CN112834670A - 抗病毒药物临床研究血浆样本中替诺福韦艾拉酚胺及代谢物替诺福韦浓度的生物分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗病毒药物临床研究血浆样本中替诺福韦艾拉酚胺及代谢物替诺福韦浓度的生物分析方法，通过LC‑MS/MS对血浆中替诺福韦艾拉酚胺及代谢物替诺福韦进行分析，采用蛋白沉淀预处理方法，以替诺福韦艾拉酚胺‑d5和替诺福韦‑d7为内标，采用Eclipse Plus C₁₈色谱柱，梯度洗脱，电喷雾电离源(ESI)串联质谱检测。本发明操作简便、分析速度快、灵敏度高、满足临床研究大批量样品分析需求。

Description

抗病毒药物临床研究血浆样本中替诺福韦艾拉酚胺及代谢物 替诺福韦浓度的生物分析方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种抗病毒药物临床研究血浆样本中替诺福韦艾拉酚胺及代谢物替诺福韦浓度的生物分析方法。

背景技术

替诺福韦艾拉酚胺是替诺福韦的前体药物，它是一种新型核苷酸逆转移酶抑制剂，通过进入乙肝病毒的DNA逆转移酶中，抑制DNA的复制而用于治疗慢性乙肝。富马酸丙酚替诺福韦片由美国吉利德公司研发，2016年10月经FDA批准用于治疗成人慢性乙肝，商品名为Vemlidy。替诺福韦艾拉酚胺作为亲脂性药物在人体内羧酸酯酶作用下水解为替诺福韦。目前同时分析血浆中替诺福韦艾拉酚胺和替诺福韦的技术报道较少。仿制药临床研究及治疗性药物监测时需要测定受试者或患者血浆中替诺福韦艾拉酚胺及替诺福韦的浓度以研究其药动学行为。为了加速其临床应用，需要一种简便、准确、快速、灵敏度高的生物分析方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种抗病毒药物临床研究血浆样本中替诺福韦艾拉酚胺及代谢物替诺福韦浓度的生物分析方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种抗病毒药物临床研究血浆样本中替诺福韦艾拉酚胺及代谢物替诺福韦浓度的生物分析方法，包括以下步骤：

预处理，在96孔板中加入血浆，加入内标溶液，加入甲醇:乙腈(50:50，v/v)，涡流及离心后取上清液到另一干净96孔板中，加入含0.1％甲酸水溶液，涡流混匀，进样20.0μL；

色谱，将待测样品液相色谱分离，采用Eclipse Plus C₁₈色谱柱，梯度洗脱，流动相A为含0.1％甲酸和2mM醋酸铵水溶液，流动相B为乙腈，色谱运行时间5.3min；

质谱，采用电喷雾离子源，正离子检测，喷射电压5500V，气体1(Gas1)60psi，气体2(Gas2)60psi，气帘气体(Curtain Gas)35psi，离子源温度550℃，碰撞诱导解离9psi，驻留时间100ms，替诺福韦艾拉酚胺定量分析离子对m/z 477.2→346.1，碰撞能量(CE)60eV，去簇电压(DP)80V，替诺福韦定量分析离子对288.1→176.1，碰撞能量(CE)35eV，去簇电压(DP)80V，替诺福韦艾拉酚胺-d5定量分析离子对482.3→351.2，碰撞能量(CE)60eV，去簇电压(DP)80V，替诺福韦-d7定量分析离子对295.2→183.1，碰撞能量(CE)35eV，去簇电压(DP)80V。

优选地，所述的一种抗病毒药物临床研究血浆样本中替诺福韦艾拉酚胺及代谢物替诺福韦浓度的生物分析方法，所述预处理步骤，取100μL血浆样品，加入50.0μL内标溶液，加入300μL甲醇:乙腈(50:50，v/v)，涡流及离心后取100μL上清液到另一干净96孔板中，加入含0.1％甲酸水溶液，涡流混匀。

优选地，所述的一种抗病毒药物临床研究血浆样本中替诺福韦艾拉酚胺及代谢物替诺福韦浓度的生物分析方法，所述内标溶液为替诺福韦艾拉酚胺-d5和替诺福韦-d7溶液。

优选地，所述的一种抗病毒药物临床研究血浆样本中替诺福韦艾拉酚胺及代谢物替诺福韦浓度的生物分析方法，所述色谱步骤，色谱柱类型为Eclipse Plus C₁₈。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

1、本发明具有预处理操作简便的特点，仅需要一步提取及一步稀释即可进行分析，提取后样本易于保存，分析速度较快，分析时间为5.3min，因此本发明适合大批量临床研究样品分析。

2、本发明灵敏度较高、替诺福韦艾拉酚胺和替诺福韦定量下限分别为1.25和0.300ng/mL，检测限经计算分别为0.0380和0.0340ng/mL。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是替诺福韦艾拉酚胺产物离子扫描质谱图。

图2是替诺福韦产物离子扫描质谱图。

图3是替诺福韦艾拉酚胺-d5产物离子扫描质谱图。

图4是替诺福韦-d7产物离子扫描质谱图。

图5是空白血浆样品中替诺福韦艾拉酚胺(左)和替诺福韦艾拉酚胺-d5(右)的MRM色谱图。

图6是空白血浆样品中替诺福韦(左)和替诺福韦-d7(右)的MRM色谱图。

图7是定量下限样品中替诺福韦艾拉酚胺(左)和替诺福韦艾拉酚胺-d5(右)的MRM色谱图。

图8是定量下限样品中替诺福韦(左)和替诺福韦-d7(右)的MRM色谱图。

图9是1名健康受试者单次口服25mg富马酸丙酚替诺福韦片后替诺福韦艾拉酚胺的药物浓度-时间曲线。

图10是1名健康受试者单次口服25mg富马酸丙酚替诺福韦片后替诺福韦的药物浓度-时间曲线。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

液相色谱-串联质谱检测血浆中药物浓度的方法开发通常可分为三个部分，即提取方法(即预处理方法)、液相色谱方法和质谱方法。本发明针对现有技术缺点，从以上这三个方面着手建立分析方法。

实施例

前处理

本发明中使用血浆用量仅为100μL适合临床研究生物分析工作，本发明中的提取方法选用蛋白沉淀法、该方法对极性较弱的替诺福韦艾拉酚胺及极性较强的替诺福韦均有较高的回收率，并且具有操作简单、提取时间短、无须耗时的浓缩步骤。配合96孔板使用，适合临床研究中高通量样品预处理。

具体前处理方法步骤如下：

1、96孔板中加入100μL血浆样品，50.0μL内标溶液(20.0/3.00ng/mL)，300μL甲醇:乙腈(50:50，v/v)；

2、涡流混匀，离心10min(4℃，3900rpm)；

3、取100μL上清液到另一干净96孔板中；

4、加入300μL含0.1％甲酸水溶液稀释。

5、进样体积为20.0μL。

质谱

如图1至图4，采用电喷雾离子源，正离子检测，喷射电压5500V，气体1(Gas1)60psi，气体2(Gas2)60psi，气帘气体(Curtain Gas)35psi，离子源温度550℃，碰撞诱导解离9psi，驻留时间100ms，替诺福韦艾拉酚胺定量分析离子对m/z 477.2→346.1，碰撞能量(CE)60eV，去簇电压(DP)80V，替诺福韦定量分析离子对288.1→176.1，碰撞能量(CE)35eV，去簇电压(DP)80V，替诺福韦艾拉酚胺-d5定量分析离子对482.3→351.2，碰撞能量(CE)60eV，去簇电压(DP)80V，替诺福韦-d7定量分析离子对295.2→183.1，碰撞能量(CE)35eV，去簇电压(DP)80V。

色谱，将待测样品液相色谱分离，采用Eclipse Plus C₁₈色谱柱，梯度洗脱，流动相A为含0.1％甲酸和2mM醋酸铵水溶液，流动相B为乙腈。替诺福韦艾拉酚胺极性较弱在常规的反相色谱柱上保留显著，替诺福韦由于含有膦酸基团，极性较替诺福韦艾拉酚胺强，保留较弱。

本发明色谱分离采用Eclipse Plus C₁₈色谱柱，对待测物和内标均有较好的保留，且峰形尖锐。色谱采用的流动相A中加入了0.1％甲酸，可以将离子态替诺福韦转变为分子态，进而降低其极性增强色谱保留。由于替诺福韦和替诺福韦艾拉酚胺极性有一定差别，为了实现短时间内使两种待测洗脱，采用了快速梯度洗脱的模式。该模式下仪器分析通量较高，色谱运行时间为5.3min，检测快速，适用于临床研究大批量样品分析。

实施例一：

缩写说明

1材料

1.1仪器

日本岛津公司LC-30AD超高效液相色谱系统及AB Sciex Triple Quad^TM 6500⁺型三重四级杆串联质谱仪，配有ESI源。

数据处理采用Analyst 1.6.3软件。

北京赛多利斯仪器有限公司CP225D型分析天平。

日本贺默公司Z326K型台式离心机

5810R多功能台式离心机，德国Eppendorf公司

1.2对照品和试剂

替诺福韦艾拉酚胺(纯度98％)购自TRC公司；替诺福韦(纯度99.7％、含量93.4％)购自TLC公司；替诺福韦艾拉酚胺-d5(纯度98％)购自TRC公司；替诺福韦-d7(化学纯度99.8％、同位素纯度99.6％)购自TLC公司。甲醇(HPLC级)、乙腈(HPLC级)购自美国Sigma公司。甲酸(HPLC级)购自TCI公司。醋酸铵(HPLC级)购自ROE公司。去离子水(18.2mΩ,TOC≤50ppb)由Milli-Q超纯水系统制备。

2方法

2.1溶液及样品的配制

标准系列样品：精密称取替诺福韦艾拉酚胺对照品适量，以甲醇溶解并定容，精密称取替诺福韦对照品适量，以甲醇:水(10:90，v/v)溶解并定容，配制成替诺福韦艾拉酚胺和替诺福韦浓度均约为1.00mg/mL的贮备液。精密吸取各自贮备液适量，以人空白血浆逐级稀释得到混合标准系列样品，替诺福韦艾拉酚胺和替诺福韦浓度范围分别为1.25-500ng/mL和0.300-15.0ng/mL。

质控样品：采用与标准系列样品相似方法配制替诺福韦艾拉酚胺和替诺福韦4个浓度水平混合质控样品。定量下限浓度为1.25/0.300ng/mL，低质控(low qualitycontrol，LQC)浓度为3.75/0.900ng/mL，次中质控(Accessorial Middle QualityControl，AMQC)浓度为25.0/2.00ng/mL，中质控(medium quality control，MQC)浓度为250/7.50ng/mL，高质控(high quality control，HQC)浓度为400/12.0ng/mL。

内标溶液：精密称取替诺福韦艾拉酚胺-d5对照品，以甲醇溶解并定容，精密称取替诺福韦-d7对照品，以甲醇:水(10:90，v/v)溶解并定容，配制成浓度约为1.00mg/mL的内标贮备液。精密吸取上述各内标贮备液适量，加甲醇：水(50:50，v/v)稀释，获得替诺福韦艾拉酚胺-d5和替诺福韦-d7浓度分别为20.0和3.00ng/mL的内标溶液。

2.2血浆样品处理

2.3色谱及质谱条件

色谱条件

质谱条件

2.4方法学验证

按照中国药典9012指导原则对本方法进行了方法学验证，内容包括稳定性、选择性、线性、准确度、精密度、回收率基质效应等。

选择性

取六个来源不同的空白血浆及各自配制的定量下限样品处理后进样分析。色谱共流出干扰物的峰面积须小于定量下限待测物峰面积的20％，小于内标峰面积的5％。

标准曲线

以待测物理论浓度为横坐标(x)，待测物与内标物的峰面积比为纵坐标(y)，进行回归分析计算的直线回归方程(权重因子W＝1/x²)。方法验证每一分析批对标准曲线样品双样本分析。

精密度和准确度

方法验证每一分析批测定五个浓度质控样本各六样本。定量下限批内、批间精密度以相对标准差(RSD)计算小于20％方可接受，准确度以相对偏差计算(RE)在-20％～20％之间方可接受。其余各浓度水平的QC样品各成分批内、批间精密度需小于15％方可接受，准确度在-15％～15％之间方可接受。

稳定性

考察各待测物在血浆样品中的稳定性时，将LQC和HQC置于不同温度及环境中，放置结束后进行六样本分析。共考察四种放置条件，分别为：冰水浴放置9h，提取后进样器内放置101h，经历5次冷冻-解冻循环(从-75±10℃到冰水浴)，-75±5℃放置40天。

回收率

取空白血浆100μL，提取后(不加内标溶液)加入待测物溶液和内标溶液，使最终浓度与LQC、MQC和HQC相同，进样测定。另提取LQC、MQC和HQC各6份，进样测定。以2种处理方法的峰面积比值计算提取回收率。

基质效应

取6个不同来源空白血浆，提取后(不加内标溶液)，加入和LQC和HQC相同浓度的待测物溶液和内标溶液，涡流混合后测定。另取去离子水代替血浆，按上述方法处理。以两种方法获得的峰面积比值计算基质因子，通过内标归一化的基质因子的RSD评估基质效应，小于15％方可接受。

2.5临床研究

应用建立的方法分析临床研究血浆样本中替诺福韦艾拉酚胺及替诺福韦的浓度，用于富马酸丙酚替诺福韦片人体药动学研究。临床研究经过医院伦理委员会批准，受试者在试验前均被告知试验风险，自愿签署知情同意书。40名健康受试者给予25mg富马酸丙酚替诺福韦片。于给药前(0h)、给药后96h内不同时间点，采集静脉血取血各4mL，置EDTA-K2抗凝离心管中，离心(1700g，4℃)10min后分离血浆，-75±10℃保存。

3结果与讨论

3.1方法学验证

方法的选择性

如图5至图8所示，替诺福韦艾拉酚胺、替诺福韦、替诺福韦艾拉酚胺-d5和替诺福韦-d7保留时间分别约为4.12、2.95、4.11和2.95min，保留时间处无共流出干扰峰。

标准曲线

测定富马酸替诺福韦片临床研究血浆样本中替诺福韦艾拉酚胺和替诺福韦的线性范围分别为1.25-500ng/mL和0.300-15.0ng/mL。待测物标准曲线典型直线回归方程分别为：

替诺福韦艾拉酚胺:y＝0.0319x+0.00228；

替诺福韦:y＝0.85x+0.0297；

检测限

定量下限样品中替诺福韦艾拉酚胺和替诺福韦浓度分别为1.25和0.300ng/mL，信噪比分别为105和26.2。按照信噪比为3计算检测限分别为0.0380和0.0340ng/mL。

方法的精密度与准确度

精密度准确度结果均符合接受标准，结果见表1。其中，表1是测定人血浆中替诺福韦艾拉酚胺和替诺福韦精密度和准确度。

表1

处理回收率

LQC、MQC和HQC浓度水平：替诺福韦艾拉酚胺的提取回收率分别为103.2％、101.4％和100.0％；替诺福韦的提取回收率分别为101.1％、101.2％和98.9％；；替诺福韦艾拉酚胺-d5和替诺福韦-d7的回收率分别为100.8％和100.5％。

基质效应

LQC、HQC浓度水平下替诺福韦艾拉酚胺的内标归一化的基质因子分别为97.7％和99.1％，RSD分别为1.4％和1.4％；替诺福韦基内标归一化的质因子分别为105.4％和99.9％，RSD分别为2.6％和2.5％。以上结果表明，基质效应不干扰待测物分析的准确性。

血浆稳定性考察

血浆稳定性试验结果见表2，结果表明在考察条件下替诺福韦艾拉酚胺和替诺福韦均稳定，其中表2是替诺福韦艾拉酚胺和替诺福韦在人血浆中的稳定性(n＝6)。

表2

4人体药动学研究

将验证后的方法用于同时分析血浆中替诺福韦艾拉酚胺和替诺福韦，以评价其药动学特征。1名健康受试者单次口服25mg富马酸丙酚替诺福韦片，血浆药物浓度-时间曲线见图9和图10，检测方法灵敏度可完整描绘替诺福韦艾拉酚胺及其代谢产物替诺福韦的药动学特性，并且线性范围的选择与实际样本的浓度水平接近，测定准确性高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种抗病毒药物临床研究血浆样本中替诺福韦艾拉酚胺及代谢物替诺福韦浓度的生物分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

预处理，在96孔板中加入血浆，加入内标溶液，加入甲醇:乙腈的体积比为50:50，v/v，涡流及离心后取上清液到另一干净96孔板中，加入含0.1％甲酸水溶液，涡流混匀，进样20.0μL；

色谱，将待测样品液相色谱分离，采用Eclipse Plus C₁₈色谱柱，梯度洗脱，流动相A为含0.1％甲酸和2mM醋酸铵水溶液，流动相B为乙腈，色谱运行时间5.3min；

质谱，采用电喷雾离子源，正离子检测，喷射电压5500V，气体1(Gas1)60psi，气体2(Gas2)60psi，气帘气体(Curtain Gas)35psi，离子源温度550℃，碰撞诱导解离9psi，驻留时间100ms，替诺福韦艾拉酚胺定量分析离子对m/z477.2→346.1，碰撞能量(CE)60eV，去簇电压(DP)80V，替诺福韦定量分析离子对288.1→176.1，碰撞能量(CE)35eV，去簇电压(DP)80V，替诺福韦艾拉酚胺-d5定量分析离子对482.3→351.2，碰撞能量(CE)60eV，去簇电压(DP)80V，替诺福韦-d7定量分析离子对295.2→183.1，碰撞能量(CE)35eV，去簇电压(DP)80V。

2.根据权利要求1所述的一种抗病毒药物临床研究血浆样本中替诺福韦艾拉酚胺及代谢物替诺福韦浓度的生物分析方法，其特征在于：所述预处理，取100μL血浆样品，加入50.0μL内标溶液，加入300μL甲醇:乙腈(50:50，v/v)，涡流及离心后取100μL上清液到另一干净96孔板中，加入300μL含0.1％甲酸水溶液，涡流混匀。

3.根据权利要求1或2所述的一种抗病毒药物临床研究血浆样本中替诺福韦艾拉酚胺及代谢物替诺福韦浓度的生物分析方法，其特征在于：所述内标溶液为替诺福韦艾拉酚胺-d5和替诺福韦-d7溶液。

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