CN115112799A - 一种定性检测母乳中酸性低聚糖的方法 - Google Patents

一种定性检测母乳中酸性低聚糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种定性检测母乳中酸性低聚糖的方法，依次按下述步骤进行：(1)将母乳离心，去除上层脂肪和蛋白质，取离心产物的中间层；(2)加入乙醇，静置反应；(3)离心，取上清；(4)利用层析柱吸附，先用超纯水水洗，后用氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液；(5)将洗脱液通过液质联用进行分析。本发明提供的定性检测母乳中酸性低聚糖的方法，通过对提取工艺以及液相色谱和质谱参数的改进，使该方法可以准确的对来源于母乳样品的9种酸性低聚糖进行定性测定，同时，本方法还具备良好的重复性，适用于大规模的母乳样品的分析工作。

Description

一种定性检测母乳中酸性低聚糖的方法
技术领域
本发明涉及检测领域，特别涉及一种定性检测母乳中酸性低聚糖的方法。
背景技术：
在母乳中，母乳低聚糖(HMOs)是3-10个单糖由共价键连接组成的短链聚合物。HMOs由半乳糖(Galactose,Gal)，葡萄糖(Glucose,Glc)，N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine,GlcNAc)，岩藻糖(Fucose,Fuc)和唾液酸(Sialic acid,Sia)五种基础单糖聚合而成。其中唾液酸在母乳中存在形式是N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)。HMOs通常根据其化学电荷可分为两类：不含电荷的单糖(Glu，Gal，GlcNAc，Fuc)组成的中性低聚糖和带有Neu5Ac负电荷残基的酸性低聚糖。酸性低聚糖占HMOs总量的12-14％。母乳低聚糖具有促进大脑发育，调节肠道菌群，抗病毒，预防坏死性小肠结肠炎和调节上皮细胞和免疫细胞等功能。母乳中可能含有上千种低聚糖，但由于地理差异、泌乳阶段、分娩方式和遗传基因等因素的影响，会导致HMOs种类和含量发生变化。目前可以通过毛细管电泳、液相色谱、液相色谱-质谱和离子色谱等方法对HMOs进行定性定量的检测。HMOs种类繁多，且含量和种类变化复杂，用奶粉模拟母乳是特别复杂且困难的事情。建立对母乳中HMOs定性检测的方法，对母乳中不同种类的低聚糖进行含量变化的研究，总结出HMOs的种类和含量变化规律，这将以便于以后对婴幼儿配方奶粉中HMOs的添加提供依据，有利于配制出与中国母乳较为接近的婴幼儿配方奶粉。
因鉴于此，特提出此发明。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种定性检测母乳中酸性低聚糖的方法，该方法可实现对母乳中酸性低聚糖的分离提取和定性检测。
为了实现上述目的，本发明提供了一种定性检测母乳中酸性低聚糖的方法，依次按下述步骤进行：
(1)将母乳离心，去除上层脂肪和蛋白质，取离心产物的中间层；
(2)加入乙醇，静置反应；
(3)离心，取上清；
(4)利用层析柱吸附，先用超纯水水洗，后用氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液；
(5)将洗脱液通过液质联用进行分析。
优选或可选地，步骤(1)中离心的具体条件为3-5℃下8000-10000rpm离心25-35min，优选的，离心条件为4℃下10000rpm离心30min。
优选或可选地，步骤(2)中，加入乙醇的体积与步骤(1)中获得的中间层产物的体积比为2-3:1,优选为2:1。
优选或可选地，步骤(2)中，静置反应的环境温度为零下17-零下23℃，反应时间为25-35min，优选的，环境温度为零下20℃，反应时间为30min。
优选或可选地，步骤(3)中，离心的具体条件为3-5℃下3000-5000g离心25-35min，优选的，离心条件为4℃下4000g离心30min。
优选或可选地，步骤(4)中，所使用的的层析柱为Cleanert IC-A，且在吸附前经超纯水活化。
优选或可选地，步骤(4)中，所用的氯化钠溶液的浓度为40-60mmol/L。
优选或可选地，步骤(5)中，液质联用的液相色谱的参数为分析柱DionexIonPacTMAS19(2×250mm)，保护柱Dionex IonPacTMAG19(2×50mm)，电化学检测器，柱温：35℃；流动相A：超纯水，流动相D：50mmol/L NaOH溶液；抑制器电流：495mA，流速：2mL/min；洗脱条件：0-2min，95％A和5％D；25min时，80％A和20％D；45min时，70％A和30％D；45.1min时，95％A和5％D。
优选或可选地，步骤(5)中，液质联用的质谱的参数为：采用Q Exactive检测器进行检测，使用电喷雾离子源，喷雾电压为3.5kV，鞘气压力为35arb，辅气压力为10arb，加热温度为350℃，毛细管温度为320℃，碰撞能量为30V，在负离子模式下对550-2000m/z的物质进行Full MS/dd-MS2模式扫描。
本发明提供的定性检测母乳中酸性低聚糖的方法，通过对提取工艺以及液相色谱和质谱参数的改进，使该方法可以准确的对来源于母乳样品的9种酸性低聚糖进行定性测定，同时，本方法还具备良好的重复性，适用于大规模的母乳样品的分析工作。
附图说明
图1为对比例1中技术方案在负离子模式下酸性低聚糖的总离子流图；
图2为实施例1中技术方案在负离子模式下酸性低聚糖的总离子流图；
图3为对比例1中技术方案在负离子模式下酸性低聚糖3’-SL和6’-SL的总离子流图；
图4为实施例1中技术方案在负离子模式下酸性低聚糖3’-SL和6’-SL的总离子流图；
图5为实施例1中技术方案下的6’-SLNFP VI的二级质谱图；
图6为对比例2中技术方案下的6’-SLNFP VI的二级质谱图；
图7为对比例3中技术方案下的6’-SLNFP VI的二级质谱图；
图8为对比例4中技术方案下的6’-SLNFP VI的二级质谱图；
图9为对比例5中技术方案下的6’-SLNFP VI的二级质谱图；
图10为实施例1中技术方案下的3’-SL的二级质谱图；
图11为实施例1中技术方案下的6’-SL的二级质谱图；
图12为实施例1中技术方案下的6’-SLN的二级质谱图；
图13为实施例1中技术方案下的LSTc的二级质谱图；
图14为实施例1中技术方案下的DSLNT的二级质谱图；
图15为实施例1中技术方案下的MSLNnH的二级质谱图；
图16为实施例1中技术方案下的MSMFLNnH的二级质谱图；
图17为实施例1中技术方案下的DSMFLNnH的二级质谱图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本发明实施例提供了一种定性检测母乳中酸性低聚糖的方法。
取1mL母乳样品，在4℃下以10000rpm离心，以去除上层脂肪和少量蛋白质，取中心层，并转移到离心管中，加入两倍体积的无水乙醇，在-20℃下静置反应30min。
反应完成后，在4℃下以4000g离心30min，取上清液。
将上清液加入至经10mL超纯水活化后静置10min的Cleanert IC-A柱内，先使用5mL超纯水洗脱中性低聚糖和乳糖，后使用5mL 50mmol/L的氯化钠溶液洗脱酸性低聚糖，收集该部分洗脱液。
将收集到的洗脱液通过液质联用的方式进行分析。
其中，液相色谱的参数为：分析柱Dionex IonPacTMAS19(2×250mm)，保护柱DionexIonPacTMAG19(2×50mm)，电化学检测器，柱温：35℃。流动相A：超纯水，流动相D：50mmol/LNaOH溶液。抑制器电流：495mA，流速：2mL/min。洗脱条件：0-2min，95％A和5％D；25min时，80％A和20％D；45min时，70％A和30％D；45.1min时，95％A和5％D。
质谱的参数为：采用Q Exactive检测器进行检测。使用电喷雾离子源，喷雾电压为3.5kV，鞘气压力为35arb，辅气压力为10arb，加热温度为350℃，毛细管温度为320℃，碰撞能量为30V，在负离子模式下对550-2000m/z的物质进行Full MS/dd-MS2模式扫描。
对比例1
本对比例的其余步骤与实施例1均相同，区别在于，液相色谱的流动相与洗脱条件不同。
本对比例中，流动相D选择的是200mmol/L NaOH溶液，洗脱条件为：0-25min，5％-20％D；25-50min，20％-30％D；51-55min，60％D；55.1-60min，5％D。
效果实施例1
测定实施例1和对比例1在负离子模式下的酸性低聚糖的总离子流图，结果如图1和图2所示。
由图1可以看出，对比例1的技术方案中，酸性低聚糖全部集中在4-11min内被洗脱下来，因此，不同种类的酸性低聚糖并未得到很好的分离。
参考图2，而实施例1中的技术方案，通过对洗脱条件和流动相的特定选择，使不同种类的酸性低聚糖得到了较好的分离。
为了进一步的对比实施例1和对比例1的效果，选择互为同分异构体的酸性低聚糖3’-SL和6’-SL作为验证对象。
如图3-4所示，在对比例1的液相色谱条件下，3’-SL和6’-SL并未分离，而在优化液相色谱条件后(即实施例1中的技术方案)，3’-SL和6’-SL完全分离，且效果较好。
对比例2
本对比例的其余步骤与实施例1均相同，区别在于，质谱的碰撞能量为20V。
对比例3
本对比例的其余步骤与实施例1均相同，区别在于，质谱的碰撞能量为25V。
对比例4
本对比例的其余步骤与实施例1均相同，区别在于，质谱的碰撞能量为35V。
对比例5
本对比例的其余步骤与实施例1均相同，区别在于，质谱的碰撞能量为40V。
效果实施例2
绘制实施例1与对比例2-5的酸性低聚糖6’-SLNFP VI的二级质谱图，结果如图5-9所示。
由图5可知，在碰撞能量为30V时(实施例1)，会产生其特征碎片离子0,4A2-CO2(m/z306)，同时也会产生其他的B型、C型和跨环断裂碎片离子，以实现对酸性低聚糖6’-SLNFPVI的定性分析，而在其他的碰撞能量下，则无法实现该效果。
进一步的，根据能否进行定性分析测试其他8种酸性低聚糖的最适碰撞能量，结果如表1所示。
表1 8种低聚糖适宜的碰撞能量
编号 名称 电离方式 母离子(m/z) 碰撞能量(V)
S1 3’-SL -H 632.20 20、25、30
S2 6’-SL -H 632.20 20、25、30
S3 6’-SLN -H 673.23 25、30
S4 LSTc -H 997.33 25、30
S6 DSLNT -H 1288.43 30、35
S7 MSLNnH -H 1362.47 30
S8 MSMFLNnH -H 1508.52 30、35
S9 DSMFLNnH -H 1654.58 30、35
由表1可知，综合各酸性低聚糖的最适碰撞能量，碰撞能量为30V时可实现对全部8种酸性低聚糖的定性分析。
各酸性低聚糖在碰撞能量为30V时的二级质谱图如图10-17所示。由图10-17可以看出，在碰撞能量为30V时，上述的8种低聚糖均会产生该种低聚糖的特征碎片离子，同时也会产生其他的B型、C型和跨环断裂碎片离子，从而实现了该种低聚糖的定性分析。
效果实施例3
采用实施例1中所述的方法对母乳样品进行测定，定性的测定结果如表2所示。
表2样品中酸性低聚糖测定结果表
Figure BDA0003723053160000061
由表2可以看出，实施例1中的方法可以定向的对母乳中的9中酸性低聚糖进行定性测定。
进一步的，采用实施例1中的方法对该样品进行3次重复检测，比较响应值的平均值和相对标注偏差，结果如表3所示。
表3重复测试结果表
Figure BDA0003723053160000062
Figure BDA0003723053160000071
由表3可以看出，本发明实施例1中提供的方法对于母乳样品中酸性低聚糖测定的相对标准偏差交底，因此，该方法具备良好的重复性。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (9)

1.一种定性检测母乳中酸性低聚糖的方法，其特征在于，依次按下述步骤进行：
(1)将母乳离心，去除上层脂肪和蛋白质，取离心产物的中间层；
(2)加入乙醇，静置反应；
(3)离心，取上清；
(4)利用层析柱吸附，先用超纯水水洗，后用氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液；
(5)将洗脱液通过液质联用进行分析。
2.根据权利要求1所述的定性检测母乳中酸性低聚糖的方法，其特征在于，步骤(1)中离心的具体条件为3-5℃下8000-10000rpm离心25-35min，优选的，离心条件为4℃下10000rpm离心30min。
3.根据权利要求1所述的定性检测母乳中酸性低聚糖的方法，其特征在于，步骤(2)中，加入乙醇的体积与步骤(1)中获得的中间层产物的体积比为2-3:1,优选为2:1。
4.根据权利要求1所述的定性检测母乳中酸性低聚糖的方法，其特征在于，步骤(2)中，静置反应的环境温度为零下17-零下23℃，反应时间为25-35min，优选的，环境温度为零下20℃，反应时间为30min。
5.根据权利要求1所述的定性检测母乳中酸性低聚糖的方法，其特征在于，步骤(3)中，离心的具体条件为3-5℃下3000-5000g离心25-35min，优选的，离心条件为4℃下4000g离心30min。
6.根据权利要求1所述的定性检测母乳中酸性低聚糖的方法，其特征在于，步骤(4)中，所使用的的层析柱为Cleanert IC-A，且在吸附前经超纯水活化。
7.根据权利要求1所述的定性检测母乳中酸性低聚糖的方法，其特征在于，步骤(4)中，所用的氯化钠溶液的浓度为40-60mmol/L。
8.根据权利要求1所述的定性检测母乳中酸性低聚糖的方法，其特征在于，步骤(5)中，液质联用的液相色谱的参数为分析柱Dionex IonPacTMAS19(2×250mm)，保护柱DionexIonPacTMAG19(2×50mm)，电化学检测器，柱温：35℃；流动相A：超纯水，流动相D：50mmol/LNaOH溶液；抑制器电流：495mA，流速：2mL/min；洗脱条件：0-2min，95％A和5％D；25min时，80％A和20％D；45min时，70％A和30％D；45.1min时，95％A和5％D。
9.根据权利要求1所述的定性检测母乳中酸性低聚糖的方法，其特征在于，步骤(5)中，液质联用的质谱的参数为：采用Q Exactive检测器进行检测，使用电喷雾离子源，喷雾电压为3.5kV，鞘气压力为35arb，辅气压力为10arb，加热温度为350℃，毛细管温度为320℃，碰撞能量为30V，在负离子模式下对550-2000m/z的物质进行Full MS/dd-MS2模式扫描。
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