JP6988158B2 - 液体クロマトグラフ質量分析方法及び液体クロマトグラフ質量分析装置 - Google Patents

Description

本発明は、液体クロマトグラフの検出器として質量分析装置を用いた液体クロマトグラフ質量分析装置を利用した分析方法、及び該分析方法に好適な液体クロマトグラフ質量分析装置に関する。

液体クロマトグラフ質量分析装置（以下「ＬＣ−ＭＳ」と略すことがある）では、液体クロマトグラフのカラムから送られてくる溶出液中の化合物をイオン化するために、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）法、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）法などの、いわゆる大気圧イオン化（ＡＰＩ）法が用いられる。大気圧イオン化法を用いた大気圧イオン源では、スプレーノズルにより溶出液を略大気圧雰囲気中に噴霧し、その噴霧より生成された微細液滴中の化合物をイオン化して気体イオンを生成する。そのため、イオン化効率を高めるには、噴霧される液滴の微細化や気化を促進させることが重要である。

大気圧イオン源に導入される溶出液の殆どは液体クロマトグラフで用いられる移動相であるが、水、アルコール類、アセトニトリル（ＡＣＮ）などの基本的な移動相では、大気圧イオン源で良好なイオン化を行うのに適した特性とならない場合がある。そこで、ＬＣ−ＭＳでは、イオン化効率を改善するために、試料の特性、使用される移動相の種類、或いはイオン化法の種類などに応じて、適宜の試薬が移動相への添加剤としてしばしば使用される（非特許文献１等参照）。一般的には、こうした添加剤は移動相に混合されることが多いが、液体クロマトグラフのカラムでの分離特性に影響を与える可能性がある場合には、カラムに導入される前の移動相に試薬を混入するのではなく、カラム出口から溶出する溶出液に試薬を混入させる、いわゆるポストカラム法が用いられる（特許文献１など参照）。

ポストカラム法で試薬を添加する場合、その添加時点ですでに試料中の化合物は分離されているから、その試薬の種類や添加量のみならず、化合物に応じた添加のタイミングを適切に設定することが重要である。何故なら、化合物の特性やその濃度によって、同じ試薬でもその有効性の度合いが相違するからである。また、グラジエント分析の場合、時間経過に伴って移動相の混合比が変化するため、それに伴って同じ試薬でもその有効性の度合いが変わる場合もある。さらにまた、ポストカラム法の場合、試薬の添加量を増加させると大気圧イオン源に導入される溶出液の液量自体が増加してしまうため、例えば揮発性の高い試薬を多く添加すればするほどイオン化効率が上がるとは限らない。

しかしながら、特性の相違する様々な化合物を含む試料を測定するような場合、それら様々な化合物のそれぞれについて、高いイオン化効率を実現できるように試薬の添加条件を設定するのは困難である。そのため、従来のＬＣ−ＭＳでは、試薬の添加条件が様々な化合物について必ずしもイオン化効率が最良又はそれに近い状態になるように最適化されておらず、そのため、質量分析装置における検出感度が犠牲になっている場合があった。

特開２００４−１２５４５３号公報（段落［００２１］）

「LC-MSのはなし その４「分離およびイオン化に重要な移動相」」、株式会社島津製作所、［online］、［平成２９年４月１７日検索］、インターネット＜URL: http://www.an.shimadzu.co.jp/hplc/support/lib/lctalk/57/57intro.htm＞ アンソニー（Anthony T. Iavarone）、ほか２名、「スーパーチャージド・プロテイン・アンド・ペプタイド・イオンズ・フォームド・バイ・エレクトロスプレー・イオナイゼイション（Supercharged Protein and Peptide Ions Formed by Electrospray Ionization）」、アナリティカル・ケミストリー（Anal. Chem.）、2001年、Vol.73、pp.1455-1460 ハンネス・ハーネ（Hannes Hahne）、ほか９名、「DMSO エンハンス・エレクトロスプレー・レスポンス、ブースティング・センシティビティ・オブ・プロテオミック・エクスペリメンツ（DMSO enhances electrospray response, boosting sensitivity of proteomic experiments）」、ネイチャー・メソッズ（Nature Methods）、2013年10月、Vol.10、No.10、pp.989-991

本発明は上記課題を解決するために成されたものであり、その目的とするところは、試料に含まれる様々な化合物について大気圧イオン源でのイオン化効率を改善することで、従来に比べて高い検出感度を実現することができる液体クロマトグラフ質量分析方法及び液体クロマトグラフ質量分析装置を提供することである。

上記課題を解決するためになされた本発明に係る液体クロマトグラフ質量分析方法は、液体クロマトグラフの検出器として大気圧イオン源を有する質量分析装置を用いた液体クロマトグラフ質量分析装置を利用した分析方法であって、
液体クロマトグラフのカラムの出口と大気圧イオン源とを接続する流路中に流れる溶出液に、少なくとも第１及び第２なる二種類の添加剤をそれぞれ任意の流量で以て混入させるようにし、
該第１の添加剤は溶出液の荷電状態に影響を与える試薬であり、
該第２の添加剤は溶出液が前記大気圧イオン源において大気圧雰囲気中に噴霧される際の液滴の大きさ又は該液滴の気化のし易さに影響を与える試薬であって、アセトニトリル、２−プロパノール、エタノール、１−プロパノール、又はアセトンであることを特徴としている。

また上記課題を解決するためになされた本発明に係る液体クロマトグラフ質量分析装置は、上記本発明に係る液体クロマトグラフ質量分析方法を実施する際に好適な装置であって、液体クロマトグラフの検出器として大気圧イオン源を有する質量分析装置を用いた液体クロマトグラフ質量分析装置において、
a)液体クロマトグラフのカラムの出口と大気圧イオン源とを接続する流路中に流れる溶出液に添加剤を混入するものであって、溶出液の荷電状態に影響を与える試薬である第１の添加剤を任意の流量で前記溶出液に混入させる第１添加剤供給部と、溶出液が前記大気圧イオン源において大気圧雰囲気中に噴霧される際の液滴の大きさ又は該液滴の気化のし易さに影響を与える試薬であって、アセトニトリル、２−プロパノール、エタノール、１−プロパノール、又はアセトンである第２の添加剤を任意の流量で前記溶出液に混入させる第２添加剤供給部と、を少なくとも含む添加剤供給部と、
b)前記第１添加剤供給部による第１の添加剤の流量と前記第２添加剤供給部による第２の添加剤の流量とをそれぞれ独立に調整する制御部と、
を備えることを特徴としている。

本発明に係る液体クロマトグラフ質量分析装置において、第１、第２添加剤供給部はそれぞれ、液体状である添加剤が貯留される添加剤容器と、該容器から添加剤を吸引して所定の流量で以て送給する送液ポンプと、該送液ポンプにより送給される添加剤をカラム出口から大気圧イオン源まで輸送される溶出液に合流させるための流路と、を含むものとすることができる。各送液ポンプから送り出された複数の添加剤を混合したあとに溶出液に合流させてもよいし、各添加剤を独立に溶出液に合流させてもよい。また、添加剤混合部は、第１、第２添加剤供給部以外の添加剤供給部をさらに備えていてもよい。つまり、三種類以上の異なる種類の添加剤を溶出液に混入できるようにしてもよい。

本発明に係る液体クロマトグラフ質量分析装置では、制御部の制御の下で、第１添加剤供給部は第１の添加剤を適宜の流量で以て溶出液に添加し、第２添加剤供給部は第２の添加剤を適宜の流量で以て溶出液に添加する。したがって、第１の添加剤と第２の添加剤とが混じった溶出液が大気圧イオン源に到達し、大気圧イオン源において溶出液は大気圧雰囲気中に噴霧されつつ、その噴霧により生成された液滴中の化合物（試料成分）がイオン化される。

イオン化のメカニズム自体は、ＥＳＩ、ＡＰＣＩ、ＡＰＰＩなどの大気圧イオン化法の手法により相違するが、いずれの場合でもイオン化の効率は主として、大気圧イオン源に導入される溶出液の荷電のし易さ等の荷電に関する条件と、略大気圧雰囲気中に噴霧される液滴のサイズや液滴中の溶媒の気化のし易さ等の気体状の化合物（又はイオン）の飛び出し易さに関する条件とに依存する。そこで、本発明に係る液体クロマトグラフ質量分析方法では、溶出液の荷電状態に影響を与える試薬を第１の添加剤とし、溶出液が大気圧イオン源において大気圧雰囲気中に噴霧される際の液滴の大きさ又は該液滴の気化のし易さに影響を与える試薬を第２の添加剤としている。そして、試料に含まれる化合物の種類、特性や移動相の種類等に応じて、第１、第２なる二種類の添加剤を混入させる流量を適宜に調整する。二種類の添加剤の適切な添加量は予め実験的に調べておけばよい。

このように異なる特性の二種類又はそれ以上の種類の添加剤をポストカラム法で以て溶出液に混入させて大気圧イオン源に導入することで、様々な化合物について大気圧イオン源でのイオン化効率を従来よりも改善することができる。それによって、いずれの化合物についても、より多くの量のイオンを質量分析に供することが可能となり、検出感度を向上させることができ、例えば従来であれば検出できなかった化合物を検出できるようになる。また、従来であれば同定や構造解析を行うのに十分な信号強度が得られなかった化合物についても、十分な信号強度のマススペクトルが得られるようになり、同定や構造解析を精度良く行うことができるようになる。

なお、本発明に係る液体クロマトグラフ質量分析装置では、好ましくは、前記制御部は、第１の添加剤の流量と第２の添加剤の流量とをそれぞれ時間経過に応じて変化させることが可能なプログラムに従って前記第１添加剤供給部及び前記第２添加剤供給部の動作を制御する構成とするとよい。

この構成によれば、事前にプログラムを適宜設定しておくことで、二種類以上の添加剤をそれぞれ時々刻々とその添加量を変化させながら溶出液に混入させることができる。それによって、目的とする化合物について確実に高い感度で以て検出が可能となる。

本発明に係る液体クロマトグラフ質量分析方法では、典型的には、
前記第１の添加剤は、ｐＨ調整用の及び／又は高プロトン親和性を有する試薬であり、前記第２の添加剤は、移動相に比べて沸点が低い、表面張力が小さい、粘性が低い、のうちの少なくとも一つの性質を有する試薬であるものとすることができる。

第１、第２の添加剤としてはそれぞれ種々の試薬を用いることができる。第１の添加剤、つまり溶出液の荷電状態に影響を与える試薬としては、一般にｐＨ調整用試薬として用いられているアンモニア水、トリエチルアミン、酢酸、蟻酸、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、酢酸アンモニウム、蟻酸アンモニウムなどを用いることができる。また、第１の添加剤としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ｍ−ニトロベンジルアルコール（ｍ−ＮＢＡ）（なお、ｍは２，３又は４）、グリセロールなどを用いることもできる。これらは、イオンの価数分布に影響を与える試薬であり、ＤＭＳＯは価数集約の効果があり、ｍ−ＮＢＡ及びグリセロールは価数増加の効果があることが知られている（非特許文献２参照）。一方、第２の添加剤、つまり移動相に比べて沸点が低い、表面張力が小さい、或いは粘性が低い試薬としては、アセトニトリル、２−プロパノール、エタノール、１−プロパノール、又はアセトンを用いる。

本発明者による検討によれば、入手が容易であって、効果が高いものとして、第１の添加剤としてＤＭＳＯ、第２の添加剤として２−プロパノールを用いるとよい。ＤＭＳＯは非プロトン性の極性溶媒であるが、荷電状態の集約効果が得られるため、化合物をイオン化するのに有効である。一方で、ＤＭＳＯは沸点が高く気化しにくいが、２−プロパノールは沸点が低いので気化し易いうえに表面張力が小さいので液滴が微細になり易く、大気圧イオン源での気体イオンを生成するうえでＤＭＳＯの欠点を補うことができる。こうした添加剤を利用することで、特にペプチドや糖鎖等の生体由来である高分子化合物の検出感度を向上させることができる。

また本発明に係る液体クロマトグラフ質量分析方法では、測定対象の試料はペプチドと糖ペプチドとの混合物であり、前記第１の添加剤はｐＨ調整用試薬であって、液体クロマトグラフのカラム出口から溶出する溶出液中にペプチドが含まれる期間には該溶出液が酸性になり、該カラム出口から溶出する溶出液中に糖ペプチドが含まれる期間には該溶出液がアルカリ性になるように、前記第１の添加剤の流量を時間経過に応じて変化させるものとすることができる。

この場合、ペプチド及び中性糖鎖を含む糖ペプチドが溶出する期間には質量分析装置において正イオン測定を行い、酸性糖鎖を含む糖ペプチドが溶出する期間には質量分析装置において負イオン測定を行うように検出対象のイオンの極性を切り替えるとよい。これによれば、試料に含まれる、ペプチド、中性糖鎖を含む糖ペプチド、及び、酸性糖鎖を含む糖ペプチドのいずれについても、高い感度で以て検出することができる。

なお、上述したように本発明に係る液体クロマトグラフ質量分析方法で利用される液体クロマトグラフ質量分析装置では大気圧イオン源として種々のイオン化法を採り得るが、特に、大気圧イオン源としてエレクトロスプレーイオン源を用いたものに好適である。

エレクトロスプレーイオン源では、溶出液に高電場を作用させて液滴を帯電させつつ略大気圧雰囲気中に噴霧し、帯電液滴の分裂を伴う微細化の過程でペプチド等の化合物をイオン化する。ＤＭＳＯ等の試薬は水に比べて表面張力が小さいので、液滴の微細化が進行し易い。帯電液滴が微細化すると該液滴中でのクーロン斥力が作用し易くなり、気体イオンの飛び出しも促進されるのでイオン化効率を高めることができる（非特許文献３参照）。即ち、エレクトロスプレーイオン源を用いた液体クロマトグラフ質量分析装置に本発明に係る液体クロマトグラフ質量分析方法を適用することで、添加剤による荷電状態の集約効果と液滴の微細化促進効果とが相まって、イオン化効率をより一層高めることができる。

本発明に係る液体クロマトグラフ質量分析装置及び液体クロマトグラフ質量分析方法によれば、試料に含まれる様々な化合物についてそれぞれ、大気圧イオン源でのイオン化効率を最良又はそれに近い状態にまで改善することができる。それにより、従来の分析方法や装置に比べて、高い検出感度を実現することができる。

本発明の一実施例であるＬＣ−ＭＳの全体構成図。 ペプチド６８−８７について添加剤Ａ（ＤＭＳＯ）の流量を変化させたときのピーク面積値の実測結果を示すグラフ。 ペプチド２８２−２９０について添加剤Ａ（ＤＭＳＯ）の流量を変化させたときのピーク面積値の実測結果を示すグラフ。 ペプチド６８−８７について添加剤Ａ（ＤＭＳＯ）の流量を一定とし添加剤Ｂ（２−プロパノール）の流量を変化させたときのピーク面積値の実測結果を示すグラフ。 ペプチド２８２−２９０について添加剤Ａ（ＤＭＳＯ）の流量を一定とし添加剤Ｂ（２−プロパノール）の流量を変化させたときのピーク面積値の実測結果を示すグラフ。

以下、本発明に係るＬＣ−ＭＳの一実施例、及び、該ＬＣ−ＭＳを用いた分析方法の一実施例を、添付図面を参照して説明する。
図１は本実施例のＬＣ−ＭＳの全体構成図である。
本実施例のＬＣ−ＭＳは、液体クロマトグラフ部（ＬＣ部）１と、質量分析部（ＭＳ部）２と、制御部３と、データ処理部４と、ユーザインターフェイスである入力部５と表示部６を、を備える。

ＬＣ部１は、二つの移動相容器１０ａ、１０ｂから移動相ａ、移動相ｂをそれぞれ吸引して送給する送液ポンプ１１ａ、１１ｂと、二つの移動相ａ、ｂを混合するミキサ１２と、移動相中に液体試料を注入するインジェクタ１３と、化合物を分離するためのカラム１５と、該カラム１５を温調するカラムオーブン１４と、カラム１５の出口側の溶出液流路１７に設けられたポストカラム添加部１６と、を含む。ポストカラム添加部１６は、溶出液流路１７上に設けられた第１三方継手１６１と、該第１三方継手１６１に接続される第２三方継手１６２と、異なる種類の添加剤Ａ、Ｂがそれぞれ収容された二つの添加剤容器１６３Ａ、１６３Ｂと、添加剤容器１６３Ａ、１６３Ｂからそれぞれ添加剤Ａ、Ｂを吸引して送給する二つの添加剤送液ポンプ１６４Ａ、１６４Ｂと、を含む。

ＭＳ部２において、チャンバ２０内にはイオン化室２０１、第１中間真空室２０２、第２中間真空室２０３、及び高真空室２０４が形成されている。イオン化室２０１内は略大気圧状態であり、一方、高真空室２０４は図示しない高性能の真空ポンプにより高真空状態に維持される。第１、第２中間真空室２０２、２０３はそれぞれ真空ポンプにより真空排気され、イオン化室２０１から高真空室２０４まで段階的に真空度が高まるようになっている。イオン化室２０１にはＥＳＩ法によるイオン化を行うためのＥＳＩスプレー２１が設けられ、イオン化室２０１と第１中間真空室２０２とは細径の脱溶媒管２２を通して連通している。第１中間真空室２０２内にはイオンを収束させつつ輸送するためのイオンガイド２３が配置され、第１中間真空室２０２と第２中間真空室２０３とはスキマー２４の頂部に形成されたオリフィスを介して連通している。第２中間真空室２０３内にはイオンを収束させつつ輸送するためのイオンガイド２５が配置され、高真空室２０４内には、衝突セル２７を挟んでその前後に第１四重極マスフィルタ２６と第２四重極マスフィルタ２８が配置され、その後段に検出器２９が設けられている。検出器２９で得られた検出信号はデータ処理部４に入力される。

制御部３は、ＬＣ部１の各部の動作を制御するＬＣ制御部３０と、ＭＳ部２の各部の動作を制御するＭＳ制御部３１とを含む。ＬＣ制御部３０は、タイミング制御部３０１、移動相送液制御部３０２、添加剤送液制御部３０３、及び温度制御部３０４を含む。

本実施例のＬＣ−ＭＳの典型的な動作は次のとおりである。
ＬＣ制御部３０の移動相送液制御部３０２は予め決められた、時間経過と流量（又は流速）との関係を定めるプログラム（タイムシーケンス）に従って、移動相容器１０ａ、１０ｂからそれぞれ移動相ａ、移動相ｂを吸引して所定流量で以て送給するように送液ポンプ１１ａ、１１ｂを制御する。送給された二つの移動相ａ、ｂはミキサ１２で混合され、インジェクタ１３を経てカラム１５へと送られる。タイミング制御部３０１からの指示により、所定のタイミングでインジェクタ１３から移動相中に液体試料が注入されると、該液体試料は移動相に押されてカラム１５に送り込まれる。そして、液体試料中の各種化合物はカラム１５を通過する間にカラム１５の長手方向（つまりは時間方向）に分離され、時間差を有してカラム１５の出口から溶出する。なお、温度制御部３０４は予め決められた温度プログラムに従ってカラムオーブン１４の温度を例えば４０℃一定に調整する。

添加剤容器１６３Ａには適宜の性質の添加剤Ａが、添加剤容器１６３Ｂには添加剤Ａとは異なる種類である適宜の性質の添加剤Ｂが予め用意される。添加剤送液制御部３０３は予め決められた添加剤供給用プログラム（タイムシーケンス）に従って、添加剤送液ポンプ１６４Ａ、１６４Ｂをそれぞれ制御し、各添加剤容器１６３Ａ、１６３Ｂに用意された添加剤Ａ、Ｂをそれぞれ吸引して送給する。二種類の添加剤Ａ、Ｂは二つの三方継手１６２、１６１を経て混合されつつ、溶出液流路１７中を通過する溶出液に混入される。即ち、カラム１５で分離された化合物を含む溶出液がポストカラム添加部１６を通過する際に、二種の添加剤Ａ、Ｂがそれぞれ適宜の量だけ混合される。

溶出液流路１７を経てＭＳ部２のＥＳＩスプレー２１に到達した溶出液は、該スプレー２１のノズル先端付近に形成されている片寄った電場により電離されつつ、ノズルから略大気圧雰囲気中に噴霧される。即ち、化合物と溶媒（移動相、元々の液体試料の溶媒、添加剤など）とを含む微細な帯電液滴が噴霧される。イオン化室２０１中には多くの残留ガスが存在するため、ＥＳＩスプレー２１から放出された帯電液滴はこの残留ガス分子に接触し分裂することで微細化が進む。また、イオン化室２０１は図示しないヒータにより加熱されており、帯電液滴中の溶媒の気化は促進される。そして、液滴中の化合物は電荷を有して液滴から飛び出すことで気体イオンとなる。生成されたイオンは脱溶媒管２２の両端間の圧力差によって生じるガス流に乗って脱溶媒管２２に吸い込まれ、第１中間真空室２０２へと運ばれる。このイオンはイオンガイド２３、２５により形成される電場の作用で高真空室２０４まで順に輸送され、第１四重極マスフィルタ２６において所定の質量電荷比を有するイオンのみがプリカーサイオンとして選択される。

衝突セル２７にはアルゴン等の所定の衝突ガスが導入され、第１四重極マスフィルタ２６を通過して衝突セル２７に入ったイオンは衝突ガスに接触して衝突誘起解離により開裂する。この開裂によって生成された各種のプロダクトイオンは第２四重極マスフィルタ２８に導入され、特定の質量電荷比を有するプロダクトイオンのみが選択される。こうして第２四重極マスフィルタ２８を通過した、特定のプリカーサイオンに由来する特定のプロダクトイオンが検出器２９に入射し、検出器２９は入射したイオンの量に応じた検出信号を出力する。この信号はデータ処理部４でデジタル化されたあと、所定のデータ処理が行われる。例えば、時間経過に伴って順次得られるデータに基づいてマスクロマトグラムが作成され、そのマスクロマトグラムにおいて目的の化合物に対応するピークの面積値が計算されて、該面積値に基づいて定量値が算出される。

上記のようなＬＣ／ＭＳ分析の際の二種類の移動相ａ、ｂの混合比を決めるグラジエントプログラム、二種類の添加剤Ａ、Ｂそれぞれの流量を決めるプログラム、及びカラムオーブン１４の温調のための温度プログラムは、オペレータが予め入力部５から分析条件の一つとして設定しておくものとする。

本実施例のＬＣ−ＭＳでは、ポストカラム添加部１６において二種類の添加剤（試薬）Ａ、Ｂを溶出液に添加することができる。これら添加剤はＬＣ部１での分離特性には何ら影響を与えない。そこで、ＭＳ部２のＥＳＩスプレー２１、つまりはＥＳＩイオン源でのイオン化効率ができるだけ良好になるように、測定対象である試料の種類（化合物の種類）や移動相の種類等に応じて、添加剤の種類と流量プログラムとを決めることが望ましい。二種類の添加剤の組み合わせは適宜に決めることができるが、ＥＳＩイオン源では、イオン化効率に影響を与える大きな要素は、帯電液滴が形成される直前の荷電の状態、及び帯電液滴からの気体イオンの飛び出し易さ、である。後者は、帯電液滴の大きさや液滴中の溶媒の気化し易さが関係し、溶出液の粘性が低いほど、溶出液の表面張力が小さいほど、そして、液滴中の溶媒の沸点が低いほど、気体イオンは飛び出し易い。そこで、こうした要素を考慮して、添加剤の組み合わせは決められる。

次に、測定対象の化合物がペプチドである場合における、本実施例のＬＣ−ＭＳを用いた分析方法の一実測例を説明する。
この実測例では、添加剤Ａとしてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、添加剤Ｂとして２−プロパノールを選択した。ＤＭＳＯは非プロトン性の極性溶媒であるが、荷電状態の集約効果を得ることができる試薬である。ＤＭＳＯのこの効果は、プロトン親和性が高いために、トリプシン消化ペプチドのＣ末端のリジン及びアルギニンやＮ末端に局在していないプロトンが存在する高荷電状態からプロトンの引き抜きを進行させることによるものである。一方、２−プロパノールの特性は次の表のとおりであり、粘性率は移動相として使用される水やアセトニトリルに比べて高いものの、表面張力が小さいために噴霧時に微細な液滴が生じ易く、また沸点も低いので気化し易い。

以下のような実験により、二種類の添加剤の流量と検出感度との関係を調べた。
［実験１］
測定条件は以下のとおりである。
・測定対象化合物：tau タンパク質 ６８−ＳＴＰＴＡＥＤＶＴＡＰＬＶＤＥＧＡＰＧＫ−８７（分子イオン：［Ｍ＋２Ｈ］²⁺、分子量：９７８．５５４０）、２８２−ＬＤＬＳＮＶＱＳＫ−２９０（分子イオン：［Ｍ＋２Ｈ］²⁺、分子量：５０２．５６４３）の二種類のペプチド
・移動相流速：１００μL/min（バイナリーグラジエント）
・移動相ａ：０．１％ 蟻酸（ＦＡ）
・移動相ｂ：０．１％ 蟻酸／アセトニトリル
・添加剤Ａ：１０％ ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（流量：０−１００μL/min）
・添加剤Ｂ：２−プロパノール（流量：０μL/min固定＝添加なし）
・質量分析モード：ＭＲＭ測定（ペプチド６８−８７：m/z ９７８．５５４０＞８８４．４６２８、ペプチド２８２−２９０：m/z ５０２．５６４３＞２２９．２５３８）

図２はペプチド６８−８７についての添加剤Ａの流量とマスクロマトグラム上のピーク面積値との関係の実測結果である。また、図３はペプチド２８２−２９０についての添加剤Ａの流量とマスクロマトグラム上のピーク面積値との関係の実測結果である。ペプチド６８−８７では、図２に示すように、添加剤Ａ（１０％ＤＭＳＯ）の流量を５０μL/minとしたとき（ＤＭＳＯ終濃度３％）に最大の感度（約２７１万）が得られた。そして、それ以上に添加剤Ａの流量を増加させても感度は増加しないことが分かる。一方、ペプチド２８２−２９０では、最大の感度（約４３万）を与える添加剤Ａの流量はより少なく、５μL/min（ＤＭＳＯ終濃度０．５％）である。この場合、添加剤Ａの流量を増加させたときの感度の低下は顕著であり、５０μL/min以上の流量では検出は殆ど不可能である。
ペプチドの種類による添加剤Ａの流量とピーク面積との関係の差異は、ペプチドのアミノ酸配列の長さ、疎水度や酸性アミノ酸の含有量などによるものと推測される。

［実験２］
測定条件は以下のとおりである。
・測定対象化合物：実験１と同じ
・移動相流速：１００μL/min（バイナリーグラジエント）
・移動相ａ：０．１％ 蟻酸（ＦＡ）
・移動相ｂ：０．１％ 蟻酸／アセトニトリル
・添加剤Ａ：１０％ ジメチルスルホキシド（流量：５μL/min固定）
・添加剤Ｂ：２−プロパノール（流速：０−２００μL/min）
・質量分析モード：実験１と同じ

図４はペプチド６８−８７についての添加剤Ｂの流量とマスクロマトグラム上のピーク面積値との関係の実測結果である。また、図５はペプチド２８２−２９０についての添加剤Ｂの流量とマスクロマトグラム上のピーク面積値との関係の実測結果である。図４及び図５に示すように、いずれのペプチドについても添加剤Ｂ（２−プロパノール）の流量を１５０μL/minとしたときに最大の感度（約４２８万、約６６万）が得られた。このときの最大感度は添加剤Ｂを添加しない実験１と比べて約１．５倍以上に増加している。このことから、添加剤Ａ、Ｂを併用することが、検出感度を向上させるうえで有効であることが分かる。

上記実験の結果からは、ペプチド６８−８７とペプチド２８２−２９０については、添加剤Ａ（１０％ＤＭＳＯ）が５mL/minの流量、添加剤Ｂ（２−プロパノール）が１５０μL/minの流量で最良に近い検出感度が得られると結論付けることができる。実際には、添加剤Ａの流量を変えながらピーク面積を確認することで、より適切な条件を見いだせる可能性もある。

このように検出対象の目的化合物が決まっている場合には、その目的化合物毎に検出感度が最大となる二種類の添加剤Ａ、Ｂの流量の組み合わせを予め実験的に調べておくことができる。また、検出感度がより高くなる、添加剤の種類の組み合わせも事前に調べておくことができる。そうした実験結果に基づいて、目的化合物毎に、添加剤の流量が決まったならば、各目的化合物が溶出するタイミング、つまり保持時間において適切な流量になるように流量プログラムを作成しておけばよい。そうした作成した流量プログラムを分析条件の一つとして設定したうえでＬＣ／ＭＳ分析を実行することで、各目的化合物について最良に近い検出感度で信号を得ることができる。

なお、上記実施例では、二種類の添加剤を溶出液に混入させていたが、さらに添加剤容器及び添加剤送液ポンプを追加して、三種類以上の添加剤を溶出液に混入させる構成としてもよい。

また、添加剤の組み合わせは上記実験に用いたものに限らない。例えば酸性移動相を用いた分析の際に、塩基性添加剤と上述した液滴の微細化や気化を促進する添加剤（例えば２−プロパノール）とを組み合わせて用いてもよい。これにより、塩基性成分の検出性を向上させつつ、全般的な検出感度の向上を達成することができる。それ以外に、既に例示した様々な添加剤を用いることができる。

またさらに、上記実施例は本発明の一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加等を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。

１…液体クロマトグラフ部（ＬＣ部）
１０ａ、１０ｂ…移動相容器
１１ａ、１１ｂ…送液ポンプ
１２…ミキサ
１３…インジェクタ
１４…カラムオーブン
１５…カラム
１６…ポストカラム添加部
１６１、１６２…三方継手
１６３Ａ、１６３Ｂ…添加剤容器
１６４Ａ、１６４Ｂ…添加剤送液ポンプ
１７…溶出液流路
２…質量分析部（ＭＳ部）
２０…チャンバ
２…質量分析装置
２０１…イオン化室
２０２…第１中間真空室
２０３…第２中間真空室
２０４…高真空室
２１…ＥＳＩスプレー
２２…脱溶媒管
２３、２５…イオンガイド
２４…スキマー
２６…第１四重極マスフィルタ
２７…衝突セル
２８…第２四重極マスフィルタ
２９…検出器
３…制御部
３０…ＬＣ制御部
３０１…タイミング制御部
３０２…移動相送液制御部
３０３…添加剤送液制御部
３０４…温度制御部
３１…ＭＳ制御部
４…データ処理部
５…入力部
６…表示部

Claims (7)

1. 液体クロマトグラフの検出器として大気圧イオン源を有する質量分析装置を用いた液体クロマトグラフ質量分析装置を利用した分析方法であって、
   液体クロマトグラフのカラムの出口と大気圧イオン源とを接続する流路中に流れる溶出液に、少なくとも第１及び第２なる二種類の添加剤をそれぞれ任意の流量で以て混入させるようにし、
   該第１の添加剤は溶出液の荷電状態に影響を与える試薬であり、
   該第２の添加剤は溶出液が前記大気圧イオン源において大気圧雰囲気中に噴霧される際の液滴の大きさ又は該液滴の気化のし易さに影響を与える試薬であって、アセトニトリル、２−プロパノール、エタノール、１−プロパノール、又はアセトンであることを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析方法。
2. 請求項１に記載の液体クロマトグラフ質量分析方法であって、
   前記第１の添加剤は、ｐＨ調整用の及び／又は高プロトン親和性を有する試薬であり、
   前記第２の添加剤は、移動相に比べて沸点が低い、表面張力が小さい、粘性が低い、のうちの少なくとも一つの性質を有する試薬であることを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析方法。
3. 請求項２に記載の液体クロマトグラフ質量分析方法であって、
   測定対象の試料は少なくともペプチドと糖ペプチドとを含む混合物であり、
   前記第１の添加剤はｐＨ調整用試薬であって、液体クロマトグラフのカラム出口から溶出する溶出液中にペプチドが含まれる期間には該溶出液が酸性になり、該カラム出口から溶出する溶出液中に糖ペプチドが含まれる期間には該溶出液がアルカリ性になるように、前記第１の添加剤の流量を時間経過に応じて変化させることを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析方法。
4. 請求項２又は３に記載の液体クロマトグラフ質量分析方法であって、
   前記第１の添加剤はジメチルスルホキシド、前記第２の添加剤は２−プロパノールであることを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析方法。
5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフ質量分析方法であって、
   前記大気圧イオン源はエレクトロスプレーイオン源であることを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析方法。
6. 液体クロマトグラフの検出器として大気圧イオン源を有する質量分析装置を用いた液体クロマトグラフ質量分析装置において、
   a)液体クロマトグラフのカラムの出口と大気圧イオン源とを接続する流路中に流れる溶出液に添加剤を混入するものであって、溶出液の荷電状態に影響を与える試薬である第１の添加剤を任意の流量で前記溶出液に混入させる第１添加剤供給部と、溶出液が前記大気圧イオン源において大気圧雰囲気中に噴霧される際の液滴の大きさ又は該液滴の気化のし易さに影響を与える試薬であって、アセトニトリル、２−プロパノール、エタノール、１−プロパノール、又はアセトンである第２の添加剤を任意の流量で前記溶出液に混入させる第２添加剤供給部と、を少なくとも含む添加剤供給部と、
   b)前記第１添加剤供給部による第１の添加剤の流量と前記第２添加剤供給部による第２の添加剤の流量とをそれぞれ独立に調整する制御部と、
   を備えることを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析装置。
7. 請求項６に記載の液体クロマトグラフ質量分析装置であって、
   前記制御部は、前記第１の添加剤の流量と前記第２の添加剤の流量とをそれぞれ時間経過に応じて変化させることが可能なプログラムに従って前記第１添加剤供給部及び前記第２添加剤供給部の動作を制御することを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析装置。

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