CN112526022A - 一种乳中母乳低聚糖的检测方法 - Google Patents

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CN112526022A CN202011360676.3A CN202011360676A CN112526022A CN 112526022 A CN112526022 A CN 112526022A CN 202011360676 A CN202011360676 A CN 202011360676A CN 112526022 A CN112526022 A CN 112526022A
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刘彪
张立君
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Abstract

本发明提供了一种乳中母乳低聚糖的检测方法，包括如下步骤：A)将乳样品采用沉淀剂沉淀蛋白，过滤，得到试样溶液；B)将试样溶液采用滤膜和净化柱净化处理，得到待测液；C)将待测液采用阴离子交换色谱进行测定，得到乳中母乳低聚糖的含量。本发明提供的采用沉淀剂沉淀蛋白，而后过滤和净化处理后，采用离子交换色谱测定乳中母乳低聚糖，前处理方法简单，快速，定量准确，结果稳定可靠。

Description

一种乳中母乳低聚糖的检测方法
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，尤其是涉及一种乳中母乳低聚糖的检测方法。
背景技术
母乳低聚糖(human milk oligosaccharides，HMOs)是人类母乳中的第三大固体组分，仅次于乳糖和脂肪，其具有重要的生物学功能，不仅对肠道病原微生物起到抗感染的作用，还能维持肠道微生态的平衡。目前FDA和EFSA已批准2’-FL和LNnT在婴儿配方食品中使用，新西兰预计2020年批准2’-FL在婴儿配方食品中单独使用或与LNnT联合使用，国内也在积极推进法规。开发含HMOs婴配粉并进行质量控制，必须建立乳粉中母乳低聚糖的准确的定量检测方法。
目前HMOs的定量测定方法有高效液相色谱法、超高效液相色谱法-荧光检测法(UHPLC-FLD)、液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)、多孔石墨化碳-液相色谱-质谱/质谱(PCG-LC-MS/MS)毛细管电泳-电喷雾电离-质谱/质谱(CE-ESI-MS/MS)、高效阴离子交换色谱-脉冲电化学检测法(HPAEC-PAD)等，但大多数方法测定的目标样本是母乳，奶粉中母乳低聚糖的检测方法报道较少。
现有技术母乳低聚糖快速定性定量的方法中采用超高效液相色谱、质谱法，一种检测母乳中低聚糖的方法中采用液质联用方法。乳粉中HMOs添加量可能会低于母乳中HMOs水平，检测HMOs时稀释度与母乳不同，检测时受乳糖的干扰较母乳中检测时的干扰明显。因此，母乳中HMOs的检测方法不适用于乳粉，需要再进行试验和优化。现有的检测方法的准确性低，无法准确检测婴配粉中HMOs含量，将无法控制婴配粉中HMOs的添加量，从而导致无法评判生产出的产品是否符合法规要求。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种乳中母乳低聚糖的检测方法，本发明提供的检测方法简单，结果准确、稳定，可靠。
本发明一种乳中母乳低聚糖的检测方法，包括如下步骤：
A)将乳样品采用沉淀剂沉淀蛋白，过滤，得到试样溶液；
B)将试样溶液采用滤膜和净化柱净化处理，得到待测液；
C)将待测液采用阴离子交换色谱进行测定，得到乳中母乳低聚糖的含量。
优选的，所述母乳低聚糖为3’-唾液酸乳糖、6’-唾液酸乳糖和乳糖-N-四糖中一种或多种。
优选的，所述乳样品包括液态乳或将乳粉溶于水得到的乳粉溶液。
优选的，步骤A)所述沉淀剂为酸溶液或有机溶剂；所述酸溶液为磺基水杨酸溶液或醋酸溶液，所述有机溶剂为乙醇或乙腈；优选的，所述沉淀剂为磺基水杨酸溶液；更优选的，所述磺基水杨酸溶液的浓度为1～5wt％。
优选的，步骤A)所述乳样品和沉淀剂的质量比为1:1～1:2。
优选的，步骤A)所述过滤之前还包括采用超声提取或振荡提取，优选地，所述超声提取或振荡提取的时间为5～15min。
优选的，步骤B)所述滤膜为0.45μm滤膜；所述净化柱为Dionex OnGuard II RP净化柱；所述净化柱的规格为1mL或2.5mL；所述净化柱依次采用甲醇和水进行活化。
优选的，步骤C)所述阴离子交换色谱的色谱柱为DIONEX CarboPacTM PA1柱、Dionex CarboPac PA20；检测器为电化学检测器；流动相流速为0.8～1.0mL/min，柱温为30-35℃，进样体积为10～50μL。
优选的，步骤C)所述阴离子交换色谱的流动相为A为去离子水，B为NaOH溶液，C为NaOAc和NaOH混合溶液，D为乙酸钠溶液。
优选的，流动相B为200～250mmol/L的NaOH溶液；C为1.0mol/LNaAc和100mmol/LNaOH溶液，D为90-100mmol/L的NaAc溶液。
优选的，阴离子交换色谱为梯度洗脱，具体为：
第一阶段为50％～60％流动相A、30％～40％流动相B、0％流动相C以及2％～5％流动相D，洗脱10～15分钟；第二阶段为10％～20％的流动相A、40％～50％的流动相B、0％流动相C以及40％～50％的流动相D，洗脱时间10～45分钟；第三阶段为10％～15％流动相A、30％～40％流动相B、0％流动相C，40％～45％流动相D，洗脱时间为5～10分钟；第四阶段为0％流动相A和0％的流动相B，90％～100％流动相C以及0％～10％的流动相D，洗脱时间为5～10分钟；第五阶段为10％～20％流动相A和70％～80％流动相B、0％流动相C以及0％流动相D，洗脱时间为5～10分钟；第六阶段为50％～60％流动相A、30％～40％流动相B、0％流动相C以及2％～5％流动相D，洗脱5～10分钟。
优选的，阴离子交换色谱为梯度洗脱，具体为：
0～10min流动相A为58％、流动相B为40％、流动相C为0％和流动相D为2％；
10～40min流动相A为58％→15％；流动相B为40％，流动相C为0％和流动相D为2％→45％；
40～45min流动相A为15％；流动相B为40％，流动相C为0％和流动相D为45％；
45～45.1min流动相A为15％→0％；流动相B为40％→0％，流动相C为0％→100％和流动相D为45％→0％；
45.1～55min流动相A为0％；流动相B为0％，流动相C为100％和流动相D为0％；
55～55.1min流动相A为0％→20％；流动相B为0％→80％，流动相C为100％→0％和流动相D为0％；
55.1～60min流动相A为20％；流动相B为80％，流动相C为0％和流动相D为0％；
60～60.1min流动相A为20％→58％；流动相B为80％→40％，流动相C为0％和流动相D为0％→2％；
60.1～65min流动相A为58％；流动相B为40％，流动相C为0％和流动相D为2％。
优选的，所述3’-唾液酸乳糖的进样浓度为0.20μg/mL～20.0μg/mL；所述6’-唾液酸乳糖的进样浓度为0.20μg/mL～20.0μg/mL；所述乳糖-N-四糖的进样浓度为0.20μg/mL～20.0μg/mL。
与现有技术相比，本发明提供了一种乳中母乳低聚糖的检测方法，包括如下步骤：A)将乳样品采用沉淀剂沉淀蛋白，过滤，得到试样溶液；B)将试样溶液采用滤膜和净化柱净化处理，得到待测液；C)将待测液采用阴离子交换色谱进行测定，得到乳中母乳低聚糖的含量。本发明提供的采用沉淀剂沉淀蛋白，而后过滤和净化处理后，采用离子交换色谱测定乳中母乳低聚糖，前处理方法简单，快速，定量准确，结果稳定可靠。
附图说明
图1为3’-SL标样的色谱图；
图2为6’-SL标样的色谱图；
图3为LNT标样的色谱图；
图4为添加3’-SL奶粉样品色谱图；
图5为添加6’-SL奶粉样品色谱图；
图6为添加LNT奶粉样品色谱图；
图7为添加3-FL奶粉样品色谱图；
图8为对比例2中3’-SL加标图谱；
图9为对比例2中6’-SL加标图谱；
图10为对比例2中LNT加标图谱。
具体实施方式
本发明提供了一种乳中母乳低聚糖的检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明的说明书中，提及“一个实施例”时均意指在该实施例中描述的具体特征、结构或者参数、步骤等至少包含在根据本发明的一个实施例中。因而，在本发明的说明书中，若采用了诸如“根据本发明的一个实施例”、“在一个实施例中”等用语并不用于特指在同一个实施例中，若采用了诸如“在另外的实施例中”、“根据本发明的不同实施例”、“根据本发明另外的实施例”等用语，也并不用于特指提及的特征只能包含在特定的不同的实施例中。本领域的技术人员应该理解，在本发明说明书的一个或者多个实施例中公开的各具体特征、结构或者参数、步骤等可以以任何合适的方式组合。
本发明一种乳中母乳低聚糖的检测方法，包括如下步骤：
A)将乳样品采用沉淀剂沉淀蛋白，过滤，得到试样溶液；
B)将试样溶液采用滤膜和净化柱净化处理，得到待测液；
C)将待测液采用阴离子交换色谱进行测定，得到乳中母乳低聚糖的含量。
本发明提供的乳中母乳低聚糖的检测方法，尤其适用于检测乳粉中的母乳低聚糖，特别是3’-唾液酸乳糖、6’-唾液酸乳糖、乳糖-N-四糖中一种或多种。
在一些实施例中，该方法包括对乳粉进行前处理的步骤，以及对前处理后乳粉中的3’-唾液酸乳糖、6’-唾液酸乳糖、乳糖-N-四糖的母乳低聚糖进行定性及定量分析的步骤。本发明对样品的前处理操作进行了改进，克服现有技术中前处理复杂、成本高、时间长等不足；本发明采用包含阴离子交换色谱柱的离子色谱系统，通过选用合适的色谱条件，很好地将3’-唾液酸乳糖、6’-唾液酸乳糖、乳糖-N-四糖等母乳低聚糖与其他类似物质区分开来，从而提高了检测结果的准确性。
本发明提供的乳中母乳低聚糖的检测方法首先将乳样品采用沉淀剂沉淀蛋白，过滤，得到试样溶液。优选具体为乳样品与水混合，沉淀剂沉淀蛋白，超声提取或振荡提取，过滤。
本发明所述乳样品包括液态乳或将乳粉溶于水得到的乳粉溶液。其中，液态乳样品可以是母乳、牛乳、羊乳等。
按照本发明，所述乳样品和水的混合的比例优选为0.1～0.5g：10～25mL；更优选为0.2～0.4g：15～23mL；本发明对于所述混合方式不进行限定，本领域技术人员熟知的即可。
本发明所述沉淀剂优选为酸溶液或有机溶剂；更优选为酸溶液。所述酸溶液为磺基水杨酸溶液或醋酸溶液，所述有机溶剂为乙醇或乙腈；最优选的，所述沉淀剂为磺基水杨酸溶液；特别优选的，所述磺基水杨酸溶液的浓度为1wt％～5wt％；具体可以为2wt％、3wt％或4wt％
本发明所述乳样品和沉淀剂的质量比为1:1～1:2；优选为1:1.5.
所述超声提取的时间优选为5～15min；具体可以为6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min或14min。本发明对于所述超声提取的频率不进行限定，本领域技术人员熟知的即可。
本发明对于所述过滤不进行限定，可以为采用滤纸过滤。
将试样溶液采用滤膜和净化柱净化处理，得到待测液。试样溶液依次通过0.45μm滤膜和净化柱，弃去前面2倍柱体积滤液，收集后面的滤液上机测定。需要时可以进行适当稀释。
本发明所述滤膜优选为0.45μm滤膜；所述净化柱优选为Dionex OnGuard II RP净化柱；所述净化柱的规格为1mL或2.5mL；样品净化步骤包括活化净化柱的步骤，例如，可以依次使用甲醇和水对净化柱进行活化，放置半个小时后使用。甲醇用量可以为5～15ml，水的用量可以为10～20ml。
将待测液采用阴离子交换色谱进行测定，得到乳中母乳低聚糖的含量。
在样品检测步骤中，称取3’-SL等(3’-唾液酸乳糖、6’-唾液酸乳糖、乳糖-N-四糖)母乳低聚糖标准品，用水溶解并定容作为储备液。吸取不同量的储备液进行稀释，配制一系列浓度的标准工作液。采用离子色谱仪对标准工作液和样品测定液进行测定，采用外标法结合峰面积百分比定量。
本发明对于所述离子交换色谱仪的型号和规格不进行限定，本领域技术人员熟知的即可。离子色谱仪配置电化学检测器，本发明阴离子交换色谱柱，优选为DIONEXCarboPacTM PA1柱或Dionex CarboPac PA20。
其中，流动相流速优选为0.4～0.8mL/min，更优选为0.4～0.45mL/min；柱温优选为30～35℃，更优选为30℃；所述进样体积优选为10～50μL；更优选为10～30μL。
本发明阴离子交换色谱为梯度洗脱，所述阴离子交换色谱的流动相为A为去离子水，B为NaOH溶液，C为NaAc和NaOH混合溶液，D为NaAc溶液。
具体的，流动相B为200～250mmol/L的NaOH溶液；C为1.0mol/LNaAc和100mmol/LNaOH溶液，D为90-100mmol/L的NaAc溶液。
在本发明其中一部分优选实施方式中，所述梯度洗脱具体为：
第一阶段为50％～60％流动相A、30％～40％流动相B、0％流动相C以及2％～5％流动相D，洗脱10～15分钟；第二阶段为10％～20％的流动相A、40％～50％的流动相B、0％流动相C以及40％～50％的流动相D，洗脱时间10～45分钟；第三阶段为10％～15％流动相A、30％～40％流动相B、0％流动相C，40％～45％流动相D，洗脱时间为5～10分钟；第四阶段为0％流动相A和0％的流动相B，90％～100％流动相C以及0％～10％的流动相D，洗脱时间为5～10分钟；第五阶段为10％～20％流动相A和70％～80％流动相B、0％流动相C以及0％流动相D，洗脱时间为5～10分钟；第六阶段为50％～60％流动相A、30％～40％流动相B、0％流动相C以及2％～5％流动相D，洗脱5～10分钟。
在本发明其中一部分优选实施方式中，所述梯度洗脱具体为：
0～10min流动相A为58％、流动相B为40％、流动相C为0％和流动相D为2％；
10～40min流动相A为58％→15％；流动相B为40％，流动相C为0％和流动相D为2％→45％；
40～45min流动相A为15％；流动相B为40％，流动相C为0％和流动相D为45％；
45～45.1min流动相A为15％→0％；流动相B为40％→0％，流动相C为0％→100％和流动相D为45％→0％；
45.1～55min流动相A为0％；流动相B为0％，流动相C为100％和流动相D为0％；
55～55.1min流动相A为0％→20％；流动相B为0％→80％，流动相C为100％→0％和流动相D为0％；
55.1～60min流动相A为20％；流动相B为80％，流动相C为0％和流动相D为0％；
60～60.1min流动相A为20％→58％；流动相B为80％→40％，流动相C为0％和流动相D为0％→2％；
60.1～65min流动相A为58％；流动相B为40％，流动相C为0％和流动相D为2％。
本发明所述3’-唾液酸乳糖的进样浓度为0.20μg/mL～20.0μg/mL；所述6’-唾液酸乳糖的进样浓度为0.20μg/mL～20.0μg/mL；所述乳糖-N-四糖的进样浓度为0.20μg/mL～20.0μg/mL。在上述范围内，可呈现良好的线性关系。
本发明提供了一种乳中母乳低聚糖的检测方法，包括如下步骤：A)将乳样品采用沉淀剂沉淀蛋白，过滤，得到试样溶液；B)将试样溶液采用滤膜和净化柱净化处理，得到待测液；C)将待测液采用阴离子交换色谱进行测定，得到乳中母乳低聚糖的含量。本发明提供的采用沉淀剂沉淀蛋白，而后过滤和净化处理后，采用离子交换色谱测定乳中母乳低聚糖，前处理方法简单，快速，定量准确，结果稳定可靠。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种乳中母乳低聚糖的检测方法进行详细描述。
实施例1配方奶粉中3’-SL、6’-SL、LNT含量的测定
1、样品前处理：称取0.1g奶粉样品于25mL比色管中，加入10mL去离子水溶解混匀，加入5mL3wt％磺基水杨酸溶液，加水定容至刻度后摇匀，超声波超声提取10min。摇匀后定性滤纸过滤。
2、净化：活化净化柱，使用前依次用10mL甲醇，15mL水进行活化，放置半个小时后使用。
试样溶液依次通过0.45μm滤膜和净化柱，弃去前面2倍柱体积滤液，收集后面的滤液上机测定。
3、仪器测定：
按照离子色谱条件测定样品和标准工作溶液，用标准曲线对样品溶液浓度进行校正，采用外标法定量。
离子色谱柱：Dionex CarboPac PA20阴离子交换柱；
柱温：30℃；
进样量：10μL；
淋洗液：A为去离子水，B为250mMNaOH水溶液，C为1.0mol/LNaAc&100mmol/LNaOH，D为100mmol/L的NaAc溶液，梯度洗脱条件见表1。
表1流动相梯度洗脱条件
Figure BDA0002803812490000081
Figure BDA0002803812490000091
4、线性范围
准确吸取3’-SL、6’-SL、LNT标准溶液，用水稀释配制成浓度为0.20μg/mL、0.40μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、4.0μg/mL、8.0μg/mL、20.0μg/mL的标准工作液，以工作液峰面积为横坐标，对应工作液浓度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程，相关系数均大于0.990。3’-SL、6’-SL、LNT标样色谱图分别见图1-3。图1为3’-SL标样的色谱图；图2为6’-SL标样的色谱图；图3为LNT标样的色谱图。
5、加标回收率
在空白奶粉中进行加标，加标回收率结果详见表2。添加3’-SL奶粉样品色谱图见图4；添加6’-SL奶粉样品色谱图见图5；添加LNT奶粉样品色谱图见图6。
表2加标回收率
Figure BDA0002803812490000092
对比例1配方奶粉中3-FL含量的测定
1、样品前处理：称取0.1g奶粉样品于25mL比色管中，加入10mL去离子水溶解混匀，加入5mL3wt％磺基水杨酸溶液，加水定容至刻度后摇匀，超声波超声提取10min。摇匀后定性滤纸过滤。
2、净化：活化净化柱，使用前依次用10mL甲醇，15mL水进行活化，放置半个小时后使用。
试样溶液依次通过0.45μm滤膜和净化柱，弃去前面2倍柱体积滤液，收集后面的滤液上机测定。
3、仪器测定：
按照离子色谱条件测定样品和标准工作溶液，用标准曲线对样品溶液浓度进行校正，采用外标法定量。
离子色谱柱：Dionex CarboPac PA20阴离子交换柱；
柱温：30℃；
进样量：10μL；
淋洗液：A为去离子水，B为250mM NaOH水溶液，C为1.0mol/LNaOAc和100mmol/LNaOH，D为100mmol/L的乙酸钠溶液，梯度洗脱条件见表3。
表3流动相梯度洗脱条件
Figure BDA0002803812490000101
4、添加3-FL奶粉样品色谱图见图7。3-FL出峰时间快，在样品中完全被乳糖峰覆盖，无法进行定量。
对比例2配方奶粉中3’-SL、6’-SL、LNT含量的测定
1、样品预处理
称取一定质量的奶粉样品2.5g，预先用0.15％乙酸溶解溶液定容于50mL，10000rpm离心15min，取中间清液过0.22μm的尼龙微孔滤膜，取上清液用超纯水进行适当稀释(稀释20倍以上)，后过SPE-C18柱，最后上机测试。
2、采用高效阴离子交换色谱(带有脉冲电流检测器)定量检测：
用安培检测器采用四电位脉冲安培法检测，参比电极为Ag/AgCl，DionexCarboPac PA20阴离子交换柱，采用梯度洗脱，淋洗条件：采用梯度洗脱，以0.25MNaOH和1MNaAC为淋洗液进行梯度洗脱，流速为0.5mL/min。柱温：30℃。进样体积：10μL。分析条件如下：
0-15min,10％A+90％C；
15-25min,20％A+80％C；
25-27min,30～24％A+0～36％B+70～40％C；
27～35min,24％A+36％B+40％C；
35-37min,24～10％A+36～0％B+40～90％C；
37～50min,10％A+90％C。
3、加标：
(1)取经过同样处理的样品(不含3’-SL的空白奶粉样品)2份，加入300mg/100g的定量3’-SL标品；2份同时按相同的分析步骤分析。图谱见图8。由图8可见，目标峰受周围杂峰干扰严重。
(2)取经过同样处理的样品(不含6’-SL的空白奶粉样品)2份，加入300mg/100g的定量6’-SL标品；2份同时按相同的分析步骤分析。图谱见图9。由图9可见，该方法对6’-SL的分离效果较差。
(3)取经过同样处理的样品(不含LNT的空白奶粉样品)2份，加入300mg/100g的定量LNT标品；2份同时按相同的分析步骤分析。图谱见图10。由图10可见，目标峰受周围杂峰干扰严重，无法分离。
通过比较上述实施例和对比例可知，本发明的方法样品前处理操作简单，检测准确度高，且能准确定量乳中的3’-SL、6’-SL、LNT含量，无法检测出乳中3-FL含量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (13)

1.一种乳中母乳低聚糖的检测方法，包括如下步骤：
A)将乳样品采用沉淀剂沉淀蛋白，过滤，得到试样溶液；
B)将试样溶液采用滤膜和净化柱净化处理，得到待测液；
C)将待测液采用阴离子交换色谱进行测定，得到乳中母乳低聚糖的含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述母乳低聚糖为3’-唾液酸乳糖、6’-唾液酸乳糖和乳糖-N-四糖中一种或多种。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述乳样品包括液态乳或将乳粉溶于水得到的乳粉溶液。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤A)所述沉淀剂为酸溶液或有机溶剂；所述酸溶液为磺基水杨酸溶液或醋酸溶液，所述有机溶剂为乙醇或乙腈；优选的，所述沉淀剂为磺基水杨酸溶液；更优选的，所述磺基水杨酸溶液的浓度为1～5wt％。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤A)所述乳样品和沉淀剂的质量比为1:1～1:2。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤A)所述过滤之前还包括采用超声提取或振荡提取，优选地，所述超声提取或振荡提取的时间为5～15min。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤B)所述滤膜为0.45μm滤膜；所述净化柱为Dionex OnGuard II RP净化柱；所述净化柱的规格为1mL或2.5mL；所述净化柱依次采用甲醇和水进行活化。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤C)所述阴离子交换色谱的色谱柱为DIONEX CarboPacTM PA1柱或Dionex CarboPac PA20；检测器为电化学检测器；流动相流速为0.8～1.0mL/min，柱温为30-35℃，进样体积为10～50μL。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤C)所述阴离子交换色谱的流动相为A为去离子水，B为NaOH溶液，C为NaAc和NaOH混合溶液，D为NaAc溶液。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，流动相B为200～250mmol/L的NaOH溶液；C为1.0mol/LNaAc和100mmol/LNaOH溶液，D为90-100mmol/L的NaAc溶液。
11.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于，阴离子交换色谱为梯度洗脱，具体为：
第一阶段为50％～60％流动相A、30％～40％流动相B、0％流动相C以及2％～5％流动相D，洗脱10～15分钟；第二阶段为10％～20％的流动相A、40％～50％的流动相B、0％流动相C以及40％～50％的流动相D，洗脱时间10～45分钟；第三阶段为10％～15％流动相A、30％～40％流动相B、0％流动相C，40％～45％流动相D，洗脱时间为5～10分钟；第四阶段为0％流动相A和0％的流动相B，90％～100％流动相C以及0％～10％的流动相D，洗脱时间为5～10分钟；第五阶段为10％～20％流动相A和70％～80％流动相B、0％流动相C以及0％流动相D，洗脱时间为5～10分钟；第六阶段为50％～60％流动相A、30％～40％流动相B、0％流动相C以及2％～5％流动相D，洗脱5～10分钟。
12.根据权利要求11所述的检测方法，其特征在于，阴离子交换色谱为梯度洗脱，具体为：
0～10min流动相A为58％、流动相B为40％、流动相C为0％和流动相D为2％；
10～40min流动相A为58％→15％；流动相B为40％，流动相C为0％和流动相D为2％→45％；
40～45min流动相A为15％；流动相B为40％，流动相C为0％和流动相D为45％；
45～45.1min流动相A为15％→0％；流动相B为40％→0％，流动相C为0％→100％和流动相D为45％→0％；
45.1～55min流动相A为0％；流动相B为0％，流动相C为100％和流动相D为0％；
55～55.1min流动相A为0％→20％；流动相B为0％→80％，流动相C为100％→0％和流动相D为0％；
55.1～60min流动相A为20％；流动相B为80％，流动相C为0％和流动相D为0％；
60～60.1min流动相A为20％→58％；流动相B为80％→40％，流动相C为0％和流动相D为0％→2％；
60.1～65min流动相A为58％；流动相B为40％，流动相C为0％和流动相D为2％。
13.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述3’-唾液酸乳糖的进样浓度为0.20μg/mL～20.0μg/mL；所述6’-唾液酸乳糖的进样浓度为0.20μg/mL～20.0μg/mL；所述乳糖-N-四糖的进样浓度为0.20μg/mL～20.0μg/mL。
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