，GlcNAc，Fuc)组成的中性低聚糖和带有Neu5Ac负电荷残基的酸性低聚糖。中性低聚糖占HMOs总量的86-88％。母乳低聚糖具有促进大脑发育，调节肠道菌群，抗病毒，预防坏死性小肠结肠炎和调节上皮细胞和免疫细胞等功能。母乳中可能含有上千种低聚糖，但由于地理差异、泌乳阶段、分娩方式和遗传基因等因素的影响，会导致HMOs种类和含量发生变化。目前可以通过毛细管电泳、液相色谱、液相色谱-质谱和离子色谱等方法对HMOs进行定性定量的检测。HMOs种类繁多，且含量和种类变化复杂，用奶粉模拟母乳是特别复杂且困难的事情。建立对母乳中HMOs定性检测的方法，对母乳中不同种类的低聚糖进行含量变化的研究，总结出HMOs的种类和含量变化规律，这将以便于以后对婴幼儿配方奶粉中HMOs的添加提供依据，有利于配制出与中国母乳较为接近的婴幼儿配方奶粉。
因鉴于此，特提出此申请。
发明内容
本申请的目的旨在提供一种定性检测母乳中中性低聚糖的方法，该方法可实现对母乳中中性低聚糖的分离提取和定性检测。
为了实现上述目的，本申请提供了一种定性检测母乳中中性低聚糖的方法，其特征 在于，依次按下述步骤进行：
(1)将母乳离心，去除上层脂肪和蛋白质，取离心产物的中间层；
(2)加入乙醇，静置反应；
(3)离心，取上清；
(4)上样至第一层析柱吸附，用超纯水洗脱，收集洗脱液，氮吹干燥；
(5)将干燥的洗脱产物复溶，上样至第二层析柱，用0.1-0.5％TFA的超纯水溶液洗脱，收集洗脱液；
(6)将步骤(5)收集的洗脱液通过液质联用进行分析，其中，在液相色谱的过程中进行柱后加液，所添加的试剂为甲酸的甲醇溶液。
优选或可选地，步骤(1)中离心的具体条件为3-5℃下8000-10000rpm离心25-35min，优选的，离心条件为4℃下10000rpm离心30min。
优选或可选地，步骤(2)中，加入乙醇的体积与步骤(1)中获得的中间层产物的体积比为2-3:1，优选为2:1。
优选或可选地，步骤(2)中，静置反应的环境温度为零下17-零下23℃，反应时间为25-35min，优选的，环境温度为零下20℃，反应时间为30min。
优选或可选地，步骤(3)中，离心的具体条件为3-5℃下3000-5000g离心25-35min，优选的，离心条件为4℃下4000g离心30min。
优选或可选地，步骤(4)中，所使用的第一层析柱为Cleanert IC-A，且在吸附前经超纯水活化。
优选或可选地，步骤(5)中，所使用的第二层析柱为Sep-Pak C18，且在吸附前经甲醇平衡并用0.1-0.5％TFA的超纯水溶液冲洗。
优选或可选地，步骤(6)中，所述的甲酸的甲醇溶液的浓度为1-2％。
本申请提供的定性检测母乳中中性低聚糖的方法，通过对提取工艺以及液相色谱和质谱参数的特定选择，使该方法可以定性母乳中的17种中性低聚糖，并通过精确质谱碎片信息，准确定性测定其中的7种。适用于大规模的母乳样品的分析工作。
附图说明
图1为对比例2在正离子模式下的总离子流图；
图2为实施例1在正离子模式下的总离子流图；
图3为对比例3的总离子流图；
图4为实施例1的总离子流图；
图5位对比例4的总离子流图；
图6为编号为N1的中性低聚糖在碰撞能量为20V时的二级质谱图
图7为编号为N2的中性低聚糖在碰撞能量为20V时的二级质谱图；
图8为编号为N3的中性低聚糖在碰撞能量为20V时的二级质谱图；
图9为编号为N4的中性低聚糖在碰撞能量为20V时的二级质谱图；
图10为编号为N5的中性低聚糖在碰撞能量为25V时的二级质谱图；
图11为编号为N6的中性低聚糖在碰撞能量为25V时的二级质谱图；
图12为编号为N7的中性低聚糖在碰撞能量为25V时的二级质谱图。
具体实施方式
以下对本申请的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本申请，并不用于限制本申请。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本申请中母乳样品来自于50位不同的足月分娩、自愿参加的健康母亲的母乳的等体积混合，均经各自属地医院伦理委员会批注，且均签署《知情同意书》。
在采集时，与上午9:00-11:00间采集，乳母对婴儿哺乳，并采用吸奶器西区一侧乳房的乳汁，置于冷冻管内，在-20℃下保存，各来源的样品均收集完毕后，解冻，等体积混合后，置于-80℃下保存备用。
实施例1
本申请实施例提供了一种定性检测母乳中中性低聚糖的方法。
取1mL母乳样品，在4℃下以10000rpm离心，以去除上层脂肪和少量蛋白质，取中心层，并转移到离心管中，加入两倍体积的无水乙醇，在-20℃下静置反应30min。
反应完成后，在4℃下以4000g离心30min，取上清液。
将上清液上样至经10mL超纯水活化后静置10min的Cleanert IC-A柱内，使用5mL超纯水洗脱，收集洗脱液，并将收集的洗脱液氮吹干燥，得到的固体用1mL 0.1％TFA的超纯水溶液复溶。
将复溶后的样品上样到先经5mL甲醇平衡，后用10mL0.1％TFA的超纯水溶液冲洗过的Sep-Pak C18柱内，收集洗脱液，并将洗脱液上样，重复该过程两次，以使样品中的中性低聚糖被柱充分的吸附。
最后使用3mL 0.1％TFA的超纯水溶液洗脱，收集洗脱液。
将收集到的洗脱液通过液质联用的方式进行分析。
其中，液相色谱的参数为：分析柱Dionex IonPacTMAS19(2×250mm)，保护柱Dionex IonPacTMAG19(2×50mm)，电化学检测器，柱温：35℃。流动相A：超纯水，流动相D：200mmol/L NaOH溶液。抑制器电流：495mA，流速：2mL/min。洗脱条件：0-2min，95％A和5％D；25min时，80％A和20％D；45min时，70％A和30％D；45.1min时，95％A和5％D。且在柱后加入1％浓度的甲酸的甲醇溶液，流量为0.012mL/min。
质谱的参数为：采用Q Exactive检测器进行检测。使用电喷雾离子源，喷雾电压为3.5kV，鞘气压力为35arb，辅气压力为10arb，加热温度为350℃，毛细管温度为320℃，碰撞能量为20-25V，在正离子模式下对500-2000m/z的物质进行Full MS/dd-MS2模式扫描。
对比例1
取1mL母乳样品，在4℃下以10000rpm离心，以去除上层脂肪和少量蛋白质，取中心层，并转移到离心管中，加入两倍体积的无水乙醇，在-20℃下静置反应30min。
反应完成后，在4℃下以4000g离心30min，取上清液。
将上清液上样至经10mL超纯水活化后静置10min的Cleanert IC-A柱内，使用5mL超纯水洗脱，收集洗脱液，并将收集的洗脱液氮吹干燥，得到的固体用1mL 0.1％TFA的超纯水溶液复溶。
用10mL 50％乙腈活化Bond Elut NH2小柱，分别将前述步骤得到的上清液和复溶后的样品各1mL上样至柱床上，分别用3mL 90％乙腈洗脱后收集洗脱液，将各洗脱液氮吹吹干后用1mL的0.1％TFA的超纯水溶液复溶。
效果实施例1
分别测定实施例1和对比例1-2种所述方法的对于母乳样品中乳糖的去除率，结果如表1所示。
表1乳糖去除率结果表
对比例2
本对比例其余步骤均与实施例1相同，区别仅在于液相色谱洗脱条件不同。本对比例的洗脱条件为0-2min，95％A和5％D；2.1-40min时，85％A和15％D；40.1-45min 时，95％A和5％D。
效果实施例2
分别测定实施例1和对比例2的总离子流图，如图1-2所示。由图1-2可以看出，对比例2中大部分的中性低聚糖在前17min内被洗脱，但是彼此间的分离效果并不明显，而实施例1中的技术方案，各中性低聚糖的分离效果则很明显。即，本申请通过对于液相色谱洗脱条件的特定选择，使各中性低聚糖的分离效果更加显著。
对比例3
本对比例其余步骤均与实施例1相同，区别仅在于质谱的扫描模式不同，本对比例的扫描模式为负离子模式。
效果实施例3
分别测定实施例1和对比例3的总离子流图，如图3-4所示。由图3-4可以看出，对比例3的成像清晰度和分离效果要原差于实施例1的技术方案。即，本申请通过对于质谱扫描模式的特定选择，使最终的中性低聚糖的分离效果更加显著。
对比例4
本对比例其余步骤均与实施例1相同，区别仅在于本对比例省略了柱后加液步骤。
效果实施例4
测定对比例4的总离子流图，如图5所示。由图5可以看出，在省略柱后加液步骤后，总离子流图中并无中性低聚糖的特征峰出现，仅有溶剂的特征峰。即，省略柱后加液步骤无法实现中性低聚糖的分离。
效果实施例5
采用实施例1中所述的方法对母乳样品进行测定，测定结果如表2和3所示。
表2样品中中性低聚糖质谱结果表

表3 7种中性低聚糖的定性信息
由表1可以看出，本申请实施例1中提供的方法可以实现对于母乳中的17种中性母乳低聚糖的分离。由表2可以看出，本申请实施例1中提供的方法可以实现上述17种中性母乳低聚糖中7种的定性分析。
进一步的，请参考图6-12。图5-11分别为编号N1-N7在碰撞能量20或25V时的二级质谱图，由上述的二级质谱图可知，本申请实施例1中所述的方法对于编号N1-N7的中性低聚糖均可通过产生的特征碎片离子对该种中性低聚糖进行定性分析。
以上详细描述了本申请的优选实施方式，但是，本申请并不限于上述实施方式中的具体细节，在本申请的技术构思范围内，可以对本申请的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本申请的保护范围。
此外，本申请的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本申请的思想，其同样应当视为本申请所公开的内容。
工业实用性
本申请涉及一种定性检测母乳中中性低聚糖的方法，通过对提取工艺以及液相色谱和质谱参数的特定选择，使该方法可以定性母乳中的17种中性低聚糖，并通过精确质谱碎片信息，准确定性测定其中的7种。

Claims (8)

  1. 一种定性检测母乳中中性低聚糖的方法，其特征在于，依次按下述步骤进行：
    (1)将母乳离心，去除上层脂肪和蛋白质，取离心产物的中间层；
    (2)加入乙醇，静置反应；
    (3)离心，取上清；
    (4)上样至第一层析柱吸附，用超纯水洗脱，收集洗脱液，氮吹干燥；
    (5)将干燥的洗脱产物复溶，上样至第二层析柱，用0.1-0.5％TFA的超纯水溶液洗脱，收集洗脱液；
    (6)将步骤(5)收集的洗脱液通过液质联用进行分析，其中，在液相色谱的过程中进行柱后加液，所添加的试剂为甲酸的甲醇溶液。
  2. 根据权利要求1所述的定性检测母乳中中性低聚糖的方法，其特征在于，步骤(1)中离心的具体条件为3-5℃下8000-10000rpm离心25-35min，优选的，离心条件为4℃下10000rpm离心30min。
  3. 根据权利要求1所述的定性检测母乳中中性低聚糖的方法，其特征在于，步骤(2)中，加入乙醇的体积与步骤(1)中获得的中间层产物的体积比为2-3:1，优选为2:1。
  4. 根据权利要求1所述的定性检测母乳中中性低聚糖的方法，其特征在于，步骤(2)中，静置反应的环境温度为零下17-零下23℃，反应时间为25-35min，优选的，环境温度为零下20℃，反应时间为30min。
  5. 根据权利要求1所述的定性检测母乳中中性低聚糖的方法，其特征在于，步骤(3)中，离心的具体条件为3-5℃下3000-5000g离心25-35min，优选的，离心条件为4℃下4000g离心30min。
  6. 根据权利要求1所述的定性检测母乳中中性低聚糖的方法，其特征在于，步骤(4)中，所使用的第一层析柱为Cleanert IC-A，且在吸附前经超纯水活化。
  7. 根据权利要求1所述的定性检测母乳中中性低聚糖的方法，其特征在于，步骤(5)中，所使用的第二层析柱为Sep-Pak C18，且在吸附前经甲醇平衡并用0.1-0.5％TFA的超纯水溶液冲洗。
  8. 根据权利要求1所述的定性检测母乳中中性低聚糖的方法，其特征在于，步骤(6)中，所述的甲酸的甲醇溶液的浓度为1-2％。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114994214B (zh) * 2022-06-30 2023-02-24 北京三元食品股份有限公司 一种定性检测母乳中中性低聚糖的方法
CN115480023B (zh) * 2022-11-03 2023-03-21 中轻检验认证有限公司 一种检测乳及乳制品中母乳低聚糖的组成单糖含量的方法

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003047402A (ja) * 2001-08-06 2003-02-18 Meiji Milk Prod Co Ltd 中性オリゴ糖含有育児用調製乳
JP2007297521A (ja) * 2006-04-28 2007-11-15 Noguchi Inst 多様性を表現するオリゴ糖またはその誘導体
CN107192771A (zh) * 2017-05-04 2017-09-22 中国农业科学院农产品加工研究所 母乳低聚糖快速定性定量的方法
CN107621399A (zh) * 2016-07-14 2018-01-23 北京三元食品股份有限公司 一种检测母乳中低聚糖的方法
CN109270176A (zh) * 2018-08-22 2019-01-25 中国农业科学院农产品加工研究所 羊乳寡糖测定方法
CN110161147A (zh) * 2019-06-19 2019-08-23 北京三元食品股份有限公司 乳中游离低聚糖的高通量定量测定方法
CN112526022A (zh) * 2020-11-27 2021-03-19 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 一种乳中母乳低聚糖的检测方法
CN113686992A (zh) * 2021-08-31 2021-11-23 黑龙江飞鹤乳业有限公司 检测配方食品中目标母乳低聚糖的方法
CN114994214A (zh) * 2022-06-30 2022-09-02 北京三元食品股份有限公司 一种定性检测母乳中中性低聚糖的方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021064629A1 (en) * 2019-10-01 2021-04-08 Glycom A/S Separation of neutral oligosaccharides from fermentation broth
CN114177187A (zh) * 2021-12-10 2022-03-15 西北大学 富含α2，6-唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖在制备免疫调节药物或功能食品中的应用

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003047402A (ja) * 2001-08-06 2003-02-18 Meiji Milk Prod Co Ltd 中性オリゴ糖含有育児用調製乳
JP2007297521A (ja) * 2006-04-28 2007-11-15 Noguchi Inst 多様性を表現するオリゴ糖またはその誘導体
CN107621399A (zh) * 2016-07-14 2018-01-23 北京三元食品股份有限公司 一种检测母乳中低聚糖的方法
CN107192771A (zh) * 2017-05-04 2017-09-22 中国农业科学院农产品加工研究所 母乳低聚糖快速定性定量的方法
CN109270176A (zh) * 2018-08-22 2019-01-25 中国农业科学院农产品加工研究所 羊乳寡糖测定方法
CN110161147A (zh) * 2019-06-19 2019-08-23 北京三元食品股份有限公司 乳中游离低聚糖的高通量定量测定方法
CN112526022A (zh) * 2020-11-27 2021-03-19 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 一种乳中母乳低聚糖的检测方法
CN113686992A (zh) * 2021-08-31 2021-11-23 黑龙江飞鹤乳业有限公司 检测配方食品中目标母乳低聚糖的方法
CN114994214A (zh) * 2022-06-30 2022-09-02 北京三元食品股份有限公司 一种定性检测母乳中中性低聚糖的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GIANCARLO VERARDO, IRENE DUSE, ALESSANDRO CALLEA: "Analysis of underivatized oligosaccharides by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry with post-column addition of formic acid", THE RELATIONSHIP BETWEEN THE ELECTROSPRAY IONIZATION BEHAVIOUR AND BIOLOGICAL ACTIVITY OF SOME PHOSPHINO CU(I) COMPLEXES., RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY : RCM 15 JUN 2010 LNKD- PUBMED:20486256, VOL. 24, NR. 11, PAGE(S) 1610 - 1616, vol. 23, no. 11, 15 June 2009 (2009-06-15), pages 1607 - 1618, XP009551993, ISSN: 1097-0231, DOI: 10.1002/rcm.4047 *

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