CN109975454B - 双醋炔诺醇的质谱分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种双醋炔诺醇的质谱分析方法，属于质谱应用技术领域。双醋炔诺醇的质谱分析方法是通过添加无机锂化合物到含有双醋炔诺醇的试样中，试样先经极性溶剂溶解后，再经管路输送至质谱离子源离子化，通过监测[M+Li]+离子或其碎裂离子来分析双醋炔诺醇的质谱分析。本发明通过实验证明，其双醋炔诺醇的检出限和定量限分别为：0.1 ng/mL和0.5 ng/mL，具有较好的灵敏度。

Description

双醋炔诺醇的质谱分析方法
技术领域
本发明涉及一种双醋炔诺醇的质谱分析方法，属于质谱应用技术领域。
背景技术
双醋炔诺醇（17α-ethinyl-4-estrene-3β,17β-diol diacetate, ethynodioldiacetate）是一种孕激素类短效口服避孕药，一般与雌激素组方用于避孕。双醋炔诺醇因其分子结构中的C4-5位存在双键，具有紫外吸收，可采用HPLC-UV方法进行含量测定，但由于其最大吸收在近紫外区，杂质干扰较大，导致双醋炔诺醇的检测灵敏度低，专属性差等缺点。
质谱由于具有快速、灵敏、选择性好、能获得化合物的分子量、化合物碎片信息丰富等特点，被广泛应用于现代科学的多个领域。质谱检测是通过分析带电离子得到化合物的分子量或结构，其首要条件是要求化合物容易离子化。化合物离子化后一般生成[M+H]+或[M-H]-离子，有些化合物可以与管道中微量的离子加合生成[M+Na]+或[M+K]+或[M-Cl]-离子，具体何种离子为基峰离子与化合物自身的分子结构有关，质谱分析时可通过选择合适的离子来对化合物进行检测分析研究。
目前关于双醋炔诺醇的质谱分析仅见于通过正离子模式下钠离子加合[M+Li]+离子的分析，尚未有其他加合离子的报道。基于钠离子加合的双醋炔诺醇的碎片离子信号弱的缺点。
发明内容
针对上述现有技术中的不足之处，本发明旨在提供一种双醋炔诺醇的质谱分析方法，以解决上述背景技术中的问题。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：一种双醋炔诺醇的质谱分析方法，双醋炔诺醇的质谱分析方法是通过添加无机锂化合物到含有双醋炔诺醇的试样中，试样先经极性溶剂溶解后，再经管路输送至质谱离子源离子化，通过监测[M+Li]+离子或其碎裂离子来分析双醋炔诺醇的质谱分析。
优选的，所述极性溶剂为甲醇水溶液。
优选的，所述管路输送为经过色谱柱的液相管路。
优选的，所述质谱离子源为电喷雾离子源。
优选的，所述质谱为高分辨质谱或低分辨质谱。
优选的，所述碎裂离子为荷质比m/z227和荷质比m/z149。
优选的，所述无机锂化合物为氯化锂。
优选的，所述氯化锂的加入量为使溶液中锂离子浓度为0.01~100mmol/L。
优选的，所述色谱柱的液相管路的流速为0.5~1.0 mL/min。
优选的，所述电喷雾离子源的喷雾电压为2~4 kV。
本发明通过实验证明，其双醋炔诺醇的检出限和定量限分别为：0.1 ng/mL和0.5ng/mL，具有较好的灵敏度。
附图说明
图1为本发明双醋炔诺醇的分子式；
图2为本发明未加锂离子双醋炔诺醇的高分辨质谱图；
图3为本发明锂离子加合的双醋炔诺醇的高分辨质谱图；
图4为本发明钾离子加合的双醋炔诺醇的碎片离子高分辨质谱图；
图5为本发明锂离子加合的双醋炔诺醇的碎片离子高分辨质谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明的双醋炔诺醇的质谱分析方法，双醋炔诺醇（如图1所示）的质谱分析方法是通过添加无机锂化合物到含有双醋炔诺醇的试样中，试样先经极性溶剂溶解后，再经管路输送至质谱离子源离子化，通过监测[M+Li]+离子或其碎裂离子来分析双醋炔诺醇的质谱分析。
优选的，所述极性溶剂为甲醇水溶液。
优选的，所述管路输送为经过色谱柱的液相管路。
优选的，所述质谱离子源为电喷雾（ESI）离子源。
优选的，所述质谱为高分辨质谱或低分辨质谱。
优选的，所述碎裂离子为荷质比227m/z和荷质比149m/z。
优选的，所述无机锂化合物为氯化锂。
优选的，所述氯化锂的加入量为使溶液中锂离子浓度为0.01~100mmol/L。
优选的，所述色谱柱的液相管路的流速为0.5~1.0 mL/min。
优选的，所述电喷雾（ESI）离子源的喷雾电压为2~4 kV。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
实施例1、直接进样的双醋炔诺醇的高分辨质谱分析
【实验材料】
双醋炔诺醇（Ethynodiol Diaceta，ED，≥99%，购自阿拉丁公司）。甲醇为HPLC级（购自美国Fisher公司），Milli-Q 纯水仪（Millipore公司）。氯化锂（LiCl，购自阿拉丁公司），微量注射泵，Thermo UHPLC-QE Orbitrap HRMS高分辨质谱仪 (Thermo Scientific™)。
【实验方法】
称取10.0 mg的双醋炔诺醇标准品于10 mL的容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成1.0 mg/mL的储备液，于-20 ℃冰箱保存。使用时，用移液器吸取双醋炔诺醇储备液50 μL置于容量瓶中，然后用甲醇：水（1:1，v/v）逐级稀释成质量浓度为5 μg/L的双醋炔诺醇标准工作液。另用移液器吸取双醋炔诺醇储备液50 μL置于100 mL容量瓶中，并称取无水氯化锂适量置于同一容量瓶中，然后用甲醇：水（1:1，v/v）逐级稀释成质量浓度为5 μg/L的含锂离子为50 mM的双醋炔诺醇标准工作液。
分别用进样针吸取工作液100 μL，置于微量注射泵上，设定微量注射泵参数使溶液按照10 μL/min的速度推动溶液经PEEK管进入质谱离子源，质谱条件：电喷雾离子源（ESI），毛细管温度350 °C，喷雾电压：3.7 kV，鞘气流速：30 arb，辅助气流速：6 arb。质谱离子扫描质量范围为100~1050Da。
【实验结果】
在溶液中未加锂离子，双醋炔诺醇在质谱正离子全扫描中未检测到质子化离子峰m/z 385 [M+H]+离子峰（如图2所示），相反，离子加合峰m/z 407 [M+Na]+离子和m/z 423 [M+K]+离子可以检测到并且钠离子加合峰为基峰，质子数/电荷数的比值。m/z表示（质子数/电荷数的比值）。
在溶液中加入锂离子后，双醋炔诺醇在质谱正离子全扫描中出现m/z 391 [M+Li]+离子峰（如图3所示），且为基峰，相反m/z 407 [M+Na]+离子和m/z 423 [M+K]+离子变弱，说明加入锂离子可以竞争性的抑制[M+Na]+和[M+K]+加合离子的产生。
对m/z 423 [M+K]+离子进行质谱碰撞诱导裂解（CID），发现双醋炔诺醇的钾离子加合物的质谱碎片离子无规律（如图4所示），无法用于双醋炔诺醇的质谱结构解析。
而对m/z 391 [M+Li]+离子进行质谱碰撞诱导裂解（CID），发现双醋炔诺醇的锂离子加合物产生了有规律的质谱碎片离子（如图5所示），可用于双醋炔诺醇的质谱结构解析。
实施例2、LC-MS联用技术分析双醋炔诺醇锂离子加合物
【实验材料与仪器】
双醋炔诺醇（Ethynodiol Diaceta，ED，≥99%，购自阿拉丁公司）。甲醇为HPLC级（购自美国Fisher公司），Milli-Q 纯水仪（Millipore公司），无水氯化锂（≥99%，购自阿拉丁公司）。
岛津高效液相色谱串联三重四级杆质谱仪，配有二元梯度泵，自动进样器，柱温箱及工作站软件；十万分之一电子天平：BT-25S（赛多利斯科学仪器有限公司）；超声波清洗器：KH5200B（昆山禾创超声仪器有限公司）。
【实验方法】
（1）标准溶液的配制
精密称取10.0 mg的双醋炔诺醇标准品于10 mL的容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成1.0 mg/mL的储备液，于-20 ℃冰箱保存。使用时，根据需要用甲醇：水（1:1）逐级稀释成质量浓度分别为1、2、5、10、50、100 μg/L的标准工作液。
（2）样品前处理
取市售牛奶1 mL，加入100μL双醋炔诺醇工作液，然后加入5 mL乙腈沉淀蛋白，涡旋均匀后超声10 min，然后离心10000rpm 10min，取上清液，转移至离心管内，用氮吹仪40℃吹干，残留物用甲醇水100μL溶解，10000rpm 离心10min后取10μL进样分析。
空白牛奶除未加双醋炔诺醇工作液外，按同样方法处理。
（3）色谱与质谱条件
色谱柱：Inertsil ODS-3色谱柱（4.6×250 mm，5μm）（日本岛津制作所）
流动相：A：水（含0.1mM LiCl）：B：甲醇（含0.1mM LiCl）
梯度洗脱系统：0~5min，70%A~15%A；5~15min，15%A~2%A；15~20min，2%A
质谱条件：采用ESI离子源，正离子检测模式；扫描方式为反应监测模式（SRM），用于定性、定量分析的监测离子见表1。离子源参数：毛细管电压：+2.5 kV；脱溶剂气流速：600L/h；离子源温度为150 ℃；扫描频率：0.2s。
表1 以SRM模式优化双醋炔诺醇锂离子加合物形成子离子所需碰撞能量
分析物 母离子 子离子 碰撞压力 碰撞能量（eV）
[M+Li]<sup>+</sup> 391 227 1.5 mTorr 15
[M+Li]<sup>+</sup> 391 149 1.5 mTorr 20
【实验结果】
配制1~100μg/L系列浓度的双醋炔诺醇标准溶液，按照上述色谱质谱条件测定，以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，建立回归曲线方程，在1~100μg/L系列浓度范围内，呈现良好的线性关系，相关系数大于0.99，其中检出限和定量限分别为：0.5 ng/mL和0.1 ng/mL。
采用加标回收率来评价本分析方法的准确度，通过添加3个不同浓度（1、5、10 μg/L）的双醋炔诺醇标准溶液，添加到已知浓度的双醋炔诺醇溶液中，按照上述样品处理方法处理，进行上机测定，每个水平平行操作3份，计算回收率。结果显示双醋炔诺醇的加标回收率分别为：85.3%、90.8%和88.5%，说明本分析方法准确可靠。
采用建立的LC-MS方法对市售牛奶样品进行测定，每个样品做三次平行试验，经检测，市售牛奶中未检测双醋炔诺醇，人为添加双醋炔诺醇的牛奶样品中可以检测，结果为：13.6ng/mL。
显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种双醋炔诺醇的质谱分析方法，其特征在于：双醋炔诺醇的质谱分析方法是通过添加无机锂化合物到含有双醋炔诺醇的试样中，试样先经极性溶剂溶解后，再经管路输送至质谱离子源离子化，通过监测[M+Li]+离子或其碎裂离子来分析双醋炔诺醇的质谱分析。
2.如权利要求1所述的双醋炔诺醇的质谱分析方法，其特征在于：所述极性溶剂为甲醇水溶液。
3.如权利要求1所述的双醋炔诺醇的质谱分析方法，其特征在于：所述管路输送为经过色谱柱的液相管路。
4.如权利要求1所述的双醋炔诺醇的质谱分析方法，其特征在于：所述质谱离子源为电喷雾离子源。
5.如权利要求1所述的双醋炔诺醇的质谱分析方法，其特征在于：所述质谱为高分辨质谱或低分辨质谱。
6.如权利要求1所述的双醋炔诺醇的质谱分析方法，其特征在于：所述碎裂离子为荷质比m/z227和荷质比m/z149。
7.如权利要求1所述的双醋炔诺醇的质谱分析方法，其特征在于：所述无机锂化合物为氯化锂。
8.如权利要求7所述的双醋炔诺醇的质谱分析方法，其特征在于：所述氯化锂的加入量为使溶液中锂离子浓度为0.01~100mmol/L。
9.如权利要求3所述的双醋炔诺醇的质谱分析方法，其特征在于：所述色谱柱的液相管路的流速为0.5~1.0 mL/min。
10.如权利要求4所述的双醋炔诺醇的质谱分析方法，其特征在于：所述电喷雾离子源的喷雾电压为2~4 kV。
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