CN113686992A - 检测配方食品中目标母乳低聚糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测配方食品中目标母乳低聚糖的方法。所述目标母乳低聚糖可以包括或者为2’‑岩藻糖基乳糖、3‑岩藻糖基乳糖、3’‑唾液酸基乳糖、6’‑唾液酸基乳糖、乳糖‑双岩藻糖基四糖、乳糖‑N‑新四糖和乳糖‑N‑四糖中的一种或多种。所述方法包括将样品经除脂肪与蛋白后，采用还原剂例如NaBH₄还原，液相色谱‑质谱检测，外标法定量。该方法能够简便、快速、准确地定性和定量地检测目标母乳低聚糖(HMO)。

Description

检测配方食品中目标母乳低聚糖的方法

技术领域

本发明涉及食品领域。具体地，本发明涉及配方食品中目标母乳低聚糖的检测方法。

背景技术

母乳是新生儿最天然最优质的食品，母乳中含有各种营养物质，如蛋白质、脂肪、碳水化合物、无机盐和微量元素，它们的合理比例适合婴幼儿消化和吸收，此外母乳还含有生物活性物质，在短期内能起到抗感染的益处。

母乳低聚糖(Human milk oligosaccharides，HMO)是人类母乳中的第三大固体组分，仅次于乳糖和脂肪。母乳低聚糖是由3-22个单糖单元组成的游离聚糖。根据唾液酸的存在与否，HMO可分为两类：中性HMO和酸性HMO。 HMO的还原端都含有乳糖。基于乳糖的衍生，迄今已经鉴定了200多种母乳低聚糖分子种类。

研究表明，HMO具有重要的生物学功能，其有调节肠道菌群、抗粘附抗菌剂、调节免疫力、预防坏死性小肠结肠炎以及促进大脑发育的功效，其对婴幼儿生长发育提供积极作用，呵护宝宝健康成长。对HMO的研究可为母乳喂养，尤其是婴幼儿配方奶粉及相关营养品的开发提供依据。

1)调节肠道菌群

HMO被看成是人类第1益生元，其不被人体的胃酸破坏，也不被消化酶分解，能完整地、高浓度地到达远端小肠和结肠，并刺激肠道中的有益菌群 (双歧杆菌和乳杆菌)生长，间接抑制有害菌群生长，维持肠道微生态平衡。

研究表明，婴儿双歧杆菌能利用乳糖-N-四糖(LNT)(Gal-β-1,3-GIcNAc-β- l,3-Gal-β-1,4-Glc)和乳糖-N-新四糖(LNnT)(Gal-β-1,4-GlcNAc-β-1,3-Galβ-1,4- Glc)，因为其细胞内的岩藻糖酶、唾液酸酶和/或半乳糖苷酶可以水解低聚糖，从而将低聚糖利用。

2)抗粘附抗菌剂

HMO既可以通过提高非致病菌共生体的竞争优势来间接抑制致病菌的生长，也能直接充当抗粘附抗菌剂减少微生物感染。

大部分病毒、细菌或原声动物病原体需要首先粘附在黏膜表面，然后才能定植、侵入宿主或引起疾病。一些HMO和黏膜细胞表面的糖链结构相似，可作为可溶的诱饵型受体来组阻止病原体结合到黏膜上，减少感染的风险。

HMO同时也对一些病毒和寄生虫起到一定的粘附抑制作用。能抑制病毒或寄生虫对婴幼儿的感染风险。

3)调节免疫力

HMO影响婴儿的肠道菌群组成或肠上皮细胞的反应，从而间接影响婴儿的免疫系统，但体外研究的结果也表明HMO能直接调节免疫反应。HMO或者局部地在黏膜相关淋巴组织的细胞起作用，或者在系统层面上起作用，因为约1％HMO被吸收后到达体循环。

研究发现，唾液酸化的HMO可影响淋巴细胞的成熟，促进T细胞应答转向一个更加平衡的Th1/Th2-细胞因子的生产和低水平的免疫。某些唾液酸化的HMO可能起到预防过敏的作用。某些岩藻糖基化的HMO，可以刺激巨噬细胞活性，增加前列腺素E2、IL-10盒TNFa的分泌。

4)预防坏死性小肠结肠炎(NEC)

NEC是早产儿最常见和致命的一种疾病，出生体重较轻的婴儿(<1500g) 中有5％-10％的会患上NEC，有超1/4的婴儿死亡，存活者也会面临严重的神经系统并发症。Jantscher-Krenn等研究验证HMO能预防NEC。当HMO 添加到口服饲料的配方后，大鼠的存活率和病理评分得到了改善。

5)促进大脑发育

人乳中含有丰富的唾液酸，而唾液酸化的HMO是母乳中唾液酸的主要来源。大量证据表明，大脑发育与认知依赖含唾液酸基的神经节甘脂和含多聚唾液酸基的糖蛋白。

由于HMO的生物重要性及其在生物合成方面取得进展，因此已经批准将HMO作为强化剂添加至婴幼儿配方食品。

目前国外法规例如GRAS和EFSA对于婴幼儿配方奶粉已经准入或者即将准入的HMO涉及如下几种HMO。

1)2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)和3-岩藻糖基乳糖(3-FL)

2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)和3-岩藻糖基乳糖(3-FL)均为由L-岩藻糖、D-半乳糖和D-葡萄糖单元组成的中性三糖，两者是同分异构体。在2’-FL中，单糖L-岩藻糖通过α(1→2)键与二糖D-乳糖相连，而在3-FL中，单糖L-岩藻糖通过α(1→3)键与二糖D-乳糖相连。其分子式、分子量和结构如下。

在已鉴定的200多种HMO中，2’-FL含量最高(Castanys-Munoz等， 2013)。2’-FL是一种功能性HMO，少量存在于奶牛(奶牛的前奶)中，但不存在于商业化的乳制品中，而在人乳中含量丰富。

3-岩藻糖基乳糖(3-FL)是一种天然存在于人乳中的低聚糖。3-FL可通过如下而生产：使用一种基因工程技术处理过的大肠杆菌BL21(DE3)菌株发酵，然后从培养基中纯化，喷雾干燥成纯度≥90％的粉末。残留杂质包括乳糖和其它碳水化合物副产品。重要的是，发酵产生的3-FL的结构与人乳中的3-FL 的结构一致，并被多种检测技术所证实，如：液相色谱联用串联质谱(LC- MS/MS)、¹H核磁共振波谱(NMR)、¹³C NMR、双量子过滤¹H¹H相关光谱(COSY)、相敏¹H¹³C-异核单量子相关光谱(HSQC)和相敏¹H¹³C-异核多键相关光谱(HMBC)。

2)3’-唾液酸基乳糖(3’-SL)和6’-唾液酸基乳糖(6’-SL)

母乳中发现的天然存在的低聚糖(HMO)中约有15％至20％(总HMO部分占母乳的10至15g/L)由酸性低聚糖组成。这些酸性低聚糖含有唾液酸 (SA)(其是一种具有九碳骨架的酸性糖)，被鉴定为唾液酸化HMO(Bode，2012 年)。最受认可的唾液酸化HMO是两种三糖异构体--3’-和6’-唾液酸基乳糖，它们都是乳糖唾液酸化的结果，占酸性HMO的很大一部分。3’-和6’-唾液酸基乳糖由还原端的乳糖和非还原端的SA残基分别通过α2,3或α2,6键组成。

3’-和6’-唾液酸基乳糖通常以钠盐形式存在。其分子式、分子量和结构如下。

3)乳糖-双岩藻糖基四糖(DFL)

DFL由两个单位的L-岩藻糖、一个单位的D-半乳糖和一个单位的D- 葡萄糖组成。其是2’-FL的衍生物，其中第二个岩藻糖已添加到2’-FL的3- 葡萄糖位置。它是一种中性四糖，在母乳中的含量低于2’-FL(约0.5g/L)。除了在人乳中的突出作用外，DFL还被Taufik等(2012)报道为狐猴aye-aye 乳汁中的一种特征性乳低聚糖，并且是鸭嘴兽和针鼹等单孔目动物乳汁中的主要碳水化合物(Messer and Kerry,1973)。

4)乳糖-N-新四糖(LNnT)和乳糖-N-四糖(LNT)

乳糖-N-新四糖(LNnT)和乳糖-N-四糖(LNT)均为由D-半乳糖、N-乙酰基 -D-葡糖胺、D-半乳糖和D-葡萄糖组成的线性四糖，两者是同分异构体，其中在LNnT中，末端D-半乳糖通过β-(1→4)键连接到N-乙酰基-D-葡糖胺(GlcNAc)，通过β-(1→3)键连接到D-半乳糖，通过β-(1→4)键连接到还原端 D-葡萄糖；而在LNT中，末端D-半乳糖通过β-(1→3)键连接到N-乙酰基- D-葡糖胺(GlcNAc)，通过β-(1→3)键连接到D-半乳糖，通过β-(1→4)键连接到还原端D-葡萄糖。其分子式、分子量和结构如下。

乳糖-N-新四糖是人乳中含量最丰富的低聚糖之一。GRAS用于婴儿配方奶粉和常规食品中LNnT的合成形式是通过化学合成和发酵生产(GRN 547；GRN 659)。作为此GRAS测定对象的LNnT是一种喷雾干燥的粉末状产品，通过两种不同的基因过程编码后大肠杆菌BL21(DE3)菌株从D-葡萄糖、果糖、蔗糖或甘油发酵合成。成品含有不少于92％的LNnT，与GRN 547和659的化学性质相似。此外，Jennewein生产的LNnT在结构上与人类母乳中发现的LNnT拥有相同的结构，并且经过各种检测技术证实，如：¹H和¹³C核磁共振(NMR)光谱、双量子过滤1H1H-COSY NMR光谱、相敏¹H¹³C-异核单量子相关(HSQC)NMR光谱、相敏¹H¹³C-异核多键相关(HMBC) NMR光谱，以及液相色谱与串联质谱联用(LC-MS/MS)。由于用于合成LNnT 的酶的特异性，生产中会产生副产品包括乳糖、中间体乳糖-N-三糖(LNT II) 和对-乳糖-N-新六糖(pLNnH)。重要的是，这些碳水化合物副产品也被称为人类低聚糖，类似于GRN 659中报道的那些。

乳糖-N-四糖是人乳中含量最丰富的低聚糖之一。它是人乳中最丰富的核心结构之一，可以通过添加岩藻糖基或唾液酸残基进一步修饰。

由于HMO、例如GRAS和EFSA对于婴幼儿配方奶粉已经准入或者即将准入的上述7种HMO的重要作用，因此在配方奶粉以及其它相关产品的新配方开发和质量控制过程需要可靠的HMO定性和定量检测标准。

目前，HMO的测定手段有高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法、毛细管电泳法、离子色谱法等。分离原理基本依据不同HMO的结构与固定相的相互作用能力的大小等差异进行分离。

HILIC(亲水作用色谱)(Luna HILIC,HILIC/WAX(弱阴离子交换)混合模式UPLC(超高效液相色谱)HILIC)对酸性糖的分离效果较好，对中性糖，特别是LNnT和LNT这对异构体分离度非常差。由于HMO本身没有发色基团，因此需要进行衍生，此手段虽然可用常规的紫外、荧光检测器对HMO 进行定量，但是操作步骤繁琐，定量受衍生产物、试剂批次等条件影响大，应用上存在局限性。

PGC对酸性和中性HMO分离度均较好，虽然酸性糖(3’-SL)的保留时间不是非常稳定，但不影响结果，因此可以选择PGC作为分离介质。此外，洗脱酸性糖需要0.1％乙酸/甲(乙)酸铵，HMO在正离子和负离子模式下的响应相似，离子模式干扰离子较少，因此常规采用负离子作为扫描模式。HMO离子化过程中会形成多种离子，-H，-H+NH4，-H+Na，-H+甲酸/乙酸等，选择其中强度最高的离子进行定量。但是基质的影响和电离抑制使得HMO的定量分析即使采用质谱方法也存在不少困难，混合的HMO中的各组分在检测中存在相互抑制，从而导致不同电离效率。另外，多数HMO都会形成异头体(双峰)，增加分离难度。

因此，本领域中仍然需要一种改进的检测配方食品中目标HMO的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种配方食品、尤其是婴幼儿配方奶粉和特殊医学用途配方食品中目标母乳低聚糖(HMO)的检测方法，其克服了现有技术中的上述缺陷，能够简便、快速、准确地定性和定量地检测目标母乳低聚糖(HMO)。

根据本发明，提供了一种检测配方食品中目标母乳低聚糖(HMO)的方法，其包括如下步骤：

(1)提供待检测配方食品的样品水溶液，该配方食品包含母乳低聚糖，并且任选地包含脂肪和/或蛋白质；

(2)分离样品水溶液以除去脂肪和蛋白质，以形成经分离处理的水溶液；

(3)将得自步骤(2)的水溶液中母乳低聚糖的还原端异头基使用过量还原剂还原成二醇结构；

(4)采用液相色谱对得自步骤(3)的水溶液进行梯度洗脱并且采用与液相色谱串联的质谱检测所洗脱的物质；

(5)将所洗脱的物质的色谱峰的保留时间以及质谱信号与待检测的目标母乳低聚糖标准物各自在与步骤(4)相同条件下获得的标准色谱峰的保留时间以及标准质谱的信号进行比较，

-(5-1)以确定样品中是否存在待检测的目标母乳低聚糖，或

-(5-2)以确定样品中是否存在待检测的目标母乳低聚糖并且确定样品中所存在的目标母乳低聚糖各自的色谱峰面积，然后根据外标法得到样品水溶液中各目标母乳低聚糖的浓度，然后根据该浓度计算试样中各目标母乳低聚糖的含量。

所述目标母乳低聚糖可以包括或者为选自如下7种母乳低聚糖的一种或多种例如2、3、4、5、6、或7种：2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、3’- 唾液酸基乳糖、6’-唾液酸基乳糖、乳糖-双岩藻糖基四糖、乳糖-N-新四糖和乳糖-N-四糖。

所述待检测配方食品可以为婴幼儿配方食品例如婴幼儿配方奶粉(例如婴儿配方食品例如婴儿配方奶粉、幼儿配方食品例如幼儿配方奶粉)、或特殊医学用途配方食品。

通过分离除去脂肪和蛋白质、采用还原剂进行选择性还原等手段，本发明解决了同一多糖异头基双峰的问题，极大地去除了干扰性杂质，提高了质谱的灵敏度，增大了检测灵敏度，使得使检出限定量限达到ppm级别，并且解决了无法分离LNT与LNnT的缺陷。本发明的方法能够简便、快速、准确地定性和定量地检测目标母乳低聚糖(HMO)。

附图说明

图1为在用NaBH₄还原情况下测定的样品溶液中目标母乳低聚糖各自的出峰位置；

图2为在未用NaBH₄还原情况下测定的样品溶液中目标母乳低聚糖各自的出峰位置。

图3-6显示了7种目标母乳低聚糖标准物的(ESI-)离子扫描图。

具体实施方式

本发明提供了一种检测配方食品中目标母乳低聚糖(HMO)的方法，其包括如下步骤：

(1)提供待检测配方食品的样品水溶液，该配方食品包含母乳低聚糖，并且任选地包含脂肪和/或蛋白质；

(2)分离样品水溶液以除去脂肪和蛋白质；

(3)将得自步骤(2)的水溶液中母乳低聚糖的还原端异头基使用过量还原剂还原成二醇结构；

(4)采用液相色谱对得自步骤(3)的水溶液进行梯度洗脱并且采用与液相色谱串联的质谱检测所洗脱的物质；

(5)将所洗脱的物质的色谱峰的保留时间以及质谱信号与待检测的目标母乳低聚糖标准物各自在与步骤(4)相同条件下获得的标准色谱峰的保留时间以及标准质谱的信号进行比较，

-(5-1)以确定样品中是否存在待检测的目标母乳低聚糖，或

-(5-2)以确定样品中是否存在待检测的目标母乳低聚糖并且确定样品中所存在的目标母乳低聚糖各自的色谱峰面积，然后根据外标法得到样品水溶液中各目标母乳低聚糖的浓度，然后根据该浓度计算试样中各目标母乳低聚糖的含量。

在本发明方法的一种实施方案中，所述目标母乳低聚糖包括或者为选自如下7种母乳低聚糖的一种或多种例如2、3、4、5、6、或7种：2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、3’-唾液酸基乳糖(3’-SL)、6’-唾液酸基乳糖(6’-SL)、乳糖-双岩藻糖基四糖(DFL)、乳糖-N-新四糖(LNnT)和乳糖- N-四糖(LNT)。

关于步骤(1)，在一种实施方案中，待检测配方食品可以为婴幼儿配方食品(婴儿配方食品、幼儿配方食品)、或特殊医学用途配方食品。在一种具体实施方案中，该配方食品包含母乳低聚糖，以及脂肪和/或蛋白质；例如，该该配方食品包含母乳低聚糖，以及脂肪和蛋白质。

在一种实施方案中，待检测配方食品为液体含水溶液形式、固体形式、或者固体-液体混合物(半固体)形式。

对于本发明的检测方法而言，待检测配方食品样品需要为均匀的水溶液形式。

在一种具体实施方案中，待检测配方食品为液体含水溶液形式，并且提供待检测配方食品的样品水溶液包括：提供液体含水溶液形式的待检测配方食品，任选地将该含水溶液稀释，以形成待检测配方食品的样品水溶液。

在一种具体实施方案中，待检测配方食品为固体形式，并且提供待检测配方食品的样品水溶液包括：提供固体形式的待检测配方食品，任选地将该待检测配方食品粉碎(研磨)，将该任选地经粉碎的待检测配方食品溶解于水中以形成待检测配方食品的样品水溶液。当待检测配方食品为基质均匀的粉状样品时，可以将其直接溶解于水中而无需研磨或粉碎步骤。当该待检测配方食品为基质不均匀的固体样品例如粗粒、大块、结块、团聚等形式时，优选进行研磨或粉碎以促进溶解。

在一种具体实施方案中，待检测配方食品为固体-液体混合物形式(半固体形式)，并且提供待检测配方食品的样品水溶液包括：提供固体-液体混合物形式的待检测配方食品，任选地将该待检测配方食品匀浆(研磨)，将该任选地经匀浆的待检测配方食品用水稀释溶解以形成待检测配方食品的样品水溶液。当该待检测配方食品为其中固体颗粒细小的均匀的固体-液体混合物形式时，可以将其直接用水稀释溶解而无需研磨或匀浆步骤。将该待检测配方食品为其中固体颗粒不均匀例如为粗粒、大块、结块、团聚等形式时，优选进行研磨或匀浆，然后用水稀释以促进溶解。

制备好的试样优选于0℃～5℃保存，尽快测定。

在一种具体实施方案中，该配方食品包含2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、3’-唾液酸基乳糖、6’-唾液酸基乳糖、乳糖-双岩藻糖基四糖、乳糖-N- 新四糖和乳糖-N-四糖中的1种、2种、3种、4种、5种、6种或7种。

关于步骤(2)，通过分离样品水溶液以除去其中的脂肪和蛋白质，极大地去除了样品溶液中对后续色谱-质谱造成干扰的物质，提高了质谱的灵敏度，提高测量结果的精确性，从而提高了质谱的灵敏度。

在一种实施方案中，分离样品水溶液以除去脂肪和蛋白质的步骤包括：分离样品水溶液中的脂肪的步骤，和分离样品水溶液中的蛋白质的步骤。

在一种具体实施方案中，分离样品水溶液中的脂肪的步骤可通过离心进行。在一种具体实施方案中，该离心可进行一次或多次。该离心过程除去样品水溶液中的脂肪，减少对后续色谱-质谱造成干扰的物质，提高质谱的灵敏度，提高测量结果的精确性。将离心过程重复多次可以提高HMO的回收率，进一步减少干扰性物质。

在一种具体实施方案中，分离样品水溶液中的蛋白质的步骤可通过超滤进行。该超滤可以通过使用超滤管在离心机中进行。该超滤可进行一次或多次。该超滤过程可以除去样品水溶液中的蛋白质、脂肪等大分子，并且还可以除去盐类等小分子物质，减少对后续色谱-质谱造成干扰的物质，提高质谱的灵敏度，提高测量结果的精确性。将超滤过程重复多次可以提高HMO的回收率，进一步减少干扰性物质。

各离心和超滤过程可各自独立地在1-30℃、优选1-25℃，例如1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30℃的温度下进行。优选采用较低的温度，因为这可以降低脂肪和蛋白质在水中的溶解度，从而能够将样品水溶液中的脂肪和蛋白质更多地除去，减少对后续色谱-质谱造成干扰的物质，提高质谱的灵敏度，提高测量结果的精确性。

关于步骤(3)，在该步骤中将得自步骤(2)的水溶液中HMO的还原端异头基使用相对于母乳低聚糖过量的还原剂还原。优选地，还原剂相对于HMO 以大于1:0至10:1、优选2:1至8:1、优选3:1至6:1、优选4:1至5:1例如 1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2.0:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3.0:1、3.1:1、3.2:1、 3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4.0:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、 4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1、5.0:1、5.1:1、5.2:1、5.3:1、5.4:1、5.5:1、5.6:1、5.7:1、5.8:1、5.9:1、6.0:1、6.1:1、6.2:1、6.3:1、6.4:1、6.5:1、 6.6:1、6.7:1、6.8:1、6.9:1、7.0:1、7.1:1、7.2:1、7.3:1、7.4:1、7.5:1、7.6:1、 7.7:1、7.8:1、7.9:1、8.0:1、8.1:1、8.2:1、8.3:1、8.4:1、8.5:1、8.6:1、8.7:1、 8.8:1、8.9:1、9.0:1、9.1:1、9.2:1、9.3:1、9.4:1、9.5:1、9.6:1、9.7:1、9.8:1、9.9:1、或者10.0:1的摩尔比例使用。当还原剂相对于HMO过量使用时，可以保证HMO的还原端异头基被充分还原。

在一种实施方案中，还原剂可以为将母乳低聚糖的还原端异头基选择性还原成二醇而不引起母乳低聚糖的其它部分的反应的任何还原剂。优选地，还原剂为硼氢化钠(NaBH₄)、硼氢化钾(KBH₄)，优选硼氢化钠(NaBH₄)。

多数HMO都会形成异头体(其在色谱图中导致双峰)，增加分离难度。通过使用还原剂例如NaBH₄来选择性还原母乳低聚糖的还原端异头基，可以将HMO的还原端部分的乳糖结构开环并形成二醇结构，从而在色谱图中导致单峰，解决了同一多糖异头基双峰的问题。该反应示意性地显示于下。

在一种实施方案中，该还原可在任何合适的温度例如5-50℃、优选10- 45℃、优选15-40℃、优选20-40℃下进行。

在一种实施方案中，步骤(3)进一步包括在使用还原剂还原后，将过量的还原剂使用酸中和。优选地，该中和使用足以中和过量还原剂的酸进行。所述酸可以为甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等中的一种或多种。优选地，所述酸为甲酸。在还原后使用酸中和可以防止还原剂例如硼氢化钠损坏色谱柱。

在一种实施方案中，步骤(3)进一步包括在酸中和之后脱盐的步骤。该脱盐步骤可采用水相滤膜进行。该脱盐步骤可以减少盐对色谱柱以及质谱的影响。

关于步骤(4)，在一种实施方案中，该液相色谱使用多孔石墨化碳色谱柱进行。

在一种实施方案中，该梯度洗脱中的各次洗脱所使用的洗脱液分别由如下构成：甲酸和或乙酸；甲酸铵和/或乙酸铵；水；和乙腈。优选地，该梯度洗脱中的各次洗脱所使用的洗脱液分别由如下构成：乙酸；乙酸铵；水；和乙腈。

优选地，该梯度洗脱中的各次洗脱所使用的洗脱液含有0.01-0.50％体积、例如0.05-0.40％体积、例如0.10-0.20体积％例如0.01、0.02、0.03、0.04、 0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、 0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、 0.29、0.30、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.40、 0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49、0.50％体积的甲酸和 /或乙酸例如乙酸。

优选地，该梯度洗脱中的各次洗脱所使用的洗脱液所含的甲酸铵和/或乙酸铵的浓度为0.001-0.050mol/L、优选0.002-0.040mol/L、优选0.003-0.020 mol/L、优选0.004-0.010mol/L、优选0.005-0.008mol/L例如0.001、0.002、 0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.010、0.011、0.012、0.013、 0.014、0.015、0.016、0.017、0.018、0.019、0.020、0.021、0.022、0.023、0.024、 0.025、0.026、0.027、0.028、0.029、0.030、0.031、0.032、0.033、0.034、0.035、 0.036、0.037、0.038、0.039、0.040、0.041、0.042、0.043、0.044、0.045、0.046、 0.047、0.048、0.049、0.050mol/L。

优选地，该梯度洗脱中的各次洗脱所使用的洗脱液所含的乙腈的浓度在 1.0-98.0％体积、优选1.5-97.0％体积、优选2.0-96.0％体积、优选2.5-95.0％体积范围内选择。

在一种实施方案中，所述梯度洗脱采用6种洗脱液进行6次洗脱。其中各次洗脱时使用的洗脱液中的甲酸和/或乙酸、以及甲酸铵和/或乙酸铵的浓度的浓度如上所述。进一步地，各次洗脱时使用的洗脱液中的乙腈浓度如下：

第一次洗脱：1.0-5.0％体积、优选1.5-4.0％体积、优选2.0-3.5％体积、优选2.5-3.0体积，例如1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、 2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、 3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0％体积；

第二次洗脱：第二次洗脱时的洗脱液的乙腈浓度大于第一次洗脱时的洗脱液的乙腈浓度并且为5.0-10.0％体积、优选6.0-9.0％体积、优选7.0-8.0％体积例如5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、 7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、 9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0％体积；

第三次洗脱：第三次洗脱时的洗脱液的乙腈浓度大于第二次洗脱时的洗脱液的乙腈浓度并且为10.0-15.0％体积、优选11.0-14.0％体积、优选12.0- 13.0％体积例如10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、 11.0、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12.0、12.1、12.2、 12.3、12.4、12.5、12.6、12.7、12.8、12.9、13.0、13.1、13.2、13.3、13.4、 13.5、13.6、13.7、13.8、13.9、14.0、14.1、14.2、14.3、14.4、14.5、14.6、 14.7、14.8、14.9、15.0％体积；

第四次洗脱：第四次洗脱时的洗脱液的乙腈浓度大于第三次洗脱时的洗脱液的乙腈浓度并且为15.0-25.0％体积、优选16.0-24.0％体积、优选17.0- 23.0％、优选18.0-21.0％、优选19.0-20.0％体积例如15.0、15.1、15.2、15.3、 15.4、15.5、15.6、15.7、15.8、15.9、16.0、16.1、16.2、16.3、16.4、16.5、 16.6、16.7、16.8、16.9、17.0、17.1、17.2、17.3、17.4、17.5、17.6、17.7、 17.8、17.9、18.0、18.1、18.2、18.3、18.4、18.5、18.6、18.7、18.8、18.9、 19.0、19.1、19.2、19.3、19.4、19.5、19.6、19.7、19.8、19.9、20.0、20.1、 20.2、20.3、20.4、20.5、20.6、20.7、20.8、20.9、21.0、21.1、21.2、21.3、 21.4、21.5、21.6、21.7、21.8、21.9、22.0、22.1、22.2、22.3、22.4、22.5、 22.6、22.7、22.8、22.9、23.0、23.1、23.2、23.3、23.4、23.5、23.6、23.7、 23.8、23.9、24.0、24.1、24.2、24.3、24.4、24.5、24.6、24.7、24.8、24.9、 25.0％体积；

第五次洗脱：90.0-98.0％体积、优选91.0-97.0％体积、优选92.0-96.0％体积、优选优选93.0-95.0％体积例如90.0、90.1、90.2、90.3、90.4、90.5、90.6、 90.7、90.8、90.9、91.0、91.1、91.2、91.3、91.4、91.5、91.6、91.7、91.8、 91.9、92.0、92.1、92.2、92.3、92.4、92.5、92.6、92.7、92.8、92.9、93.0、 93.1、93.2、93.3、93.4、93.5、93.6、93.7、93.8、93.9、94.0、94.1、94.2、 94.3、94.4、94.5、94.6、94.7、94.8、94.9、95.0、95.1、95.2、95.3、95.4、95.5、95.6、95.7、95.8、95.9、96.0、96.1、96.2、96.3、96.4、96.5、96.6、 96.7、96.8、96.9、97.0、97.1、97.2、97.3、97.4、97.5、97.6、97.7、97.8、 97.9、98.0％体积；

第六次洗脱：1.0-5.0％体积、优选1.5-4.0％体积、优选2.0-3.5％体积、优选2.5-3.0体积，例如1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、 2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、 3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0％体积。

在一种优选实施方式中，各次洗脱中使用的洗脱液使用相同的酸，并且使用相同的酸铵盐(例如，均使用甲酸和甲酸铵，或者均使用乙酸和乙酸铵)，并且各洗脱液具有相同的甲酸浓度和相同的甲酸铵浓度或者相同的乙酸浓度和相同的乙酸铵浓度。

该梯度洗脱条件也可以为本领域中使用色谱方法分离检测HMO的其它条件。

在一种实施方案中，该质谱采用正离子扫描模式或者负离子扫描模式，优选地，采用负离子扫描模式。HMO在正离子和负离子模式下的响应类似，但是使用负离子模式时干扰离子较少。

关于步骤(5)，通过色谱峰的保留时间与质谱峰信号的组合，可以区分不同的母乳低聚糖，也可进而测定各目标母乳低聚糖的含量。

在洗脱时不同的保留时间通常意味着不同的母乳低聚糖物质。在梯度淋洗时也可能存在多种母乳低聚糖在洗脱曲线中难以清楚地区分开(例如在色谱图中色谱峰完全或者部分地重叠)的情形。质谱可以用于区分不同分子量的母乳低聚糖。由于色谱峰重叠的这些母乳低聚糖的分子量的差异，其在质谱中的信号(例如母离子、定性离子的信号)不同，因此通过质谱可以清楚地将其区分，并且还可以根据各自的特征离子的相对丰度确定相应母乳低聚糖的比例。因此，当将液相色谱与质谱串联使用时，可以更清晰地区分色谱峰重叠的不同母乳低聚糖并且确定其比例，从而可以得到所洗脱的各母乳低聚糖在进行梯度淋洗时的保留时间以及色谱峰面积，进而可以绘制所洗脱的各母乳低聚糖在进行梯度淋洗时的保留时间对相对丰度的洗脱曲线。

因此，通过将所洗脱的各母乳低聚糖在进行梯度淋洗时的保留时间以及质谱信号与待检测的目标母乳低聚糖标准物各自在与步骤(4)相同条件下获得的标准色谱峰的保留时间以及标准质谱的信号进行比较，可以确定样品中是否存在待检测的目标母乳低聚糖(如果样品存在与目标母乳低聚糖标准物的保留时间和质谱峰信号一致的信号，则可以定性确定存在该目标母乳低聚糖)，并且还可以确定样品中所存在的目标母乳低聚糖各自的色谱峰面积(样品水溶液的洗脱曲线中各目标母乳低聚糖的色谱峰面积)。

待检测的目标母乳低聚糖标准物各自的标准色谱峰以及标准质谱可通过将待检测的目标母乳低聚糖标准物各自的水溶液在与步骤(4)相同的色谱和质谱条件下经历色谱和质谱而获得。

当需要定量测定各目标母乳低聚糖的含量时，可以进一步采用外标法来由样品水溶液的洗脱曲线中各目标母乳低聚糖的色谱峰面积得到样品水溶液中各目标母乳低聚糖的浓度。外标法是本领域技术人员所知晓的。在本发明中，根据外标法得到样品水溶液中各目标母乳低聚糖的浓度可通过如下进行：

(i)配制各目标母乳低聚糖标准物质的多种浓度的系列水溶液；

(ii)在与步骤(4)相同的液相色谱-质谱条件下，将上述系列溶液由低到高浓度进样检测，以得到各目标母乳低聚糖标准物的色谱峰面积对浓度的标准曲线；

(iii)由所测样品的洗脱曲线中各目标母乳低聚糖的色谱峰面积，根据该标准曲线，得到样品水溶液中各目标母乳低聚糖的浓度。

然后，可根据下式计算试样中各目标母乳低聚糖的含量：

其中：

X为试样中各HMO的质量分数，以微克每百克(mg/100g)表示；

c为根据标准曲线计算的溶液中各目标母乳低聚糖的浓度，单位为毫克每升(mg/mL)；

V为步骤(1)中的样品溶液的最终定容体积，单位为毫升(mL)；

m为步骤(1)中的固体质量，单位为克(g)。

样品水溶液中待测物的相应值应在标准曲线的线性范围内，超过线性范围应适当稀释后重新测定。优选地，样品水溶液中待测物的浓度使得样品水溶液浓度位于标准曲线浓度范围40％～60％区域内。这些是本领域技术人员能够理解的。

与现有技术相比，本发明①通过在前处理中增加通过硼氢化钠还原，解决了同一多糖异头基双峰的问题；②使用的流动相与目前使用相同色谱柱的方法不冲突，③在前处理中增加了超滤，极大地去除了干扰性杂质，提高了质谱的灵敏度，④目标化合物只筛选了国内外法规已经准入或即将准入的7 种HMO，实用性强，与其它方法相比，增大了检测灵敏度，⑤与现有技术相比，解决了无法分离LNT与LNnT的缺陷，本方法使两个异构体完美分离。

本方案的检测方法能简便、快速、定性和定量分析母乳低聚糖，例如如下7种母乳低聚糖：2’-FL、3-FL、3’-SL、6’-SL、DFL、LNnT、LNT。本发明方法的检出限定量限能够达到ppm级别。

实施例

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

1.试剂和材料

1.1试剂

除非另有规定，否则所使用的以下试剂为分析纯试剂，并且所使用的以下各试剂均由国药集团提供。

1.1.1水：GB/T 6682，一级。

1.1.2硼氢化钠(NaBH₄)，分析纯。

1.1.3乙酸(CH₃COOH)，分析纯。

1.1.4乙酸铵(CH₃COONH₄)，分析纯。

1.1.5乙腈(CH₃CN)：色谱纯。

1.2试剂配制

1.2.1硼氢化钠溶液(0.25mol/L)：称取0.95g硼氢化钠(1.1.2)于100mL 烧杯中，加入80mL水(1.1.1)，磁力搅拌溶解后，转移至100mL聚乙烯容量瓶中，用水(1.1.1)定容至刻度，现用现配。

1.2.2乙酸溶液(0.25mol/L)：吸取0.75mL乙酸(1.1.3)，用水(1.1.1)稀释至50mL，4℃保存，可放置2个月。

1.2.3流动相A：吸取1mL乙酸(1.1.3)，称取0.39g乙酸铵(1.1.4)，加入到1000mL容量瓶中，加水(1.1.1)定容至刻度，混匀。

1.2.4流动相B：吸取1mL乙酸(1.1.3)，称取0.39g乙酸铵(1.1.4)，加入到1000mL容量瓶中，加入50mL水(1.1.1)，待乙酸铵溶解后，用乙腈 (1.1.5)定容至刻度，摇匀。

1.3标准物质

所使用的标准物质均来自Carbosynth，详细信息见表1所示。

表1：使用的标准物质信息

1.4标准溶液的配制

根据待测样品中添加的各HMO量，使用1.3中的HMO标准物质配制 HMO标准物的一系列浓度的水溶液，使样品水溶液浓度位于标准曲线浓度范围的40％～60％区域。

1.5材料

4.5.1微孔滤膜：水相，0.22μm(ANPEL，SCAA-102)。

2.仪器和设备

2.1高效液相色谱-高分辨质谱联用仪：带电喷雾离子源(LTQ-Orbitrap VelosPro，Thermo)。

2.2天平：感量0.01g、0.1mg。

2.3离心机：转速不低于10000转/min。

2.4定量移液器：100μL～1mL。

2.5离心管：2mL。

2.6超滤管：截留分子量为10kDa(

Ultra，UFC801024)。

2.7涡旋混和器。

2.8超声波振荡器。

2.9恒温水浴摇床。

3.样品前处理

3.1试样制备

称取奶粉50.0g(m₁)至250mL干燥玻璃瓶中，加入约200g温水(约 40～45℃)，记录加水后的溶液质量(m₂)。充分混匀溶解，室温避光放置15 min，超声震荡，每隔5min振摇30s。称取制备后的溶液5.00g(m₃)至50 mL带螺旋盖的离心管中。计算粉末样品质量(m_s)：

上述奶粉是通过将黑龙江飞鹤乳业有限公司星飞帆2段较大婴儿配方奶粉与表4中所示添加量的7种HMO复配得到的。

3.2提取

将包含上述3.1样品溶液的离心管置于离心机中，在4℃，10000转/min 条件下离心20min，丢弃上层脂肪。取下层清液200μL至超滤管(2.6)中， 5000转/min条件下离心20min，保留底管中滤液。

3.3异头基还原

取3.2中得到的滤液100μL于10mL具塞玻璃试管中，加入100μL硼氢化钠溶液(1.2.1)，旋涡振荡混匀，置于40℃±1℃恒温水浴摇床中振摇15min 后，取出，冷却至室温。缓慢加入120μL乙酸溶液(1.2.2)，室温下放置20 min，或直至不再产生气泡为止。试样溶液通过0.22μm水相滤膜过滤后，上机测试。同时做试剂空白试验。

4液相色谱-串联质谱参考条件

4.1液相色谱参考条件

①液相色谱柱：Hypercarb多孔石墨化碳色谱柱(柱长150cm，柱内径4.6 mm，填料粒径5μm)或相当。

②流速：0.2mL/min。

③进样量：3μL。

④柱温：30℃。

⑤梯度洗脱条件：见表2所示。

表2：梯度洗脱条件

序号	时间(min)	A(％)	B(％)	曲线
					1	0	97	3	6
2	3	92	8	6
					3	20	87	13	6
4	30	79	21	6
					5	35	0	100	6
6	45	0	100	6
					7	45.01	97	3	6
8	70	97	3	6

4.2质谱参考条件(ESI-)

上述7种HMO的质谱参考条件见表3所示。仪器条件为：扫描模式：负离子；鞘气流速：10arb；辅助气流速：2arb；喷雾电压：3.5KV；毛细管温度：275℃；毛细管电压：-40KV。

上述7种母乳低聚糖标准物的(ESI-)离子扫描图见图4-6。

4.3定性测定

试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较，变化范围应在±2.5％之内。

每种化合物的质谱定性离子应出现，至少包括一个母离子和两个子离子，而且同一检验批次，对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不应超过表3规定的范围。

当色谱峰的保留时间与质谱信号符合上述条件时，认为样品中存在相应的目标母乳低聚糖。

表3：定性时相对离子丰度的最大允许偏差

相对离子丰度	>50％	20％～50％	10％～20％	≤10％
					允许的相对偏差	±20％	±25％	±30％	±50％

4.4标准曲线的制作

在4.1和4.2的液相色谱-质谱条件下，将上述系列溶液(1.4)由低到高浓度进样检测，以各目标化合物的母离子色谱峰的峰面积对应浓度作图，得到标准曲线回归方程，其线性相关系数应大于0.99。

4.5试样溶液的测定

取3.3处得到的待测溶液进样，查标准曲线得到测试液中各HMO的浓度，按照以下“5.试验数据处理”中给出的公式计算样品中待测物的含量。试液中待测物的相应值应在标准曲线的线性范围内，超过线性范围应适当稀释后重新测定。

5.试验数据处理

试样中各HMO的质量分数X计，数值以微克每百克(mg/100g)表示，按下列公式计算：

式中：

c—被测组分曲线计算浓度，单位为毫克每升(mg/mL)；

V—样品水溶液最终定容体积，单位为毫升(mL)；

m—试样质量，单位为克(g)；

计算结果保留三位有效数字。

6.精密度

在重现性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于算术平均值的10％。

对比例1

重复实施例1，除了在“3.2提取”步骤中在离心之后不进行超滤之外。

对比例2

重复实施例1，除了不进行“3.3异头基还原步骤”之外。

测量结果示于图1-2和下表4中。

表4.实施例1和对比例1-2的测量结果

图1和图2分别显示了实施例1(进行NaBH₄还原)和对比例2(不进行 NaBH₄还原)测定的样品水溶液中目标母乳低聚糖各自的出峰位置。

由图1和2可以看出，本发明通过增加通过硼氢化钠还原，解决了同一多糖异头基双峰的问题；解决了无法分离LNT与LNnT的缺陷，使两个异构体完美分离。

另外，从上表4还可以看出，当使用本发明的方法测定样品中的目标母乳低聚糖含量时，所得含量结果与实际含量高度吻合。而当使用对比例1 的方法(其中在前处理未超滤样品)来测定时，检测值与理论添加值相比，差异较大，有的低有的高，说明除去的杂质对某些低聚糖产生了基体抑制，对某些低聚糖产生了基体增强。

另外，结果还显示，当不进行异头基还原时无法进行测定各目标母乳低聚糖的含量，因为双峰无法定量，LNT与LNNT重合，2’-FL与3-FL重合。

另外，本发明中使用的流动相与目前使用相同色谱柱的方法不冲突。本发明通过在前处理中增加超滤，极大地去除了干扰性杂质，提高了质谱的灵敏度。本发明中目标化合物能够精确地检测国内外法规已经准入或即将准入的7种HMO，同时这7种HMO也是母乳中含量最高的7种，实用性强，与其它方法相比，增大了检测灵敏度。

以上所述的仅是本发明的实施方式，在此应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出改进，但这些均属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种检测配方食品中目标母乳低聚糖的方法，其包括如下步骤：

(1)提供待检测配方食品的样品水溶液，该配方食品包含母乳低聚糖，并且任选地包含脂肪和/或蛋白质；

(2)分离样品水溶液以除去脂肪和蛋白质，以形成经分离处理的水溶液；

(3)将得自步骤(2)的水溶液中母乳低聚糖的还原端异头基使用过量还原剂还原成二醇结构；

(4)采用液相色谱对得自步骤(3)的水溶液进行梯度洗脱并且采用与液相色谱串联的质谱检测所洗脱的物质；

(5)将所洗脱的物质的色谱峰的保留时间以及质谱信号与待检测的目标母乳低聚糖标准物各自在与步骤(4)相同条件下获得的标准色谱峰的保留时间以及标准质谱的信号进行比较，

-(5-1)以确定样品中是否存在待检测的目标母乳低聚糖，或

-(5-2)以确定样品中是否存在待检测的目标母乳低聚糖并且确定样品中所存在的目标母乳低聚糖各自的色谱峰面积，然后根据外标法得到样品水溶液中各目标母乳低聚糖的浓度，然后根据该浓度计算试样中各目标母乳低聚糖的含量。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述目标母乳低聚糖包括或者为选自如下7种母乳低聚糖的一种或多种例如2、3、4、5、6、或7种：2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、3’-唾液酸基乳糖、6’-唾液酸基乳糖、乳糖-双岩藻糖基四糖、乳糖-N-新四糖和乳糖-N-四糖。

3.如权利要求1-2任一项中所述的方法，其中所述待检测配方食品为婴儿配方食品例如婴儿配方奶粉、幼儿配方食品例如幼儿配方奶粉、或特殊医学用途配方食品；和/或

所述待检测配方食品为液体含水溶液形式、固体形式、或者固体-液体混合物形式；优选地，待检测配方食品为液体含水溶液形式，并且提供待检测配方食品的样品水溶液包括：提供液体含水溶液形式的待检测配方食品，任选地将该含水溶液稀释，以形成待检测配方食品的样品水溶液；或者优选地，待检测配方食品为固体形式，并且提供待检测配方食品的样品水溶液包括：提供固体形式的待检测配方食品，任选地将该待检测配方食品粉碎，将该任选地经粉碎的待检测配方食品溶解于水中以形成待检测配方食品的样品水溶液；或者优选地，待检测配方食品为固体-液体混合物形式，并且提供待检测配方食品的样品水溶液包括：提供固体-液体混合物形式的待检测配方食品，任选地将该待检测配方食品匀浆，将该任选地经匀浆的待检测配方食品用水稀释溶解以形成待检测配方食品的样品水溶液。

4.如权利要求1-3任一项中所述的方法，其中该配方食品包含2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、3’-唾液酸基乳糖、6’-唾液酸基乳糖、乳糖-双岩藻糖基四糖、乳糖-N-新四糖和乳糖-N-四糖中的1种、2种、3种、4种、5种、6种或7种。

5.如权利要求1-4任一项中所述的方法，其中分离样品水溶液以除去脂肪和蛋白质的步骤(2)包括：分离样品水溶液中的脂肪的步骤，和分离样品水溶液中的蛋白质的步骤；

优选地，分离样品水溶液中的脂肪的步骤通过离心进行；优选地，离心进行一次或多次；

优选地，分离样品水溶液中的蛋白质的步骤通过超滤进行；优选地，超滤通过使用超滤管在离心机中进行；优选地，超滤进行一次或多次；

优选地，各离心和超滤过程各自独立地在1-30℃、优选2-25℃的温度下进行。

6.如权利要求1-5任一项中所述的方法，其中在步骤(3)中，

还原剂相对于母乳低聚糖以大于1:0至10:1、优选2:1至8:1、优选3:1至6:1、优选4:1至5:1的摩尔比例使用；和/或

还原剂为将母乳低聚糖的还原端异头基选择性还原成二醇而不引起母乳低聚糖的其它部分的反应的还原剂；优选地，还原剂为硼氢化钠(NaBH₄)、硼氢化钾(KBH₄)，优选硼氢化钠(NaBH₄)；和/或

优选地，还原在5-50℃、优选10-45℃、优选15-40℃、优选20-40℃下进行；

优选地，步骤(3)进一步包括在使用还原剂还原后，将过量的还原剂使用酸中和；优选地，该中和使用足以中和过量还原剂的酸进行；优选地，所述酸为甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等中的一种或多种；优选地，所述酸为甲酸；

优选地，步骤(3)进一步包括在酸中和之后脱盐的步骤；该脱盐步骤优选采用水相滤膜进行。

7.如权利要求1-6任一项中所述的方法，其中该液相色谱使用多孔石墨化碳色谱柱进行；和/或

该梯度洗脱中的各次洗脱所使用的洗脱液分别由如下构成：甲酸和或乙酸，甲酸铵和/或乙酸铵，水，和乙腈；优选地，该梯度洗脱中的各次洗脱所使用的洗脱液分别由如下构成：乙酸，乙酸铵，水，和乙腈；

优选地，该梯度洗脱中的各次洗脱所使用的洗脱液含有0.01-0.50％体积、例如0.05-0.40％体积、例如0.10-0.20体积％的甲酸和/或乙酸例如乙酸；

优选地，该梯度洗脱中的各次洗脱所使用的洗脱液所含的甲酸铵和/或乙酸铵的浓度为0.001-0.050mol/L、优选0.002-0.040mol/L、优选0.003-0.020mol/L、优选0.004-0.010mol/L、优选0.005-0.008mol/L；

优选地，该梯度洗脱中的各次洗脱所使用的洗脱液所含的乙腈的浓度在1.0-98.0％体积、优选1.5-97.0％体积、优选2.0-96.0％体积、优选2.5-95.0％体积范围内选择；

优选地，所述梯度洗脱采用6种洗脱液进行6次洗脱；优选地，各次洗脱时使用的洗脱液中的乙腈浓度如下：

第一次洗脱：1.0-5.0％体积、优选1.5-4.0％体积、优选2.0-3.5％体积、优选2.5-3.0体积；

第二次洗脱：第二次洗脱时的洗脱液的乙腈浓度大于第一次洗脱时的洗脱液的乙腈浓度并且为5.0-10.0％体积、优选6.0-9.0％体积、优选7.0-8.0％体积；

第三次洗脱：第三次洗脱时的洗脱液的乙腈浓度大于第二次洗脱时的洗脱液的乙腈浓度并且为10.0-15.0％体积、优选11.0-14.0％体积、优选12.0-13.0％体积；

第四次洗脱：第四次洗脱时的洗脱液的乙腈浓度大于第三次洗脱时的洗脱液的乙腈浓度并且为15.0-25.0％体积、优选16.0-24.0％体积、优选17.0-23.0％、优选18.0-21.0％、优选19.0-20.0％体积；

第五次洗脱：90.0-98.0％体积、优选91.0-97.0％体积、优选92.0-96.0％体积、优选优选93.0-95.0％体积；

第六次洗脱：1.0-5.0％体积、优选1.5-4.0％体积、优选2.0-3.5％体积、优选2.5-3.0体积；

和/或

质谱采用正离子扫描模式或者负离子扫描模式，优选地采用负离子扫描模式。

8.如权利要求1-7任一项中所述的方法，其中根据外标法得到样品水溶液中各目标母乳低聚糖的浓度通过如下进行：

(i)配制各目标母乳低聚糖标准物质的多种浓度的系列水溶液；

(ii)在与步骤(4)相同的液相色谱-质谱条件下，将上述系列溶液由低到高浓度进样检测，以得到各母乳低聚糖标准物的色谱峰面积对浓度的标准曲线；

(iii)由所测样品的洗脱曲线中各目标母乳低聚糖的色谱峰面积，根据该标准曲线，得到溶液中各目标母乳低聚糖的浓度。

9.如权利要求1-8任一项中所述的方法，其中试样中各目标母乳低聚糖的含量根据下式计算：

其中：

X为试样中各HMO的质量分数，以微克每百克(mg/100g)表示；

c为根据标准曲线计算的溶液中各目标母乳低聚糖的浓度，单位为毫克每升(mg/mL)；

V为步骤(1)中的样品溶液的最终定容体积，单位为毫升(mL)；

m为步骤(1)中的固体质量，单位为克(g)。

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