CN114177187A - 富含α2，6-唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖在制备免疫调节药物或功能食品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种富含α2，6‑唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖在制备免疫调节药物或功能食品中的应用，添加富含α2,6‑连接的唾液酸化羊乳游离寡糖能够提高RAW264.7细胞的细胞增殖能力、细胞吞噬能力、NO分泌量和酸性磷酸酶活力，显著上调RAW264.7细胞中TNF‑α、IL‑10、IL‑6和IL‑1α基因mRNA的表达量，同时通过上调MAPKs信号通路中的p38丝裂原活化蛋白激酶、细胞外信号调节激酶(ERK)和c‑Jun氨基末端激酶(JNK)的表达来发挥免疫调节作用。本发明中富含α2,6‑连接的唾液酸化羊乳游离寡糖对功能性配方食品的开发利用具有重要意义。

Description

富含α2，6-唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖在制备免疫调节 药物或功能食品中的应用
技术领域
本发明涉及一种富含α2，6-唾液酸修饰的酸性游离寡糖在制备免疫调节药物或功能食品中的应用。
背景技术
免疫系统分为先天性免疫和适应性免疫，具有免疫监视、防御和调节功能。巨噬细胞负责抗原处理和抗原特异性T细胞的呈递等过程，并通过释放各种炎症因子和细胞因子来抵抗外界病原体的感染，如：白细胞介素(IL)，干扰素(IFN)，肿瘤坏死因子(TNF)等。当外部刺激与巨噬细胞表面的受体识别，就会激活多种不同的信号通路，如丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号通路。大量研究表明，母乳喂养不仅为婴儿的生长发育提供所需营养，而且还可以降低病原体感染的概率，这表明饮食可能直接影响免疫系统。因此，开发利用母乳中能够调节免疫系统的活性组分具有重要的研究价值和经济价值。
母乳低聚糖(HMOs)是除乳糖和脂类外第三大固形物，是一种天然的免疫调节剂，有助于新生儿粘膜的发育，从而通过抵御早期生命中病原体的感染来促进新生儿免疫系统的发展。HMOs由D-葡萄糖、D-半乳糖、N-乙酰己糖胺、L-岩藻糖和唾液酸五种单糖组成，已被鉴定150种以上。根据结构中存在的单糖组成，游离寡糖可以划分为中性寡糖分和酸性游离寡糖分。由于母乳低聚糖结构复杂多样，利用化学或生物合成方法完全复制仍然存在困难。因此，从天然来源的动物乳汁中分离纯化低聚糖来模拟母乳对新生儿免疫系统的构建已引起人们的关注。
发明内容
羊乳是婴幼儿配方奶粉的常用乳基配料，低聚糖的含量是牛乳的4-10倍，与母乳更接近。在前期的研究中，我们发现唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖的含量约占70％，其含量远高于其它反刍动物乳汁的含量，唾液酸的类型有N-乙酰神经氨酸和N-羟乙酰神经氨酸，唾液酸连接方式主要有α2，3-和α2，6-。然而，目前关于羊乳酸性游离寡糖的免疫活性研究尚未报道。有鉴于此，本发明的目的在于提供一种富含α2，6-唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖在制备免疫调节药物或功能食品中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
富含α2，6-唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖在制备免疫调节药物或功能食品中的应用。
进一步地，富含α2，6-唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖在制备增加免疫药物或功能食品中的应用。
进一步地，富含α2，6-唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖中α2，6-唾液酸修饰的酸性游离寡糖占比等于60-70％。
进一步地，富含α2，6-唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖中α2，6-唾液酸修饰的酸性游离寡糖占比等于67.7％。
进一步地，富含α2，6-唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖在浓度为25-200μg/mL时酸性磷酸酶活性最强；在浓度为25-200μg/mL时，NO分泌能力最强；在浓度为25-200μg/mL时细胞吞噬能力最强。
进一步地，上述富含α2，6-唾液酸修饰的酸性游离寡糖通过上调MAPKs信号通路中的p38丝裂原活化蛋白激酶、细胞外信号调节激酶(ERK)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)的表达来发挥免疫调节作用。
进一步地，上述富含α2，6-唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖通过下述过程分离制备：
步骤1、除脂；
取羊乳样品，离心除去上层脂肪，加入无水乙醇沉淀蛋白，离心除去沉淀，取上清浓缩干燥；
步骤2、分离纯化；
步骤2.1、将步骤1得到的样品，加入双蒸水溶解，上样于DEAE52阴离子交换树脂，用双蒸水洗脱中性游离寡糖，用NaCl溶液洗脱酸性游离寡糖，分别收集水洗组分和盐洗组分，后分别浓缩干燥；
步骤2.2、将步骤2.1得到的水洗组分，加水溶解，然后上样于活性炭柱，0％-8％的乙醇洗脱乳糖，然后使用60％-100％乙醇洗脱中性游离寡糖，收集60％-100％乙醇组分，浓缩干燥，获得不含乳糖的中性游离寡糖；
将步骤2.1得到的盐洗组分，水溶后透析，除去多余的盐，浓缩干燥，获得富含α2，6-唾液酸修饰的酸性游离寡糖。
进一步地，步骤2.1中用0.25M NaCl溶液洗脱酸性游离寡糖。
进一步地，步骤2.2中利用100Da透析袋对水溶后的盐洗组分进行透析。
本发明还公开一种免疫调节剂，其特殊之处在于：包括富含α2，6-唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖，富含α2，6-唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖中α2，6-唾液酸修饰的酸性游离寡糖占比等于60-70％。
进一步地，富含α2，6-唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖中α2，6-唾液酸修饰的酸性游离寡糖占比等于67.7％
进一步地，上述富含α2，6-唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖在浓度为25-200μg/mL时酸性磷酸酶活性最强；在浓度为25-200μg/mL时，NO分泌能力最强；在浓度为25-200μg/mL时细胞吞噬能力最强。
富含α2，6-唾液酸修饰的酸性游离寡糖通过上调MAPKs信号通路中的p38丝裂原活化蛋白激酶、细胞外信号调节激酶(ERK)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)的表达来发挥免疫调节作用。
本发明的有益效果是：
本发明公开了富含α2，6-唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖对RAW264.7细胞的免疫调节作用，添加富含α2,6-连接的唾液酸化羊乳寡糖能够提高RAW264.7细胞的细胞增殖能力、细胞吞噬能力、NO分泌量和酸性磷酸酶活力，显著上调RAW264.7细胞中TNF-α、IL-10、IL-6和IL-1α基因mRNA的表达量，同时通过上调MAPKs信号通路中的p38丝裂原活化蛋白激酶、细胞外信号调节激酶(ERK)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)的表达来发挥免疫调节作用。本发明中富含α2,6-连接的唾液酸化羊乳寡糖对功能性配方食品的开发利用具有重要意义。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为人乳酸性游离寡糖在线液质联用图谱；其中
Figure BDA0003403982770000041
为N-乙酰神经氨酸(α2,6-连接)，
Figure BDA0003403982770000042
为N-乙酰神经氨酸(α2,3-连接)，
Figure BDA0003403982770000043
为d0-苯胺，
Figure BDA0003403982770000044
为d5-苯胺。
图2为羊乳酸性游离寡糖在线液质联用图谱；其中
Figure BDA0003403982770000045
为N-乙酰神经氨酸(α2,6-连接)，
Figure BDA0003403982770000046
为N-乙酰神经氨酸(α2,3-连接)，
Figure BDA0003403982770000047
为N-羟乙酰神经氨酸(α2,6-连接)，
Figure BDA0003403982770000048
为N-羟乙酰神经氨酸(α2,3-连接)，
Figure BDA0003403982770000049
为d0-苯胺，
Figure BDA00034039827700000410
为d5-苯胺。
图3为牛乳酸性游离寡糖在线液质联用图谱；其中
Figure BDA00034039827700000411
为N-乙酰神经氨酸(α2,6-连接)，
Figure BDA00034039827700000412
为N-乙酰神经氨酸(α2,3-连接)，
Figure BDA00034039827700000413
为N-羟乙酰神经氨酸(α2,6-连接)，
Figure BDA00034039827700000414
为N-羟乙酰神经氨酸(α2,3-连接)，
Figure BDA00034039827700000415
为d0-苯胺，
Figure BDA00034039827700000416
为d5-苯胺。
图4为人乳、羊乳和牛乳酸性游离寡糖定量分析；其中(A)SHMOs：人乳唾液酸化寡糖；(B)SGMOs：羊乳唾液酸化寡糖；(C)SHMOs：牛乳唾液酸化寡糖。
图5为人乳、羊乳和牛乳中性和酸性寡糖对RAW264.7细胞增殖能力、细胞吞噬能力、NO分泌量和酸性磷酸酶活力的影响；NHMOs代表人乳中性游离寡糖；SHMOs代表人乳酸性游离寡糖；NGMOs代表羊乳中性游离寡糖；SGMOs代表羊乳酸性游离寡糖；NBMOs代表牛乳中性游离寡糖；SBMOs代表牛乳酸性游离寡糖；*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。
图6为SHMOs和SGMOs对RAW264.7细胞相关基因mRNA表达水平的影响；SHMOs代表人乳酸性游离寡糖；SGMOs代表羊乳酸性游离寡糖；aP＜0.05；bP＜0.01。
图7为SHMOs和SGMOs对RAW264.7细胞MAPKs信号通路的影响；SHMOs代表人乳酸性游离寡糖；SGMOs代表羊乳酸性游离寡糖；aP＜0.05；bP＜0.01。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明，显然所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明的保护的范围。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
本发明中，富含α2，6-唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖(SGMOs)制备方法如下：
除脂：取200mL羊乳汁样品，4℃13000rpm离心20min，以除去上层脂肪沉淀蛋白：加入400mL无水乙醇，4℃静置2h，并4℃13000rpm离心20min，以除去蛋白沉淀，取上清浓缩干燥；
分离纯化：加入100mL双蒸水于干燥样品中，充分溶解，并上样于DEAE52阴离子交换树脂，用1000mL双蒸水洗脱中性游离寡糖，用0.25M NaCl溶液洗脱酸性游离寡糖，分别收集水洗组分和盐洗组分浓缩干燥。然后，加入100mL双蒸水于水洗组分样品中，充分溶解，并上样于活性炭柱，用0％-8％的乙醇洗脱乳糖，再用60％-100％乙醇洗脱中性游离寡糖，收集60％-100％乙醇组分，浓缩干燥，获得除去乳糖的中性游离寡糖；加入20mL双蒸水于盐洗组分样品中，充分溶解，利用100Da透析袋对其进行透析，除去多余的盐，浓缩干燥，获得酸性游离寡糖，即为富含α2，6-唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖。
为了定性定量比较分析人乳、羊乳和牛乳中酸性游离寡糖的差异，利用上述同样的方法，提取人乳和牛乳中的中性游离寡糖与酸性游离寡糖，并利用下述方法，分别对提取出的人乳、羊乳和牛乳中的酸性游离寡糖进行结构表征：
α2，6-唾液酸修饰的酸性游离寡糖特异性衍生：
首先，将提取的人乳、羊乳和牛乳酸性游离寡糖分别溶于1μL双蒸水中，再加入20μL溶液A(250mM EDC和500mM HOBt溶于DMSO)，60℃反应1h。然后加入反应液B(500mM EDC、1MHOBt和500mM d5-苯胺溶于DMSO)继续反应1h，再加入500μL的乙腈淬灭，13500r/min离心3min并收集沉淀。
α2，3-唾液酸修饰的酸性游离寡糖特异性衍生：
在上述沉淀样品中加入1M Tris，37℃反应2h，然后加入450μL的1M d0-苯胺溶液和90μL的2M EDC水溶液，并用1M盐酸调节pH值至4.5，室温下反应6h，冷冻干燥以备用。
最后，将冷冻干燥样品上样于C18柱，利用25％乙腈洗脱特异性衍生化后的唾液酸化寡糖，再次冷冻干燥用于质谱分析。
利用LTQ-XL液质联用仪在异构体水平定性定量比较分析人乳、羊乳和牛乳酸性游离寡糖的差异。使用购自大连伊力特公司的Sinochrom ODS-BP柱(4.6mm×250mm，5μm)在室温(25℃)进行RP-HPLC分离，分离条件为：A相：乙腈；B相：10mM乙酸铵(pH 5.5)；t＝0min(t＝0)，1％A，99％B；t＝30，1％A，99％B；t＝40，9％A，91％B；t＝100，13.5％A，86.5％B；t＝160，18％A，82％B；t＝175，23％A，77％B；流速为800μL/min。特异性衍生化后的酸性游离寡糖在ESI-MS的阳离子模式进行检测，m/z范围为200到2000。喷雾电压为4kv，鞘层气(氮气)流量为20arb，辅助气(氮气)流量为10arb，毛细管电压为37v，管透镜电压为200v，毛细管温度为300℃。采用碰撞诱导裂解(CID)方法，以氦气(He)为碰撞气进行MS/MS分析。碰撞能量为30-45，同位素宽度3.00。激活q为0.25，激活时间为30ms。用Xcalibur软件(Thermo)记录MS和MS/MS数据，并用GlycoWorkbench软件进行糖链结构解析。
由图1可知，人乳酸性游离寡糖共有50种寡糖，其中有4种α2，3-连接的唾液酸化寡糖，36种α2，6-唾液酸修饰的酸性游离寡糖。由图2可知，羊乳酸性游离寡糖共有24种寡糖，其中有11种α2，3-连接的唾液酸化寡糖，10种α2，6-唾液酸修饰的酸性游离寡糖，3种同时被α2，3-和α2，6-唾液酸修饰的酸性游离寡糖。由图3中可知，牛乳酸性游离寡糖共有10种酸性游离寡糖，其中有6种α2，3-连接的唾液酸化寡糖，3种α2，6-唾液酸修饰的酸性游离寡糖，1种同时被α2，3-和α2，6-唾液酸修饰的酸性游离寡糖。
由图4可知，经定量分析，人乳酸性游离寡糖中α2，6-唾液酸修饰的酸性游离寡糖占99.6％，α2，3-连接的唾液酸化寡糖仅占0.37％；羊乳酸性游离寡糖中α2，6-唾液酸修饰的酸性游离寡糖占67.7％(该数据可能会因为提取方法不同，在60-70％范围内浮动)，α2，3-连接的唾液酸化寡糖占27.8％，两个α2，3-连接的唾液酸化寡糖仅占3.7％，同时被α2，3-和α2，6-唾液酸修饰的酸性游离寡糖占0.8％；牛乳酸性游离寡糖中α2，6-唾液酸修饰的酸性游离寡糖占36.27％，α2，3-连接的唾液酸化寡糖占59.57％，两个α2，3-连接的唾液酸化寡糖仅占3.78％，同时被α2，3-和α2，6-唾液酸修饰的酸性游离寡糖占0.38％。由此可见，人乳和羊乳酸性游离寡糖均以α2，6-唾液酸修饰的酸性游离寡糖为主，而牛乳酸性游离寡糖以α2，3-修饰的唾液酸化寡糖为主。
实施例1：人乳、羊乳和牛乳各寡糖分对RAW264.7细胞的增殖作用、吞噬能力、酸性磷酸酶活力和NO分泌的影响
利用MTT法测定人乳、羊乳和牛乳中性游离寡糖(NHMOs、NGMOs和NBMOs)和酸性游离寡糖(SHMOs、SGMOs和SBMOs)对RAW264.7细胞增殖作用，具体步骤如下所示：
取对数生长期的RAW264.7细胞，并将其密度调至1×105个/mL，然后接种于96孔板，每孔100μL，培养12h(37％，5％CO2)，弃去上清，用PBS洗涤2次左右，弃去PBS，加入由新鲜DMEM高糖培养基配制的不同浓度人乳、羊乳和牛乳的中性、酸性游离寡糖溶液(50-800μg/mL)，每组三个复孔，空白对照组加入培养基，将96孔板继续置于二氧化碳培养箱培养24h，弃去培养液，加入100μL MTT(0.5mg/mL)于每孔中，培养4h，弃去MTT溶液，用PBS洗涤细胞1次，弃去PBS，最后加入100μL DMSO，震荡5min，利用酶标仪测量570nm处的吸光度，根据如下计算公式测定细胞活力。细胞活力(％)＝Abs样品/Abs对照×100％
由图5中a可知，在50-800μg/mL浓度范围内，各组分均对RAW264.7细胞有促进增殖的作用，并呈现一定浓度依赖性，在400-800μg/mL浓度范围内，人乳NHMOs、SHMOs，羊乳SGMOs和牛乳SBMOs可以显著促进细胞活力(P＜0.05)，浓度为800μg/mL时，人乳SHMOs，羊乳SGMOs和牛乳SBMOs实验组的细胞活力分别是117.08±1.2％、110.23±1.9％和104±2.6％，均高于NHMOs、NGMOs和NBMOs，细胞增殖的促进作用最为显著。当各组分浓度低于400μg/mL时，各寡糖分对RAW264.7细胞活力无显著性影响(P＞0.05)，为了避免后续其它免疫活性相关指标的检测是由细胞增殖作用所引起，故选择浓度小于400μg/mL(12.5-200μg/mL)的各组分样品展开后续实验。
巨噬细胞可以吞噬和杀死衰老的细胞，同时可杀死外来异物和其他病原体，在机体自身的天然免疫反应中起着重要作用。我们利用中性红吞噬实验测定人乳、羊乳和牛乳的中性和酸性游离寡糖对RAW264.7细胞吞噬能力的影响，具体步骤如下所示：
取对数生长期的RAW264.7细胞，并将其密度调至1×105个/mL，然后接种于96孔板，每孔100μL，培养12h(37％，5％CO2)，弃去上清，用PBS洗涤2次左右，弃去PBS，加入由新鲜DMEM高糖培养基配制的不同浓度NHMOs/SHMOs、NGMOs/SGMOs和NBMOs/SBMOs溶液(12.5-200μg/mL)，每组五个复孔，空白对照组加入不含血清的新鲜DMEM培养基，阳性对照组加入LPS(10μg/mL)将96孔板继续置于CO2培养箱培养24h，弃去培养液，每孔加入0.1％100μL中性红溶液，置于CO2培养箱培养4h，弃去中性红溶液，并用PBS洗涤4次左右至无色，弃去PBS，每孔加入100μL细胞裂解液(乙醇：乙酸＝1：1)，于CO2培养箱培养1h，充分震荡混匀，利用酶标仪测量540nm处的吸光度，根据如下的计算公式测定细胞对中性红的吞噬能力。吞噬指数＝Abs样品/Abs对照×100％
由图5中b可知，与空白组相比，当浓度为25-200μg/mL时，SHMOs，SGMOs和SBMOs均能显著性提高RAW264.7细胞的吞噬能力(P＜0.05)，且呈现浓度依赖性。当SHMOs、SGMOs和SBMOs浓度为200μg/mL时，细胞吞噬能力最强，分别为空白组的1.39倍、1.30倍和1.23倍，其中SHMOs的细胞吞噬能力高于LPS阳性对照组，表明SHMOs免疫活性最强，其次为SGMOs和SBMOs。
酸性磷酸酶广泛存在于体内各组织和细胞中，同时也是RAW264.7细胞激活的标志性酶，RAW264.7细胞的激活可以增强酸性磷酸酶的活力。根据已报道方法测定人乳、羊乳和牛乳的中性和酸性游离寡糖对RAW264.7细胞酸性磷酸酶活力的影响，具体步骤如下所示：
取对数生长期的RAW264.7细胞，并将其密度调至1×105个/mL，然后接种于96孔板，每孔100μL，培养12h(37％，5％CO2)，弃去上清，用PBS洗涤2次左右，弃去PBS，加入由新鲜DMEM高糖培养基配制的不同浓度NHMOs/SHMOs、NGMOs/SGMOs和NBMOs/SBMOs溶液(12.5-200μg/mL)，每组五个复孔，空白对照组加入不含血清的新鲜DMEM培养基，阳性对照组加入LPS(10μg/mL)，将96孔板继续置于CO2培养箱培养24h，弃去培养液，每孔加入25μL 1％Triton X-100和150μL 1mg/mL对硝基苯磷酸溶液，培养1h，然后每孔加入50μL 3M NaOH溶液，充分震荡混匀，利用酶标仪测量405nm处的吸光度，根据如下的计算公式测定细胞中酸性磷酸酶活力。酸性磷酸酶活性＝Abs样品/Abs对照×100％
由图5中c可知，与空白组相比，当浓度在50-200μg/mL之间时，SHMOs、SGMOs和SBMOs实验组均能显著增强细胞酸性磷酸酶的活力(P＜0.05)，并呈现一定的浓度依赖性。当浓度为200μg/mL时，各组分的细胞酸性磷酸酶活力最强，其中，SHMOs、SGMOs和SBMOs实验组分别为空白组的1.15倍、1.10倍和1.08倍，且SHMOs实验组的细胞酸性磷酸酶活力接近于阳性对照LPS组，表明SHMOs免疫活性最强，其次为SGMOs和SBMOs。
NO是免疫调节抵抗异物感染的重要细胞因子，NO分泌量可以直接反映巨噬细胞的免疫功能。根据已Griess试剂法测定人乳、羊乳和牛乳的中性和酸性游离寡糖对RAW264.7细胞分泌NO的影响，具体步骤如下所示：
取对数生长期的RAW264.7细胞，并将其密度调至1×105个/mL，然后接种于96孔板，每孔100μL，置于CO2培养箱培养12h(37％，5％CO2)，弃去上清，用PBS洗涤2次左右，弃去PBS，加入由新鲜DMEM高糖培养基配制的不同浓度NHMOs/SHMOs、NGMOs/SGMOs和NBMOs/SBMOs溶液(12.5-200μg/mL)，每组五个复孔，空白对照组加入不含血清的新鲜DMEM培养基，阳性对照组加入LPS(10μg/mL)，将96孔板继续置于CO2培养箱培养24h，弃去培养液，吸取50μL细胞上清于96孔板，每孔先加入50μL Griess A试剂(避光)，震荡10min，再加入50μLGriess B试剂(避光)，震荡10min，利用酶标仪测定540nm处的吸光度。将横坐标X设置为NO分泌量，纵坐标Y设置为对应的吸光值，绘制标准曲线，并计算各组细胞NO分泌量。
由图5中d可知，与空白组相比，当浓度在25-200μg/mL之间时，SHMOs、SGMOs和SBMOs均能显著增强细胞分泌NO含量(P＜0.05)，并呈现一定浓度依赖性。当浓度为200μg/mL时，各组分的细胞NO分泌量最高，与空白组相比，SHMOs、SGMOs和SBMO实验组细胞NO分泌量分别增加了29.15％、27.08％和23.62％，且SHMOs组的细胞NO分泌量接近于阳性对照LPS组，表明SHMOs免疫活性最强，其次为SGMOs和SBMOs。
综上发现，与NHMOs、NGMOs和NBMOs相比，SHMOs、SGMOs和SBMOs的免疫活性更强，且SHMOs＞SGMOs＞SBMOs，其中SHMOs和SGMOs分别与SBMOs在细胞吞噬中性红和分泌NO能力方面存在显著性差异(P＜0.05)。该结果与SHMOs和SGMOs中含有更高含量的α2,6-唾液酸修饰的酸性游离寡糖有关，表明酸性寡糖的特异性连接方式在RAW264.7细胞发挥免疫活性中起关键作用。
实施例2：SHMOs和SGMOs刺激RAW264.7巨噬细胞中细胞因子的表达
利用RT-PCR技术检测游离寡糖对RAW264.7细胞中TNF-α、IL-10、IL-6、IL-1α基因表达的影响。以GAPDH作为内参基因，反转录获得的cDNA作为模板，每组设置三个重复，利用RT-PCR仪检测TNF-α、IL-10、IL-6、IL-1α基因mRNA的表达，每个样品中的基因表达量用CP值表示，利用△△CP法计算基因的相对表达含量。引物序列如下所示：
GADPH(5’-TTTGTCAAGCTCATTTCCTGGTATG-3’,5’-TGGGATAGGGCCTCTCTTGC-3’)
TNF-α(5’-GGGGATTATGGCTCAGGGTC-3’,5’-CGAGGCTCCAGTGAATTCGG-3’)
IL-10(5’-AGGGTTACTTGGGTTGC-3’,5’-TGAGGGTCTTCAGCTTC-3’)
IL-6(5’-TACTCGGCAAACCTAGTGCG-3’,5’-GTGTCCCAACATTCATATTGTCAGT-3’)
IL-1α(5’-ATGAAGCTCGTCAGGCAGAAG-3’,5’-GAGATAGTGTTTGTCCACATCCTGAT-3’)
由图6中a可知，SHMOs和SGMOs组细胞中TNFα基因mRNA的表达量显著明显高于空白组和阳性对照LPS组(P＜0.05)，其中SHMOs组细胞中TNFα基因mRNA的表达量为381.1±2.4％，SGMOs组细胞中TNFα基因mRNA的表达量为187.5±1.6％；由图6中b可知，SHMOs和SGMOs组细胞中IL-10基因mRNA的表达量显著明显高于空白组(P＜0.05)，其中SHMOs组细胞中IL-10基因mRNA的表达量为142.2±1.8％，接近于阳性对照LPS组，SGMOs组细胞中IL-10基因mRNA的表达量为126.8±3.5％；由图6中c可知，SHMOs和SGMOs组细胞中IL-6基因mRNA的表达量显著明显高于空白组(P＜0.05)，其中SHMOs组细胞中IL-6基因mRNA的表达量为161.8±2.6％，接近于阳性对照LPS组，SGMOs组细胞中IL-10基因mRNA的表达量为128.3±4.5％；由图6中d可知，SHMOs和SGMOs组细胞中IL-1α基因mRNA的表达量显著明显高于空白组(P＜0.05)，其中SHMOs组细胞中IL-1α基因mRNA的表达量为222.7±3.8％，接近于阳性对照LPS组，SGMOs组细胞中IL-10基因mRNA的表达量为200.2±3.2％。结果表明，SHMOs和SGMOs均可以上调RAW264.7细胞中TNF-α、IL-10、IL-6和IL-1α基因mRNA的表达来调节细胞的免疫应答。
实施例3：SHMOs和SGMOs激活MAPKs信号通路
利用不同寡糖处理细胞孵育24h，收集细胞，并用含有20mM NaF和1％DMSF的裂解缓冲液在冰上裂解细胞10min，4℃离心10min，收集上清液，并使用BCA蛋白质测定法进行定量。变性蛋白用凝胶电泳分离并转移到PVDF膜上。PVDF膜用5％脱脂乳封闭2h，用TBST洗涤4次，每次10min，然后用一抗在4℃孵育过夜。用TBST洗涤后加入二抗，25℃孵育2h，然后用TBST洗涤膜4次，并利用增强化学发光试剂检测蛋白质水平。利用Image J软件进行Westernblot的定量。
由图7中a可知，SHMOs和SGMOs可以上调非磷酸化的JNK、p38、ERK和磷酸化的p-JNK、p-p38、p-ERK基因的表达，由图7中b可知，与空白组相比，SHMOs极显著增加p-JNK/JNK蛋白表达量(P＜0.001)，且高于LPS，蛋白表达增加了1.63倍；SGMOs显著增加p-JNK/JNK蛋白表达量(P＜0.05)，蛋白表达增加了1.31倍。由图7中c可知，与空白组相比，SHMOs极显著增加p-p38/p-38蛋白表达量(P＜0.001)，蛋白表达增加了1.77倍；SGMOs显著增加p-p38/p-38蛋白表达量(P＜0.01)，蛋白表达增加了1.45倍，且SHMOs和SGMOs组中p-p38/p-38蛋白表达量均高于阳性对照组LPS。由图7中d可知，与空白组相比，SHMOs极显著增加p-ERK/ERK蛋白表达量(P＜0.001)，蛋白表达增加了1.73倍；SGMOs显著增加p-ERK/ERK蛋白表达量(P＜0.001)，蛋白表达增加了1.72倍，且SHMOs和SGMOs组中p-ERK/ERK蛋白表达量均高于阳性对照组LPS。结果显示，SHMOs和SGMOs均可以通过上调MAPKs信号通路中的p38丝裂原活化蛋白激酶、细胞外信号调节激酶(ERK)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)的表达来增强免疫调节作用。
从上述结果可以看出，富含α2,6-唾液酸修饰的人乳酸性游离寡糖(SHMOs)和羊乳酸性游离寡糖(SGMOs)能够显著性的增强RAW264.7细胞的免疫活性，并且通过上调细胞内相关免疫因子mRNA的表达和MAPKs信号通路相关蛋白的表达来进一步增强细胞的免疫调节作用。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。

Claims (13)

1.富含α2，6-唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖在制备免疫调节药物或功能食品中的应用。
2.根据权利要求1所述的富含α2，6-唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖在制备免疫调节药物或功能食品中的应用，其特征在于：富含α2，6-唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖在制备增加免疫药物或功能食品中的应用。
3.根据权利要求2所述的富含α2，6-唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖在制备免疫调节药物或功能食品中的应用，其特征在于：富含α2，6-唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖中α2，6-唾液酸修饰的酸性游离寡糖占比等于60-70％。
4.根据权利要求3所述的富含α2，6-唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖在制备免疫调节药物或功能食品中的应用，其特征在于：富含α2，6-唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖中α2，6-唾液酸修饰的酸性游离寡糖占比等于67.7％。
5.根据权利要求4所述的富含α2，6-唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖在制备免疫调节药物或功能食品中的应用，其特征在于：
所述富含α2，6-唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖在浓度为25-200μg/mL时酸性磷酸酶活性最强；在浓度为25-200μg/mL时，NO分泌能力最强；在浓度为25-200μg/mL时细胞吞噬能力最强。
6.根据权利要求5所述的富含α2，6-唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖在制备免疫调节药物或功能食品中的应用，其特征在于：所述富含α2，6-唾液酸修饰的酸性游离寡糖通过上调MAPKs信号通路中的p38丝裂原活化蛋白激酶、细胞外信号调节激酶(ERK)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)的表达来发挥免疫调节作用。
7.根据权利要求6所述的富含α2，6-唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖在制备免疫调节药物或功能食品中的应用，其特征在于：所述富含α2，6-唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖通过下述过程分离制备：
步骤1、除脂；
取羊乳样品，离心除去上层脂肪，加入无水乙醇沉淀蛋白，离心除去沉淀，取上清浓缩干燥；
步骤2、分离纯化；
步骤2.1、将步骤1得到的样品，加入双蒸水溶解，上样于DEAE52阴离子交换树脂，用双蒸水洗脱中性游离寡糖分，用NaCl溶液洗脱酸性游离寡糖分，分别收集水洗组分和盐洗组分，后分别浓缩干燥；
步骤2.2、将步骤2.1得到的水洗组分，加水溶解，然后上样于活性炭柱，0％-8％的乙醇洗脱乳糖，然后使用60％-100％乙醇洗脱中性游离寡糖，收集60％-100％乙醇组分，浓缩干燥，获得不含乳糖的中性游离寡糖；
将步骤2.1得到的盐洗组分，水溶后透析，除去多余的盐，浓缩干燥，获得富含α2，6-唾液酸修饰的酸性游离寡糖分。
8.根据权利要求7所述的富含α2，6-唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖在制备免疫调节药物或功能食品中的应用，其特征在于：步骤2.1中用0.25M NaCl溶液洗脱酸性游离寡糖分。
9.根据权利要求8所述的富含α2，6-唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖在制备免疫调节药物或功能食品中的应用，其特征在于：步骤2.2中利用100Da透析袋对水溶后的盐洗组分进行透析。
10.一种免疫调节剂，其特征在于：包括富含α2，6-唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖，富含α2，6-唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖中α2，6-唾液酸修饰的酸性游离寡糖占比等于60-70％。
11.根据权利要求10所述的免疫调节剂，其特征在于：富含α2，6-唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖中α2，6-唾液酸修饰的酸性游离寡糖占比等于67.7％。
12.根据权利要求11所述的免疫调节剂，其特征在于：所述富含α2，6-唾液酸修饰的羊乳酸性游离寡糖在浓度为25-200μg/mL时酸性磷酸酶活性最强；在浓度为25-200μg/mL时，NO分泌能力最强；在浓度为25-200μg/mL时细胞吞噬能力最强。
13.根据权利要求12所述的免疫调节剂，其特征在于：所述富含α2，6-唾液酸修饰的酸性游离寡糖通过上调MAPKs信号通路中的p38丝裂原活化蛋白激酶、细胞外信号调节激酶(ERK)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)的表达来发挥免疫调节作用。
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