CN110715990A

CN110715990A - 一种同时检测血浆中acc007、拉米夫定和替诺福韦的方法

Info

Publication number: CN110715990A
Application number: CN201911073782.0A
Authority: CN
Inventors: 胡雄林; 刘三侠; 汪仙美; 沈小宁; 傅和亮; 李文全
Original assignee: Nanjing Ansailai Medical Science & Technology Co Ltd; Jiangsu Aidi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Nanjing Ansailai Medical Science & Technology Co Ltd; Jiangsu Aidi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2019-11-05
Filing date: 2019-11-05
Publication date: 2020-01-21

Abstract

本发明公开了一种同时测定血浆中ACC007、拉米夫定和替诺福韦的方法，先对血浆样品预处理，再采用高效液相色谱串联质谱进行定量测定，利用内标法定量，同时对血浆中三种药物的浓度进行分析测定。该方法灵敏度高、特异性强、精密度好、准确度高、稳定性好、提取回收率高、无明显基质效应和稀释效应等优点，适用于同时分析血浆中ACC007、拉米夫定和替诺福韦的量。

Description

一种同时检测血浆中ACC007、拉米夫定和替诺福韦的方法

技术领域

本发明属于医药中的药物分析检测技术，特别是涉及一种同时检测血浆中ACC007、拉米夫定和替诺福韦的方法。

背景技术

拉米夫定和富马酸替诺福韦二吡呋酯均为核苷类逆转录酶抑制剂(Nucleosidereverse transcriptase inhibitors,NRTIs)，拉米夫定对乙型肝炎病毒(HBV)和人免疫缺陷病毒(HIV)有较强的抑制作用，富马酸替诺福韦二吡呋酯(Tenofovir dsoproxilfumarate)是替诺福韦的前药，口服给药后富马酸替诺福韦二吡呋酯在胃肠道迅速吸收，随后经酯酶水解成单酯中间体和活性成分替诺福韦，从而发挥药理活性。ACC007为非核苷类逆转录酶抑制剂(Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor，NNRTI)，由江苏艾迪药业股份有限公司开发，具有优良的抗HIV病毒活性和很好的安全性。3种药物的化学结构式如图1所示。ACC007和拉米夫定、富马酸替诺福韦二吡呋酯三个药物联合使用，以“鸡尾酒疗法”用于治疗HIV感染。建立一种在血浆中同时检测ACC007、拉米夫定和替诺福韦的方法，就不必采用针对三种药物的不同检测方法，这样有助于加快检测时间，减少检测溶剂的使用，具有节能环保的效果。

发明内容

发明目的：针对上述现有技术，本发明提供了一种利用高效液相色谱串联质谱技术，能够实现灵敏度高、重复性好、准确度高的同时检测血浆中ACC007、拉米夫定和替诺福韦的方法。

技术方案：本发明所述的一种同时检测血浆中ACC007、拉米夫定和替诺福韦的方法，其采用高效液相色谱串联质谱技术检测经预处理的血浆样品，利用内标法定量，以ACC007、拉米夫定、替诺福韦标准样品的浓度为X轴，以标准样品与内标的峰面积比值为Y轴，建立标准曲线方程，将ACC007、拉米夫定和替诺福韦与内标峰面积的比值代入标准曲线，计算得到ACC007、拉米夫定和替诺福韦的浓度；具体色谱-质谱条件为：

(1)高效液相色谱条件：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；

流动相A：10nM醋酸铵含0.1％甲酸；

流动相B：甲醇；

柱温：40℃；

流速：0.4mL/min；

采用梯度洗脱方式，梯度见表1：

表1流动相梯度表

(2)质谱条件：

采用电喷雾电离源(ESI)，正离子扫描(高灵敏度模式)方式检测，GAS1：55psi，GAS2：55psi，Curtain GAS：30psi，源温度为450℃，多离子反应检测(MRM)，具体的离子信息见表2：

表2质谱监测的参数

所述血浆为人或动物的血浆。

本发明中，以甲苯磺丁脲为内标，所述内标工作溶液为含甲苯磺丁脲的甲醇。

所述血浆样品预处理方法如下：取血浆25μL，加入100μL含内标甲苯磺丁脲500nM的甲醇，涡流1min后沉淀蛋白，13000rpm离心10min后，定量吸取20μL上清液加入80μL去离子水，涡流1min即得。

本发明所述标准曲线的建立方法如下：取空白血浆，配制成相当于ACC007、拉米夫定、替诺福韦血浆浓度为10、20、40、50、80、100、200、400、500、800、1000、2000ng/mL的标准系列样品；按血浆样品预处理方法进行操作，建立ACC007、拉米夫定、替诺福韦的标准曲线，ACC007线性范围为10ng/mL到2000ng/mL，拉米夫定和替诺福韦线性范围为20ng/mL到2000ng/mL，以待分析物浓度为横坐标(X)，待分析物与内标甲苯磺丁脲的峰面积比值为纵坐标(Y)，其中ACC007和替诺福韦用加权(W＝1/X²)最小二乘法进行回归运算，拉米夫定用Power曲线回归，求得直线回归方程即为标准曲线。

有益效果：本发明建立了一种同时测定血浆中ACC007、拉米夫定和替诺福韦的方法，可以同时满足三种不同药物的检测需求，可减轻检测工作强度，节约时间，降低溶剂的使用，经济环保。经方法学验证，本发明方法灵敏度高、特异性强、精密度好、准确度高、稳定性好，能够用于血浆中ACC007、拉米夫定和替诺福韦的含量测定。

附图说明

图1为3种药物的化学结构式，其中(A)ACC007；(B)拉米夫定；(C)富马酸替诺福韦二吡呋酯；

图2为ACC007(A)、拉米夫定(B)、替诺福韦(C)和甲苯磺丁脲(D)的一级全扫描质谱图；

图3为ACC007(A)、拉米夫定(B)、替诺福韦(C)和甲苯磺丁脲(D)的[M+H]⁺产物离子全扫描质谱图；

图4为定量下限浓度的ACC007(A)，拉米夫定及替诺福韦(B)犬血浆样品MRM色谱图；

图5为比格犬空白血浆样品MRM色谱图。

具体实施方式

为了更好地说明本发明，以便理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1：比格犬血浆中ACC007、拉米夫定和替诺福韦的同时测定

1、仪器与试剂

岛津LC-20AD液相色谱系统(包括DGU-20A3型真空脱气机，SIL-20A自动进样器，LC-20AD型二元输液泵，CTO-20AC型柱温箱)，日本岛津公司；API4000QTrap型三重四极杆串联质谱仪，配备加热电喷雾电离源(ESI源)，美国AB SCIEX公司。

ACC007，纯度为98.3％，由江苏艾迪药业有限公司提供；富马酸替诺福韦二吡呋酯，含量98.5％，来自石家庄龙泽制药股份有限公司；拉米夫定，含量99.7％，来自石家庄龙泽制药股份有限公司；甲苯磺丁脲(Tolbutamide)，购自美国Aladdin公司；乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)购自德国Merck公司；甲酸(色谱纯)购自美国Sigma公司；乙酸铵(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司。

2、血浆样品采集

比格犬采购于北京玛斯生物技术有限公司，实验前一周内未参加过实验，未服用过其他药物，给药前比格犬身体状况正常，实验前比格犬禁食12hr，实验当天早晨空腹给予药物，于给药前及给药后定时采集前肢静脉血1mL至预先用1.5％EDTA抗凝的采血管中，以13000rpm离心10min后转移全部上层血浆，-80℃贮存。

3、样品处理方法

取犬血浆25μL，加入100μL含内标甲苯磺丁脲500nM的甲醇，涡流1min后沉淀蛋白，13000rpm离心10min后，定量吸取20μL上清液加入80μL去离子水，涡流1min，吸取80μL至进样瓶，10μL进样分析。超出最高检测浓度的样品经犬空白血浆稀释后测定。

4、色谱-质谱条件

色谱条件：色谱柱：BONNA-AgelaTM Venusil MP C18 column(2.1×150mm，5.0μm)，中国博纳艾杰尔科技有限公司；柱温为40℃；流速为0.4mL/min；流动相梯度见表1，

表1流动相梯度表

保留时间：ACC007 t_R≈3.90min，拉米夫定t_R≈3.22min，替诺福韦t_R≈3.19min，甲苯磺丁脲t_R≈3.74min。

质谱条件：采用电喷雾电离源(ESI)，正离子扫描(高灵敏度模式)方式检测，GAS1：55psi，GAS2：55psi，Curtain GAS：30psi，源温度为450℃，多离子反应检测(MRM)。具体的离子信息见表2。

表2质谱监测的参数

ACC007、拉米夫定、替诺福韦和甲苯磺丁脲的一级全扫描质谱图见图2(A、B、C、D)，ACC007、拉米夫定、替诺福韦和甲苯磺丁脲的[M+H]⁺产物离子全扫描质谱图见图3(A、B、C、D)。

5、方法学验证

5.1方法选择性：

分别取6份不同来源的比格犬空白血浆和1份比格犬溶血空白血浆47.5μL，加入2.5μL定量下限浓度的ACC007、拉米夫定、替诺福韦溶液，涡流1min，其他按血浆样品预处理方法操作，进样10.0μL，ACC007、拉米夫定、替诺福韦提取MRM色谱图见图4(A，B)。对照样品用2.5μL乙腈替代定量下限浓度的ACC007、拉米夫定、替诺福韦溶液，其它依同法操作，ACC007、拉米夫定、替诺福韦提取MRM色谱图见图5。与空白血浆样品的色谱图比较，结果表明血浆样品中内源性物质不干扰ACC007、拉米夫定、替诺福韦及其内标的测定，方法选择性好。

5.2残留：

在进完定量上限浓度点(ACC007、拉米夫定、替诺福韦浓度均为2000ng/mL)后进空白样品来考察残留影响，结果表明ACC007、拉米夫定、替诺福韦和内标甲苯磺丁脲均无残留。

5.3线性范围：

取比格犬空白血浆，配制成相当于ACC007、拉米夫定、替诺福韦血浆浓度为10、20、40、50、80、100、200、400、500、800、1000、2000ng/mL的标准系列样品。按血浆样品预处理方法进行操作，建立ACC007、拉米夫定、替诺福韦的标准曲线，以待分析物浓度为横坐标(X)，待分析物与内标甲苯磺丁脲的峰面积比值为纵坐标(Y)，其中ACC007和替诺福韦用加权(W＝1/X²)最小二乘法进行回归运算，求得直线回归方程即为标准曲线；拉米夫定用Power曲线回归。各药物的直线回归方程如表3所示。

表3各药物线性回归方程、相关系数、线性范围

药物	线性回归方程	相关系数(r<sup>2</sup>)	线性范围(ng/mL)
				ACC007	Y＝0.00133X-0.00154	0.9975	10-2000
拉米夫定	Y＝0.00967X^(0.924)	0.9991	20-2000
				替诺福韦	Y＝0.000235X-0.00108	0.9967	20-2000

备注：Y代表药物峰面积/内标峰面积，X代表浓度

5.4定量下限：

取犬空白血浆，配制成相当于ACC007血浆浓度均为10ng/mL，每天进行6样本分析，连续测定四天，根据当日标准曲线求得各个样本测定浓度，求得该浓度下ACC007的日内精密度(RSD)为7.38％，日间精密度(RSD)为9.22％。该结果表明LC-MS/MS法测定比格犬血浆中ACC007定量下限可达10ng/mL。

取犬空白血浆，配制成相当于拉米夫定和替诺福韦血浆浓度均为20ng/mL，每天进行6样本分析，连续测定四天，根据当日标准曲线求得各个样本测定浓度，计算得该浓度下拉米夫定和替诺福韦的日内精密度(RSD)分别为4.25％和6.06％，日间精密度(RSD)分别为10.01％和13.99％。该结果表明LC-MS/MS法测定比格犬血浆中拉米夫定和替诺福韦定量下限均可达20ng/mL。说明本方法灵敏度高。

5.5精密度与准确度：

取犬空白血浆配制低、中、高3个血浆浓度的QC样品(ACC007血浆浓度分别为25、800和1600ng/mL；拉米夫定和替诺福韦血浆浓度分别为50、800和1600ng/mL)，每一浓度进行6样本分析，连续测定四天，根据当日的标准曲线，计算QC样品测得的浓度，并根据QC样品的测得值计算本方法的准确度与精密度，结果显示，ACC007 QC样品的日内精密度在4.10％～9.09％，日间精密度在4.67％～7.41％，准确度在-4.57％～-2.55％之间；拉米夫定QC样品的日内精密度在2.80％～4.61％，日间精密度在4.58％～10.39％，准确度在-2.40％～0.26％之间；替诺福韦QC样品的日内精密度在1.69％～4.19％，日间精密度在5.57％～10.59％，准确度在0.37％～8.44％之间，ACC007、拉米夫定及替诺福韦QC样品测试结果均符合生物样品测定有关要求。说明本方法精密度好，准确性高。

5.6血浆样品提取回收率：

以各测试化合物血浆样品提取后的色谱峰面积，与空白血浆经提取后加入相应浓度的测试化合物质控对照溶液(ACC007为25、800和1600ng/mL；拉米夫定及替诺福韦为50、800和1600ng/mL)和内标溶液获得的色谱峰面积之比，计算回收率。ACC007低、中、高3个浓度的提取回收率分别为89.1％、95.2％和93.8％，拉米夫定低、中、高3个浓度的提取回收率分别为103.1％、107.0％和97.1％，替诺福韦低、中、高3个浓度的提取回收率分别为106.5％、105.9％和104.0％。

5.7稀释考察：

取ACC007、拉米夫定及替诺福韦血浆样品(浓度为4000ng/mL)，用犬空白血浆稀释40及80倍；取ACC007、拉米夫定及替诺福韦血浆样品(浓度为2000ng/mL)，用犬空白血浆稀释5、10及20倍，按血浆样品预处理方法操作，进行3样本分析，根据当日标准曲线计算每一样本测得浓度。ACC007、拉米夫定及替诺福韦经5倍稀释后测得的精密度分别为10.5％、3.5％、1.4％，准确度分别为3.5％、-6.3％、-8.5％。ACC007、拉米夫定及替诺福韦经10倍稀释后测得的精密度分别为2.3％、3.8％、1.8％，准确度分别为10.3％、-7.5％、-9.8％。ACC007、拉米夫定及替诺福韦经20倍稀释后测得的精密度分别为7.7％、2.4％、1.4％，准确度分别为11.3％、-11.3％、-11.6％。ACC007、拉米夫定及替诺福韦经40倍稀释后测得的精密度分别为4.7％、3.8％、3.0％，准确度分别为8.5％、-10.6％、-8.2％。ACC007、拉米夫定及替诺福韦经80倍稀释后测得的精密度分别为9.9％、5.5％、6.0％，准确度分别为-7.3％、10.7％、11.2％。结果表明，犬血浆样品经空白血浆稀释5倍、10倍、20倍、40倍和80倍后测定不影响结果的准确性。

5.8基质效应考察：

分别取6份不同来源的犬空白血浆和1份犬溶血空白血浆47.5μL，提取后加入含ACC007、拉米夫定及替诺福韦的质控对照溶液2.5μL，按照预处理方法处理后进样获得的色谱峰面积(B)，与水代替空白血浆获得的峰面积(A)比计算基质效应。以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算基质因子(MF)。通过ACC007的MF除以内标的MF，计算经内标归一化的MF。

ACC007在低、高两浓度经内标校正后的基质效应分别为103％和99％，相对标准差分别为5.65％和6.31％；拉米夫定在低、高两浓度经内标校正后的基质效应分别为113％和99％，相对标准差分别为11.37％和2.89％；替诺福韦在低、高两浓度经内标校正后的基质效应分别为93％和96％，相对标准差分别为7.13％和3.53％。结果表明在本实验选择的色谱和质谱条件下，可忽略基质效应的影响。

5.9稳定性考察：

考察含ACC007、拉米夫定及替诺福韦的血浆(ACC007浓度为25ng/mL和800ng/mL，拉米夫定和替诺福韦浓度为50ng/mL和800ng/mL)在不同保存条件下的稳定性。结果表明，ACC007的血浆样品经历三次冷冻解冻循环(-80℃至25℃)稳定(准确度在10.41％～11.22％之间)、室温放置5hr稳定(准确度在2.39％～7.10％之间)、全血4℃放置1.5小时稳定(准确度在0.87％～4.16％之间)、全血室温放置1.5小时稳定(准确度在1.38％～5.35％之间)、血浆样品的长期放置-80℃稳定性(准确度在8.34％～12.77％之间)、以及样品提取后在进样器放置24小时稳定(准确度在0.46％～6.92％之间)；拉米夫定的血浆样品经历三次冷冻解冻循环(-80℃至25℃)稳定(准确度在8.65％～12.85％之间)、室温放置5hr稳定(准确度在5.13％～5.96％之间)、全血4℃放置1.5小时稳定(准确度在4.02％～10.12％之间)、全血室温放置1.5小时稳定(准确度在3.86％～4.14％之间)、血浆样品的长期放置-80℃稳定性(准确度在0.91％～10.43％之间)、以及样品提取后在进样器放置24小时稳定(准确度在2.65％～4.01％之间)；替诺福韦的血浆样品经历三次冷冻解冻循环(-80℃至25℃)稳定(准确度在10.66％～11.40％之间)、室温放置5hr稳定(准确度在3.87％～4.41％之间)、全血4℃放置1.5小时稳定(准确度在1.49％～7.99％之间)、全血室温放置1.5小时稳定(准确度在3.20％～7.12％之间)、血浆样品的长期放置-80℃稳定性(准确度在7.29％～9.58％之间)、以及样品提取后在进样器放置24小时稳定(准确度在2.62％～5.05％之间)。结果表明，ACC007、拉米夫定、替诺福韦和内标甲苯磺丁脲在所有预处理过程中均稳定。

终上，经方法学验证，本发明方法具有灵敏度高、选择性好、精密度好、准确度高、稳定性好的优点。各药物提取回收率在可接受范围，未见明显基质效应，无明显稀释效应。

Claims

1.一种同时检测血浆中ACC007、拉米夫定和替诺福韦的方法，其特征在于，采用高效液相色谱串联质谱技术检测经预处理的血浆样品，利用内标法定量，以ACC007、拉米夫定、替诺福韦标准样品的浓度为X轴，以标准样品与内标的峰面积比值为Y轴，建立标准曲线方程，将ACC007、拉米夫定和替诺福韦与内标峰面积的比值代入标准曲线，计算得到ACC007、拉米夫定和替诺福韦的浓度；具体色谱-质谱条件为：

(1)高效液相色谱条件：

流动相A：10nM醋酸铵含0.1％甲酸；

流动相B：甲醇；

柱温：40℃；

流速：0.4mL/min；

采用梯度洗脱方式，梯度见表1：

表1流动相梯度表

(2)质谱条件：

表2质谱监测的参数

2.根据权利要求1所述的同时检测血浆中ACC007、拉米夫定和替诺福韦的方法，其特征在于，所述血浆为人或动物的血浆。

3.根据权利要求1所述的同时检测血浆中ACC007、拉米夫定和替诺福韦的方法，其特征在于，以甲苯磺丁脲为内标，所述内标工作溶液为含甲苯磺丁脲的甲醇。

4.根据权利要求1所述的同时检测血浆中ACC007、拉米夫定和替诺福韦的方法，其特征在于，所述血浆样品预处理方法如下：取血浆25μL，加入100μL含内标甲苯磺丁脲500nM的甲醇，涡流1min后沉淀蛋白，13000rpm离心10min后，定量吸取20μL上清液加入80μL去离子水，涡流1min即得。

5.根据权利要求1所述的同时检测血浆中ACC007、拉米夫定和替诺福韦的方法，其特征在于，所述标准曲线的建立方法如下：取空白血浆，配制成相当于ACC007、拉米夫定、替诺福韦血浆浓度为10、20、40、50、80、100、200、400、500、800、1000、2000ng/mL的标准系列样品，按血浆样品预处理方法进行操作，建立ACC007、拉米夫定、替诺福韦的标准曲线，ACC007线性范围为10ng/mL到2000ng/mL，拉米夫定和替诺福韦线性范围为20ng/mL到2000ng/mL，以待分析物浓度为横坐标(X)，待分析物与内标甲苯磺丁脲的峰面积比值为纵坐标(Y)，其中ACC007和替诺福韦用加权(W＝1/X²)最小二乘法进行回归运算，拉米夫定用Power曲线回归，求得直线回归方程即为标准曲线。