WO2024001248A1 - 一种定性检测母乳中酸性低聚糖的方法 - Google Patents

一种定性检测母乳中酸性低聚糖的方法 Download PDF

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张明辉
乔为仓
赵军英
贾舸
王亚玲
刘妍
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刘茜
杨宝雨
杨轶涵
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Definitions

  • the present application relates to the field of detection, and in particular to a method for qualitatively detecting acidic oligosaccharides in breast milk.
  • HMOs human milk oligosaccharides
  • Gal galactose
  • Glc glucose
  • GlcNAc N-acety lglucosamine
  • Fuc fucose
  • Sia sialic acid Polymerized basic monosaccharides.
  • the form of sialic acid in breast milk is N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac).
  • HMOs are generally divided into two categories based on their chemical charge: neutral oligosaccharides composed of uncharged monosaccharides (Glu, Gal, GlcNAc, Fuc) and acidic oligosaccharides with negatively charged residues of Neu5Ac. Acid oligosaccharides account for 12-14% of the total HMOs.
  • Breast milk oligosaccharides have functions such as promoting brain development, regulating intestinal flora, antiviral, preventing necrotizing enterocolitis, and regulating epithelial cells and immune cells. Breast milk may contain thousands of oligosaccharides, but due to geographical differences, lactation stage, mode of delivery, genetics and other factors, the types and contents of HMOs will change.
  • HMOs can be detected qualitatively and quantitatively through methods such as capillary electrophoresis, liquid chromatography, liquid chromatography-mass spectrometry, and ion chromatography.
  • methods such as capillary electrophoresis, liquid chromatography, liquid chromatography-mass spectrometry, and ion chromatography.
  • HMOs can be detected qualitatively and quantitatively through methods such as capillary electrophoresis, liquid chromatography, liquid chromatography-mass spectrometry, and ion chromatography.
  • Establish a qualitative detection method for HMOs in breast milk study the content changes of different types of oligosaccharides in breast milk, and summarize the types and content changes of HMOs. This will facilitate the future addition of HMOs to infant formula. Based on this, it is conducive to formulating infant formula milk powder that is closer to Chinese breast milk
  • the purpose of this application is to provide a method for qualitative detection of acidic oligosaccharides in breast milk, which can achieve the separation, extraction and qualitative detection of acidic oligosaccharides in breast milk.
  • this application provides a method for qualitative detection of acidic oligosaccharides in breast milk, which is carried out in sequence by following the following steps:
  • the specific centrifugation conditions in step (1) are centrifugation at 8000-10000 rpm for 25-35 minutes at 3-5°C.
  • the centrifugation conditions are centrifugation at 10000 rpm for 30 minutes at 4°C.
  • step (2) the volume ratio of the volume of ethanol added to the intermediate layer product obtained in step (1) is 2-3:1, preferably 2:1.
  • the ambient temperature for the static reaction is minus 17 to minus 23°C, and the reaction time is 25-35 min.
  • the ambient temperature is minus 20°C, and the reaction time is 30 min.
  • the specific centrifugation conditions are centrifugation at 3000-5000g for 25-35 minutes at 3-5°C.
  • the centrifugation conditions are centrifugation at 4000g for 30 minutes at 4°C.
  • the chromatography column used is Cleanert IC-A and is activated with ultrapure water before adsorption.
  • the concentration of the sodium chloride solution used is 40-60 mmol/L.
  • the parameters of the liquid chromatography of liquid mass spectrometry are analytical column Dionex IonPacTMAS19 (2 ⁇ 250mm), guard column Dionex IonPacTMAG19 (2 ⁇ 50mm), electrochemical detector, column temperature : 35°C; mobile phase A: ultrapure water, mobile phase D: 50mmol/L NaOH solution; suppressor current: 495mA, flow rate: 2mL/min; elution conditions: 0-2min, 95% A and 5% D; At 25 minutes, 80% A and 20% D; at 45 minutes, 70% A and 30% D; at 45.1 minutes, 95% A and 5% D.
  • the parameters of the liquid mass spectrometry are: using a Q Exactive detector for detection, using an electrospray ion source, a spray voltage of 3.5kV, a sheath gas pressure of 35arb, and an auxiliary gas.
  • the pressure is 10arb
  • the heating temperature is 350°C
  • the capillary temperature is 320°C
  • the collision energy is 30V
  • the Full MS/dd-MS2 mode scan is performed on the material between 550-2000m/z in the negative ion mode.
  • the method provided by this application for the qualitative detection of acidic oligosaccharides in breast milk through improvements in the extraction process and liquid chromatography and mass spectrometry parameters, enables the method to accurately qualitatively detect 9 kinds of acidic oligosaccharides derived from breast milk samples. , at the same time, this method also has good repeatability and is suitable for the analysis of large-scale breast milk samples.
  • Figure 1 is the total ion chromatogram of the acidic oligosaccharide in the negative ion mode of the technical solution in Comparative Example 1;
  • Figure 2 is a total ion chromatogram of the acidic oligosaccharide in the negative ion mode of the technical solution in Example 1;
  • Figure 3 is the total ion chromatogram of the acidic oligosaccharides 3’-SL and 6’-SL in the negative ion mode of the technical solution in Comparative Example 1;
  • Figure 4 is a total ion chromatogram of acidic oligosaccharides 3’-SL and 6’-SL in the negative ion mode of the technical solution in Example 1;
  • Figure 5 is the secondary mass spectrum of 6'-SLNFP VI under the technical scheme in Example 1;
  • Figure 6 is the secondary mass spectrum of 6’-SLNFP VI under the technical scheme in Comparative Example 2;
  • Figure 7 is the secondary mass spectrum of 6’-SLNFP VI under the technical scheme in Comparative Example 3;
  • Figure 8 is the secondary mass spectrum of 6’-SLNFP VI under the technical scheme in Comparative Example 4.
  • Figure 9 is the secondary mass spectrum of 6’-SLNFP VI under the technical scheme in Comparative Example 5;
  • Figure 10 is the secondary mass spectrum of 3’-SL under the technical scheme in Example 1;
  • Figure 11 is the secondary mass spectrum of 6’-SL under the technical scheme in Example 1;
  • Figure 12 is the secondary mass spectrum of 6’-SLN under the technical scheme in Example 1;
  • Figure 13 is the secondary mass spectrum of LSTc under the technical scheme in Example 1;
  • Figure 14 is the secondary mass spectrum of DSLNT under the technical solution in Example 1;
  • Figure 15 is the secondary mass spectrum of MSLNnH under the technical scheme in Example 1;
  • Figure 16 is the secondary mass spectrum of MSMFLNnH under the technical scheme in Example 1;
  • Figure 17 is the secondary mass spectrum of DSMFLNnH under the technical solution in Example 1.
  • the embodiments of this application provide a method for qualitative detection of acidic oligosaccharides in breast milk.
  • the collected eluate was analyzed by liquid mass spectrometry.
  • the parameters of the liquid chromatography are: analytical column Dionex IonPacTMAS19 (2 ⁇ 250mm), guard column Dionex IonPacTMAG19 (2 ⁇ 50mm), electrochemical detector, column temperature: 35°C.
  • Mobile phase A ultrapure water
  • Mobile phase D 50mmol/L NaOH solution.
  • Suppressor current 495mA
  • flow rate 2mL/min.
  • Elution conditions 0-2 min, 95% A and 5% D; 25 min, 80% A and 20% D; 45 min, 70% A and 30% D; 45.1 min, 95% A and 5% D.
  • the parameters of the mass spectrometry are: detection using Q Exactive detector.
  • the spray voltage is 3.5kV
  • the sheath gas pressure is 35arb
  • the auxiliary gas pressure is 10arb
  • the heating temperature is 350°C
  • the capillary temperature is 320°C
  • the collision energy is 30V
  • the 550-2000m/ The substance z is scanned in Full MS/dd-MS2 mode.
  • the mobile phase D is 200mmol/L NaOH solution
  • the elution conditions are: 0-25min, 5%-20%D; 25-50min, 20%-30%D; 51-55min, 60% D; 55.1-60min, 5%D.
  • Example 1 enables better separation of different types of acidic oligosaccharides through specific selection of elution conditions and mobile phases.
  • the breast milk samples were measured using the method described in Example 1, and the qualitative measurement results are shown in Table 2.
  • Example 1 can qualitatively determine 9 acidic oligosaccharides in breast milk.
  • Example 1 of the present application provides the lowest relative standard deviation for the determination of acidic oligosaccharides in breast milk samples. Therefore, this method has good repeatability.
  • This application provides a method for qualitatively detecting acidic oligosaccharides in breast milk. By improving the extraction process and liquid chromatography and mass spectrometry parameters, this method can accurately characterize nine kinds of acidic oligosaccharides derived from breast milk samples. At the same time, this method also has good repeatability and is suitable for the analysis of large-scale breast milk samples.

Abstract

一种定性检测母乳中酸性低聚糖的方法，依次按下述步骤进行：(1)将母乳离心，去除上层脂肪和蛋白质，取离心产物的中间层；(2)加入乙醇，静置反应；(3)离心，取上清；(4)利用层析柱吸附，先用超纯水水洗，后用氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液；(5)将洗脱液通过液质联用进行分析。通过对提取工艺以及液相色谱和质谱参数的改进，可以准确的对来源于母乳样品的9种酸性低聚糖进行定性测定，同时，还具备良好的重复性，适用于大规模的母乳样品的分析工作。

Description

一种定性检测母乳中酸性低聚糖的方法
交叉引用
本申请要求在中国专利局提交的、申请号为202210757416.2、申请日为2022年06月30日、申请名称为“一种定性检测母乳中酸性低聚糖的方法”的中国专利申请的优先权，该申请的全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本申请涉及检测领域，特别涉及一种定性检测母乳中酸性低聚糖的方法。
背景技术：
在母乳中，母乳低聚糖(HMOs)是3-10个单糖由共价键连接组成的短链聚合物。HMOs由半乳糖(Galactose,Gal)，葡萄糖(Glucose,Glc)，N-乙酰氨基葡萄糖(N-acety lglucosamine,GlcNAc)，岩藻糖(Fucose,Fuc)和唾液酸(Sialic acid,Sia)五种基础单糖聚合而成。其中唾液酸在母乳中存在形式是N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)。HMOs通常根据其化学电荷可分为两类：不含电荷的单糖(Glu，Gal，GlcNAc，Fuc)组成的中性低聚糖和带有Neu5Ac负电荷残基的酸性低聚糖。酸性低聚糖占HMOs总量的12-14％。母乳低聚糖具有促进大脑发育，调节肠道菌群，抗病毒，预防坏死性小肠结肠炎和调节上皮细胞和免疫细胞等功能。母乳中可能含有上千种低聚糖，但由于地理差异、泌乳阶段、分娩方式和遗传基因等因素的影响，会导致HMOs种类和含量发生变化。目前可以通过毛细管电泳、液相色谱、液相色谱-质谱和离子色谱等方法对HMOs进行定性定量的检测。HMOs种类繁多，且含量和种类变化复杂，用奶粉模拟母乳是特别复杂且困难的事情。建立对母乳中HMOs定性检测的方法，对母乳中不同种类的低聚糖进行含量变化的研究，总结出HMOs的种类和含量变化规律，这将以便于以后对婴幼儿配方奶粉中HMOs的添加提供依据，有利于配制出与中国母乳较为接近的婴幼儿配方奶粉。
因鉴于此，特提出此申请。
发明内容
本申请的目的旨在提供一种定性检测母乳中酸性低聚糖的方法，该方法可实现对母乳中酸性低聚糖的分离提取和定性检测。
为了实现上述目的，本申请提供了一种定性检测母乳中酸性低聚糖的方法，依次按下述步骤进行：
(1)将母乳离心，去除上层脂肪和蛋白质，取离心产物的中间层；
(2)加入乙醇，静置反应；
(3)离心，取上清；
(4)利用层析柱吸附，先用超纯水水洗，后用氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液；
(5)将洗脱液通过液质联用进行分析。
优选或可选地，步骤(1)中离心的具体条件为3-5℃下8000-10000rpm离心25-35min，优选的，离心条件为4℃下10000rpm离心30min。
优选或可选地，步骤(2)中，加入乙醇的体积与步骤(1)中获得的中间层产物的体积比为2-3:1,优选为2:1。
优选或可选地，步骤(2)中，静置反应的环境温度为零下17-零下23℃，反应时间为25-35min，优选的，环境温度为零下20℃，反应时间为30min。
优选或可选地，步骤(3)中，离心的具体条件为3-5℃下3000-5000g离心25-35min，优选的，离心条件为4℃下4000g离心30min。
优选或可选地，步骤(4)中，所使用的的层析柱为Cleanert IC-A，且在吸附前经超纯水活化。
优选或可选地，步骤(4)中，所用的氯化钠溶液的浓度为40-60mmol/L。
优选或可选地，步骤(5)中，液质联用的液相色谱的参数为分析柱Dionex IonPacTMAS19(2×250mm)，保护柱Dionex IonPacTMAG19(2×50mm)，电化学检测器，柱温：35℃；流动相A：超纯水，流动相D：50mmol/L NaOH溶液；抑制器电流：495mA，流速：2mL/min；洗脱条件：0-2min，95％A和5％D；25min时，80％A和20％D；45min时，70％A和30％D；45.1min时，95％A和5％D。
优选或可选地，步骤(5)中，液质联用的质谱的参数为：采用Q Exactive检测器进行检测，使用电喷雾离子源，喷雾电压为3.5kV，鞘气压力为35arb，辅气压力为10arb，加热温度为350℃，毛细管温度为320℃，碰撞能量为30V，在负离子模式下对550-2000m/z的物质进行Full MS/dd-MS2模式扫描。
本申请提供的定性检测母乳中酸性低聚糖的方法，通过对提取工艺以及液相色谱和质谱参数的改进，使该方法可以准确的对来源于母乳样品的9种酸性低聚糖进行定性测定，同时，本方法还具备良好的重复性，适用于大规模的母乳样品的分析工作。
附图说明
图1为对比例1中技术方案在负离子模式下酸性低聚糖的总离子流图；
图2为实施例1中技术方案在负离子模式下酸性低聚糖的总离子流图；
图3为对比例1中技术方案在负离子模式下酸性低聚糖3’-SL和6’-SL的总离子流图；
图4为实施例1中技术方案在负离子模式下酸性低聚糖3’-SL和6’-SL的总离子流图；
图5为实施例1中技术方案下的6’-SLNFP VI的二级质谱图；
图6为对比例2中技术方案下的6’-SLNFP VI的二级质谱图；
图7为对比例3中技术方案下的6’-SLNFP VI的二级质谱图；
图8为对比例4中技术方案下的6’-SLNFP VI的二级质谱图；
图9为对比例5中技术方案下的6’-SLNFP VI的二级质谱图；
图10为实施例1中技术方案下的3’-SL的二级质谱图；
图11为实施例1中技术方案下的6’-SL的二级质谱图；
图12为实施例1中技术方案下的6’-SLN的二级质谱图；
图13为实施例1中技术方案下的LSTc的二级质谱图；
图14为实施例1中技术方案下的DSLNT的二级质谱图；
图15为实施例1中技术方案下的MSLNnH的二级质谱图；
图16为实施例1中技术方案下的MSMFLNnH的二级质谱图；
图17为实施例1中技术方案下的DSMFLNnH的二级质谱图。
具体实施方式
以下对本申请的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本申请，并不用于限制本申请。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本申请实施例提供了一种定性检测母乳中酸性低聚糖的方法。
取1mL母乳样品，在4℃下以10000rpm离心，以去除上层脂肪和少量蛋白质，取中心层，并转移到离心管中，加入两倍体积的无水乙醇，在-20℃下静置反应30min。
反应完成后，在4℃下以4000g离心30min，取上清液。
将上清液加入至经10mL超纯水活化后静置10min的Cleanert IC-A柱内，先使用5mL超纯水洗脱中性低聚糖和乳糖，后使用5mL 50mmol/L的氯化钠溶液洗脱酸性低聚糖，收集该部分洗脱液。
将收集到的洗脱液通过液质联用的方式进行分析。
其中，液相色谱的参数为：分析柱Dionex IonPacTMAS19(2×250mm)，保护柱Dionex IonPacTMAG19(2×50mm)，电化学检测器，柱温：35℃。流动相A：超纯水， 流动相D：50mmol/L NaOH溶液。抑制器电流：495mA，流速：2mL/min。洗脱条件：0-2min，95％A和5％D；25min时，80％A和20％D；45min时，70％A和30％D；45.1min时，95％A和5％D。
质谱的参数为：采用Q Exactive检测器进行检测。使用电喷雾离子源，喷雾电压为3.5kV，鞘气压力为35arb，辅气压力为10arb，加热温度为350℃，毛细管温度为320℃，碰撞能量为30V，在负离子模式下对550-2000m/z的物质进行Full MS/dd-MS2模式扫描。
对比例1
本对比例的其余步骤与实施例1均相同，区别在于，液相色谱的流动相与洗脱条件不同。
本对比例中，流动相D选择的是200mmol/L NaOH溶液，洗脱条件为：0-25min，5％-20％D；25-50min，20％-30％D；51-55min，60％D；55.1-60min，5％D。
效果实施例1
测定实施例1和对比例1在负离子模式下的酸性低聚糖的总离子流图，结果如图1和图2所示。
由图1可以看出，对比例1的技术方案中，酸性低聚糖全部集中在4-11min内被洗脱下来，因此，不同种类的酸性低聚糖并未得到很好的分离。
参考图2，而实施例1中的技术方案，通过对洗脱条件和流动相的特定选择，使不同种类的酸性低聚糖得到了较好的分离。
为了进一步的对比实施例1和对比例1的效果，选择互为同分异构体的酸性低聚糖3’-SL和6’-SL作为验证对象。
如图3-4所示，在对比例1的液相色谱条件下，3’-SL和6’-SL并未分离，而在优化液相色谱条件后(即实施例1中的技术方案)，3’-SL和6’-SL完全分离，且效果较好。
对比例2
本对比例的其余步骤与实施例1均相同，区别在于，质谱的碰撞能量为20V。
对比例3
本对比例的其余步骤与实施例1均相同，区别在于，质谱的碰撞能量为25V。
对比例4
本对比例的其余步骤与实施例1均相同，区别在于，质谱的碰撞能量为35V。
对比例5
本对比例的其余步骤与实施例1均相同，区别在于，质谱的碰撞能量为40V。
效果实施例2
绘制实施例1与对比例2-5的酸性低聚糖6’-SLNFP VI的二级质谱图，结果如图5-9所示。
由图5可知，在碰撞能量为30V时(实施例1)，会产生其特征碎片离子0,4A2-CO2(m/z 306)，同时也会产生其他的B型、C型和跨环断裂碎片离子，以实现对酸性低聚糖6’-SLNFP VI的定性分析，而在其他的碰撞能量下，则无法实现该效果。
进一步的，根据能否进行定性分析测试其他8种酸性低聚糖的最适碰撞能量，结果如表1所示。
表1 8种低聚糖适宜的碰撞能量
由表1可知，综合各酸性低聚糖的最适碰撞能量，碰撞能量为30V时可实现对全部8种酸性低聚糖的定性分析。
各酸性低聚糖在碰撞能量为30V时的二级质谱图如图10-17所示。由图10-17可以看出，在碰撞能量为30V时，上述的8种低聚糖均会产生该种低聚糖的特征碎片离子，同时也会产生其他的B型、C型和跨环断裂碎片离子，从而实现了该种低聚糖的定性分析。
效果实施例3
采用实施例1中所述的方法对母乳样品进行测定，定性的测定结果如表2所示。
表2样品中酸性低聚糖测定结果表

由表2可以看出，实施例1中的方法可以定向的对母乳中的9中酸性低聚糖进行定性测定。
进一步的，采用实施例1中的方法对该样品进行3次重复检测，比较响应值的平均值和相对标注偏差，结果如表3所示。
表3重复测试结果表
由表3可以看出，本申请实施例1中提供的方法对于母乳样品中酸性低聚糖测定的相对标准偏差交底，因此，该方法具备良好的重复性。
以上详细描述了本申请的优选实施方式，但是，本申请并不限于上述实施方式中的具体细节，在本申请的技术构思范围内，可以对本申请的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本申请的保护范围。
此外，本申请的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本申请的思想，其同样应当视为本申请所公开的内容。
工业实用性
本申请提供一种定性检测母乳中酸性低聚糖的方法，通过对提取工艺以及液相色谱和质谱参数的改进，使该方法可以准确的对来源于母乳样品的9种酸性低聚糖进行定性测定，同时，本方法还具备良好的重复性，适用于大规模的母乳样品的分析工作。

Claims (9)

  1. 一种定性检测母乳中酸性低聚糖的方法，其特征在于，依次按下述步骤进行：
    (1)将母乳离心，去除上层脂肪和蛋白质，取离心产物的中间层；
    (2)加入乙醇，静置反应；
    (3)离心，取上清；
    (4)利用层析柱吸附，先用超纯水水洗，后用氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液；
    (5)将洗脱液通过液质联用进行分析。
  2. 根据权利要求1所述的定性检测母乳中酸性低聚糖的方法，其特征在于，步骤(1)中离心的具体条件为3-5℃下8000-10000rpm离心25-35min，优选的，离心条件为4℃下10000rpm离心30min。
  3. 根据权利要求1所述的定性检测母乳中酸性低聚糖的方法，其特征在于，步骤(2)中，加入乙醇的体积与步骤(1)中获得的中间层产物的体积比为2-3:1,优选为2:1。
  4. 根据权利要求1所述的定性检测母乳中酸性低聚糖的方法，其特征在于，步骤(2)中，静置反应的环境温度为零下17-零下23℃，反应时间为25-35min，优选的，环境温度为零下20℃，反应时间为30min。
  5. 根据权利要求1所述的定性检测母乳中酸性低聚糖的方法，其特征在于，步骤(3)中，离心的具体条件为3-5℃下3000-5000g离心25-35min，优选的，离心条件为4℃下4000g离心30min。
  6. 根据权利要求1所述的定性检测母乳中酸性低聚糖的方法，其特征在于，步骤(4)中，所使用的的层析柱为Cleanert IC-A，且在吸附前经超纯水活化。
  7. 根据权利要求1所述的定性检测母乳中酸性低聚糖的方法，其特征在于，步骤(4)中，所用的氯化钠溶液的浓度为40-60mmol/L。
  8. 根据权利要求1所述的定性检测母乳中酸性低聚糖的方法，其特征在于，步骤(5)中，液质联用的液相色谱的参数为分析柱Dionex IonPacTMAS19(2×250mm)，保护柱Dionex IonPacTMAG19(2×50mm)，电化学检测器，柱温：35℃；流动相A：超纯水，流动相D：50mmol/L NaOH溶液；抑制器电流：495mA，流速：2mL/min；洗脱条件：0-2min，95％A和5％D；25min时，80％A和20％D；45min时，70％A和30％D；45.1min时，95％A和5％D。
  9. 根据权利要求1所述的定性检测母乳中酸性低聚糖的方法，其特征在于，步骤(5)中，液质联用的质谱的参数为：采用Q Exactive检测器进行检测，使用电喷雾离子源，喷雾电压为3.5kV，鞘气压力为35arb，辅气压力为10arb，加热温度为350℃，毛细管温度 为320℃，碰撞能量为30V，在负离子模式下对550-2000m/z的物质进行Full MS/dd-MS2模式扫描。
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