JP2010122030A - 非極性試料の質量分析 - Google Patents

Abstract

【課題】従来のＥＳＩ等のソフトイオン化法においては、アミノ酸、タンパク質および親水性（極性）物質を容易に検出することが可能であり、実際に生命化学の分野において利用されているが、上記方法は、溶液に電場を与えることによりイオン化を行う方法であるため、比誘電率が小さい非極性（無極性）溶媒においては効率的なイオン化を行うことは不可能であった。
【解決手段】本願発明は、非極性試料に対して、非極性溶媒を使用し、イオン化剤を添加することにより、プロトン付加、リチウム付加等のイオン化が達成され、単に噴霧するだけでイオン化した非極性試料を形成可能とした。また、ＥＳＩ法およびイオンスプレー法の適用も可能とした。
【選択図】図１

Description

本願発明は、非極性試料の質量分析（Mass Spectrometry、ＭＳ）に関するものである。ここで、非極性試料とは、非極性溶媒に溶解する試料であり、非極性溶媒とは、疎水基を有する溶媒であり、クロロホルム，ジエチルエーテルなどの低極性有機化合物分離抽出溶媒、パラフィン系炭化水素および芳香族炭化水素がその代表的な例である。

現在、最も高感度、高精度に試料を定量することができる方法として質量分析法が挙げられる。質量分析法を利用するにあたっては、試料分子をイオン化する必要がある。

イオン化は、大きく分けてハードイオン化とソフトイオン化の２種類に分けられる。前者の方法としては、電子イオン化法（ＥＩ法）、化学イオン化法（ＣＩ法）及び大気圧イオン化法（ＡＰＩ法）が挙げられ、後者の方法としてはエレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ法）、イオンスプレー法（ＩＳ法）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ法）及び高速原子衝撃イオン化法（ＦＡＢ法）が挙げられる。

ソフトイオン化法であるエレクトロスプレー法（ＥＳＩ法）、またＥＳＩ法を改良したイオンスプレー法（ＩＳ法）を用いるとアミノ酸、タンパク質および極性物質（親水性物質）を容易に検出することができ、生命科学の分野において実際に利用されている。

しかし、この方法においては溶液自体が電場の影響を受けることが避けられないので、比誘電率が小さい非極性（非極性）溶媒においては適用が不可能であるといわれていた。

また、材料の性質によりイオン化法を分類すると、気体の試料に対しては、ＥＩ法又はＡＰＣＩ法が好ましく、水溶性の液体試料に対しては、ＥＳＩ法又はＭＡＬＤＩ法が好ましい。また、固体試料に対しては、ＭＡＬＤＩ法が適用可能である（特許文献１及び２参照）。

しかるに、非極性（脂溶性、比誘電率の小さい）試料にたいしては、どの方法も対応困難であった。例えば、もっともソフトなイオン化法であるＥＳＩ法の場合、試料に電場を印加しイオン化を行うが、非極性（脂溶性）の試料は、比誘電率が小さいため、効果的にイオン化するのは不可能である。
特願２００８−１８６６８７号 国際公開ＷＯ０２／００４９３６号公報

従来のＥＳＩ等のソフトイオン化法においては、アミノ酸、タンパク質および親水性（極性）物質を容易に検出することが可能であり、実際に生命化学の分野において利用されているが、上記方法は、溶液に電場を与えることによりイオン化を行う方法であるため、比誘電率が小さい非極性（無極性）溶媒においては効率的なイオン化を行うことは不可能であった。

そこで、本願発明の課題は、非極性、換言すれば、比誘電率の小さい又は脂溶性物質をイオン化し、質量分析を可能とする方法を提供することである。

本願発明は、非極性試料に対して、非極性溶媒を使用し、イオン化剤を添加することにより、プロトン付加、リチウム付加等のイオン化が達成され、単に噴霧するだけでイオン化した非極性試料を形成可能とした。また、ＥＳＩ法およびイオンスプレー法の適用を可能とした。

添加するイオン化剤としては、単純な塩ではなく、Ｌｉ付加が非常に起こりやすい物質又はプロトン付加が容易に起こりやすい物質が好ましく、これらを添加することにより積極的にイオン化が促進される。
例えば、Ｌｉ付加剤としては、テトラフェニルボレートおよびその誘導体、アニオンをもつLi塩、トリフルオロメタンスルホン酸Li塩、ビス(トリフルオロメタンスルホニル)イミドLi塩、LiClO₄、LiBF₄、LiPF₆及びＬｉＴＦＰＢ等であり、好ましいのは、ＬｉＴＦＰＢである。
また、プロトン付加剤としては、トリフルオロ酢酸ナトリウムが代表的であるが、上記Ｌｉ付加剤において、LiをHに置換したものが用いられる。

また、非常に揮発性の高い非極性溶媒を用いることによりネブライザーによって噴霧された液滴の気化が促進される。これによって通常のイオンスプレーで生成する液滴よりもより微細な液滴が生成するために効率良いイオン化が可能となった。

非極性試料としては、ＥＳＩ法やイオンスプレー法において検出困難と言われていた環境物質、食品および健康関連物質が検出可能となった。化学物質で言えば、アルカン、テルペン類、アルケン、エステル、エーテルおよび低極性（アルキル鎖が大きい）アルコール等の化合物である。

具体的には、非極性試料としては、ステアリン酸ドデシル、コレステロール、メントール、リノレン酸およびジフェニルホスフィン酸等が挙げられる。

非極性溶媒としては、ジクロロメタン、ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレン、ヘキサン、クロロホルム、トルエン、ベンゼン、ジエチルエーテル等が挙げられる。

＜液相Ｌｉ＋付加メカニズムのモデル＞
図１に、非極性溶媒に試料とイオン化剤を添加した場合のモデルを示す。図１に示すように、非極性溶媒中においては、Ｌｉ＋付加分子陽イオンと対陰イオンとがイオン会合体を形成しながら溶解している。

この会合体を、ネブライザーを用いて数ミクロン以下にミスト化すれば、例えば、非極性溶媒がジクロロメタンの場合、その沸点は、３７℃なので、纏っている溶媒が瞬時に気化し、裸のイオンペアーが気相中に分散される。

イオン化剤としてLiTFPB（Lithium tetrakis（3，5−bis（trifluoromethyl）pheny1）borate）を使用した場合には、ＴＦＰＢ試薬中心にあるホウ素陰イオンとＬｉ＋の距離が大きいため電気的誘引性が弱いので、カチオンとアニオンがゆったりとしたイオンペアーを形成している。

そのため、キャピラリー経由で差動排気により真空系の質量分析装置に取り込まれていく。イオンガイドを働かせて差動排気し、〔Ｍ＋Ｌｉ〕＋をイオン輸送した後、質量分析することができる。

ＥＳＩ法及びイオンスプレー法においては検出困難と言われていたアルカン、テルペン類、アルケン、エステル、エーテルおよび低極性（アルキル鎖が大きい）アルコール等の化合物も測定可能となった。

以下に、本願発明を実施するための最良の形態を示す。

＜メントールの質量分析＞
装置の概要を説明する。
図２に示すように、本願発明の第１の実施例に係る質量分析装置の概略は、非極性溶媒に非極性試料およびイオン化剤を混合し、該イオン化剤が混合された液体試料を噴霧ガス（ネブライザーガス）により微細液滴（ミスト）化する噴霧装置（ネブラザー）および該微細化された液滴を分析部に導き質量分析する質量分析器（ＭＳ）から構成されている。

＜試料の調製＞
非極性試料であるメントール（分子量＝１５６．２７ｇ／ｍｏｌ）０．５ｍＭ（ミリモル）を非極性溶媒である１，２−ジクロロエタン１０ｍＬにイオン化剤であるＬｉＴＦＰＢ０．５ｍＭとともに溶解し、試料溶液を得た。

上記溶液を上記第１の実施例の質量分析装置により、分析して得られた質量スペクトルを図３に示す。この図から明らかなように、［２Ｍ＋Ｌｉ］^＋の信号は、１．２×１０^４イオン・カウントあり、バックグラウンドよりはるかに大きく、感度よく計測可能である。

＜コレステロールの質量分析＞
質量分析装置は、上記実施例１の装置と同じである。

＜試料の調製＞
ステロイドホルモンの一種であるコレステロール（分子量＝３８６．６５ｇ／ｍｏｌ）０．５ｍＭを非極性溶媒であるジクロロメタン１０ｍＬにイオン化剤であるＬｉＴＦＰＢ０．５ｍＭとともに溶解し、試料溶液を得た。

上記溶液を上記第１の実施例の質量分析装置により、分析して得られた質量スペクトルを図４に示す。［２Ｍ＋Ｈ_２Ｏ＋Ｌｉ］^＋の信号は、３×１０^４イオン・カウント程度あり、コレステロールを感度良く計測することが出来る。

＜ステアリン酸ドデシルの質量分析＞
本願発明の第３の実施例に係る質量分析装置の概略を図８に示す。通常、イオンスプレー装置（ＩＳ）と呼ばれる装置である。非極性溶媒に非極性試料およびイオン化剤を混合し、該イオン化剤が混合された液体試料を噴霧ガス（ネブライザーガス、ここでは窒素）により微細液滴（ミスト）化する噴霧装置（ネブラザー）および該微細化された液滴を分析部に導き質量分析する質量分析器（ＭＳ）から構成されている。第１の実施例に用いた装置と異なる点は、ネブライザーに高電圧が印加されている点である。

＜試料の調製＞
非極性溶媒であるジクロロメタンに試料であるステアリン酸ドデシルを０．１ｍＭおよびイオン化剤であるＬｉＴＦＰＢを１ｍＭ添加して溶解し、試料溶液を得た。

上記試料溶液を上記図８に示す質量分析装置により分析した結果を図５に示す。
図５に見られるように、ネブライザーに電圧を印加して得た信号は、感度がよい反面、当然ながら、雑音も多くなる欠点を有している。すなわち、［Ｍ＋Ｌｉ］^＋信号は、１×１０^４イオン・カウント程度と小さく、多少雑音に埋もれる可能性があるが、［Ｍ＋Ｈ_２Ｏ＋Ｌｉ］^＋信号は、４×１０^４イオン・カウント程度と大きくステアリン酸を感度良く計測することが出来る。

＜γリノレン酸の質量分析＞
疎水性溶媒であるジクロロメタン１０ｍＭに試料であるγリノレン酸を０．５ｍＭおよびイオン化剤であるＬｉＴＦＰＢを０．５ｍＭ添加して溶解し、試料溶液を得た。

上記試料溶液を図２に示す質量分析装置により分析した結果を図６に示す。
図６に見られるように、［Ｍ＋Ｌｉ］^＋信号は、１．４×１０^５イオン・カウント程度と大きく、［２Ｍ＋Ｌｉ］^＋信号も５×１０^４イオン・カウント程度であり、リノレン酸を感度良く計測することが出来る。

＜ジフェニルホスフィン酸の質量分析＞
疎水性溶媒であるジクロロメタン１０ｍＭに試料であるジフェニルホスフィン酸を０．５ｍＭおよびイオン化剤であるＬｉＴＦＰＢを０．５ｍＭ添加して溶解し、試料溶液を得た。

上記試料溶液を上記図２に示す質量分析装置により分析した結果を図７に示す。
図７に見られるように、［２Ｍ＋Ｌｉ］^＋信号は、１．２×１０^５イオン・カウント程度と大きく、［３Ｍ＋Ｌｉ］^＋信号、［４Ｍ＋Ｌｉ］^＋信号は、共に５×１０^４イオン・カウント程度であり、リノレン酸を感度良く計測することが出来る。

ところで、最近では高速液体クロマトグラフィ（High performance liquid chromatography、ＨＰＬＣ）で分離した試料をオンラインで質量分析法を用いて同定を行う手法（ＬＣ／ＭＳ）が化学、生物学の分野で頻繁に利用されている。この場合、液体クロマトグラフィと相性の良いイオン化法は、キャピラリー先端から流出する溶液試料を直接イオン化する方法であるため、先に記したＥＳＩ法、あるいはＩＳ法が好ましく使用されていた。

本願発明においても、ＬＣ／ＭＳの組み合わせが好ましく、その概念図を図９（混合方式１）及び図１０（混合方式２）に示す。

図９の混合方式１の装置においては、試料をネブライザーに導く導管の途中からイオン化剤を混入する方式である。この方法だと混合試料をＬＣで分離した後にイオン化剤を混合することになるのでＬＣの通常運転が可能である。図９においては、ネブライザーに高電圧を印加したイオンスプレー法の装置を示しているが、実施例１において示した装置でも構わない。

また、図１０の混合方式２においては、ネブライザーが三重管になっており、最内管にＬＣから分離された試料を導き、中間管にイオン化剤を導き、最外管にネブライザーガスを導く構成である。この方式においては、試料とイオン化剤が混合される時間が短いにもかかわらず、イオン化反応が促進することを確認した。

（１）リノレン酸の分析・・・脂肪酸の代謝産物解析、体内吸収、メタボリックシンドローム解析に応用可能である。
（２）フォスフィン酸の分析・・・有機ヒ素化合物の代謝産物解析、メタロミクス支援研究（ヒジキ、ワカメ食品）に応用可能である。
（３）ステロイド、コレステロールの分析・・・脂質代謝産物解析、メタボローム解析、スクアラン、スクアレン反応解析に応用可能である。
（４）アルケン化合物、分岐ＣＨ化合物の分析・・・二重結合をもつスクアランなどでは局在化したマイナス箇所にＬｉ＋付加が起こることが推定されるので、これらの存在検出に応用可能である。
（５）本願発明の方法は、ＴＯＦのみならず、四重極、セクター、いずれの質量分析装置に適用可能である。

液相Ｌｉ＋付加メカニズムの簡易説明図 本願発明に係るイオン化装置の第１の実施例 テルペン類の検出例 ステロイドホルモンの検出例 ステアリン酸ドデシルの検出例 リノレン酸の検出例 ジフェニルホスフィン酸の検出例 本願発明に係るイオン化装置の第２の実施例 本願発明に係るイオン化装置の第３の実施例 本願発明に係るイオン化装置の第４の実施例

Claims (9)

1. 非極性試料のイオン化法において、非極性溶媒にイオン化剤を溶解させた溶液を調製し、該溶液に該非極性試料を付与した液体を作製し、該液体を霧化することによりイオン化した該非極性試料を形成することを特徴とする非極性試料のイオン化法。
2. 上記試料は、アルカン、テルペン類、アルケン、エステル、エーテル又は低極性アルコールであることを特徴とする請求項１に記載の非極性試料のイオン化方法。
3. 上記イオン化は、プロトン付加又は１価の陽イオン付加であることを特徴とする請求項１に記載の非極性試料のイオン化方法。
4. 上記イオン化剤は、ＬｉＴＦＰＢであることを特徴とする請求項１に記載の試料のイオン化方法。
5. 上記非極性溶媒の沸点は、３０℃以上５０℃以下であることを特徴とする請求項１に記載の非極性試料のイオン化方法。
6. 上記非極性溶媒は、ジクロロメタン、ジクロロエタン、トリクロロエチレン又はテトラクロロエチレンであることを特徴とする請求項１に記載の非極性試料のイオン化方法。
7. 上記非極性試料は、液体クロマトグラフィ装置より導かれた物であることを特徴とする請求項１に記載の非極性試料のイオン化法。
8. 非極性試料の質量分析法であって、請求項１に記載のイオン化した非極性試料を質量分析することを特徴とする非極性試料の質量分析法。
9. 非極性試料の質量分析装置であって、非極性溶媒にイオン化剤及び該非極性試料が添加された溶液を噴霧するネブライザー及び該ネブライザーを通して噴霧されイオン化した該非極性試料の質量を分析する分析部を有する非極性試料の質量分析装置。
   

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