CN105651921A - 一种利用硫酸寡糖组鉴别北极刺参的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于检测北极刺参的硫酸寡糖组合及检测方法，利用海参中对照硫酸寡糖的检测，来鉴别北极刺参，特异性好，分析准确可靠。检测方法具有简便快速，灵敏度高，分辨率高的特点。采用液相色谱-质谱联用技术，可以一步完成海参硫酸寡糖混合物的分离和分析，质谱能够准确分辨来源于岩藻糖基硫酸软骨素和岩藻聚糖的混合硫酸寡糖，节省了硫酸寡糖的离子交换柱纯化、凝胶色谱柱分离和脱盐等步骤，大大缩短了检测时间。本方法灵敏度高，需要的样品量仅为5μg。质谱还能够检测到寡糖混合物中所有微量的寡糖，得到北极刺参的硫酸寡糖的全指纹谱图，通过对照硫酸寡糖的分析可以准确的鉴别北极海参。

Description

一种利用硫酸寡糖组鉴别北极刺参的方法
技术领域
本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种鉴别北极刺参的方法。
背景技术
海参富含硫酸多糖、蛋白质，皂苷、矿物质，且不含胆固醇，故享有“营养宝库”之美誉。目前市场上海参种类繁多，良莠不齐，不同海参因其营养价值、口感不同而价格相差巨大。目前鉴别海参种类的方法只是传统的外观和骨片观察，误差比较大，缺乏技术水平的支持。在海参牛奶、海参饮液中，缺少分析海参的种类的方法，导致不少不良商人以次充好、以假充真欺骗消费者。而且目前市面上出现了使用海藻粉或魔芋粉制成的假海参，没有海参特有的营养成分。因此需要一种高效准确的鉴定海参品种的分析方法。
海参中含有两种独特的硫酸多糖，主要为具有岩藻糖支链的硫酸软骨素和直链岩藻聚糖硫酸酯，占海参干重的4％左右，对人体有免疫调节剂、抗凝血、控制血糖和降血脂等功效。这两种硫酸多糖结构复杂，因海参的种类和生长海域不同而有差别，可以作为鉴别海参种类的目标化合物。
采用化学方法分析海参硫酸多糖的结构，传统的方法主要采用NMR分析，但是要求硫酸多糖的纯度高、样品量大。海参硫酸多糖的分析需要进行离子交换色谱纯化、降解、凝胶柱纯化和脱盐等多步复杂的分离纯化步骤，一个样品总共需要近20天的时间才能完成。而且这些硫酸多糖分子量大、组成复杂，所以NMR吸收峰重叠，无法鉴别不同海参来源的硫酸多糖细微的结构区别。因此迫切需要一种更加快速简便、分辨率高的检测海参硫酸多糖的分析方法。
发明内容
本发明对北极刺参的硫酸寡糖进行了研究，建立了从硫酸寡糖水平对北极刺参进行鉴别的技术，从而弥补了现有技术的不足。
本发明首先提供一种用于检测北极刺参的硫酸寡糖组合，所述的寡糖组合，其中第一组合为(GalNAc)1(Fuc)1(SO4)n，其中n＝1-4；第二组合为
(GalNAc)1(Hex)1(SO4)n(n＝2-3)、(GalNAc)1(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝1-4)、(GalNAc)2(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝4-6)、(GalNAc)3(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝4-7)、(GalNAc)3(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝5-7)。
本发明还提供一种检测北极刺参的方法，所述方法包括以下步骤：
1)对待侧样本进行液相色谱-质谱前处理，获得待测硫酸寡糖溶液；
2)通过液相色谱-质谱联用法检验待测样本的硫酸寡糖成分，分析样本中的北极刺参成分。
所述的液相色谱-质谱前处理步骤如下：
1)固体干海参粉碎成粉末状态，加入0.1mol/L的磷酸缓冲溶液(pH8.0，15mmol/LEDTA-Na2、5mmol/L半胱氨酸)、碱性蛋白酶和胰蛋白酶，50℃酶解24h；将反应物沸水浴5min灭酶活后离心，取上清液；
2)取氯化十六烷基吡啶水溶液加入上述上清液中，室温静置，离心，收集沉淀；
3)将步骤2)收集的沉淀用添加了NaCl的乙醇溶液(3mol/LNaCl，86％乙醇)溶解后，加入95％乙醇，4℃下放置24h，离心后，收集沉淀，完成海参硫酸多糖的提取；
4)将海参硫酸多糖溶于0.5mol/LNa2HPO4溶液中，加入醋酸铜溶液和H2O2，60℃水浴降解3h；然后用NaOH调节溶液至pH9.0，离心后，取上清液；
5)采用1kDa的滤膜4000×g超滤10min，收集上层的滤液，完成海参硫酸寡糖溶液的制备，待上机检测。
所述的液相色谱-质谱联用法检测，色谱条件如下：色谱柱：LunaHILIC柱(2.0×150mm，5μm)，流动相A：5mM醋酸铵水溶液，流动相B：乙腈，进样量为4μL，流动相A的洗脱梯度是10％-35％，0-40min洗脱，流速150μL/min；质谱的条件：负离子模式，电喷雾源，质量分析器为Orbitrap-傅里叶转换，负离子电力模式，毛细管电压-40V，套管透镜补偿电压-50V，毛细管温度设为275°层流量为30，辅助气体的流量6，扫描分子量300-1000u，Xcalibur质谱软件中处理。
所述的分析样本中的北极海参成分，是将待测样品的质谱结果对比上述组合的寡糖的质谱谱图，同时出现上述寡糖组合的各条特异性的硫酸寡糖的质谱检测谱图时，可以判断该组织样品为北极刺参样本。
本发明的方法利用海参中对照硫酸寡糖的检测，来鉴别北极刺参，特异性好，分析准确可靠。检测方法具有简便快速，灵敏度高，分辨率高的特点。采用液相色谱-质谱联用技术，可以一步完成海参硫酸寡糖混合物的分离和分析，质谱能够准确分辨来源于岩藻糖基硫酸软骨素和岩藻聚糖的混合硫酸寡糖，节省了硫酸寡糖的离子交换柱纯化、凝胶色谱柱分离和脱盐等步骤，大大缩短了检测时间。本方法灵敏度高，需要的样品量仅为5μg。质谱还能够检测到寡糖混合物中所有微量的寡糖，得到北极刺参的硫酸寡糖的全指纹谱图，通过对照硫酸寡糖的分析可以准确的鉴别北极海参。
附图说明
图1，(GalNAc)1(Fuc)1(SO4)n(n＝1-4)在ThermoQ-E质谱上的质谱图、
图2，(GalNAc)1(Hex)1(SO4)n(n＝2-3)在ThermoQ-E质谱上的质谱图、
图3，(GalNAc)1(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝1-4)在ThermoQ-E质谱上的质谱图、
图4，GalNAc)2(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝2-6)在ThermoQ-E质谱上的质谱图、
图5，(GalNAc)3(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝4-7)在ThermoQ-E质谱上的质谱图、
图6，北极刺参寡糖的液相色谱-质谱联用分析的总离子流图、
图7，目标寡糖在北极刺参中的质谱图、
图8，(GalNAc)1(Fuc)1(SO4)n(n＝1-4)在液相色谱-质谱联用分析的提取质谱图、
图9，(GalNAc)1(Hex)1(SO4)n(n＝2-3)在液相色谱-质谱联用分析图、
图10，(GalNAc)1(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝1-4)在液相色谱-质谱联用分析图、
图11，GalNAc)2(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝2-6)液相色谱-质谱联用分析图、
图12，(GalNAc)3(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝4-7)在液相色谱-质谱联用分析图。
具体实施方式
本发明利用液相色谱-质谱联用技术检测北极刺参的硫酸寡糖的全指纹图谱，对比仿刺参、海地瓜、美国肉参、墨西哥参来源的硫酸寡糖，鉴别出两组硫酸寡糖为北极刺参特有的。下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1，北极刺参来源特异的硫酸寡糖的结构和对比信息
1.北极刺参独有的岩藻糖支链硫酸软骨素寡糖
北极刺参独有的寡糖(GalNAc)1(Fuc)1(SO4)n(n＝1-4)，来自北极刺参的硫酸软骨素糖链，为乙酰氨基半乳糖(GalNAc)与岩藻糖(Fuc)组成的二糖，分别含有1-4个硫酸根。这证明北极刺参的硫酸软骨素糖链中，部分岩藻糖支链连接在乙酰氨基半乳糖上。而美国肉参、海棒槌中的岩藻糖硫酸软骨素，其岩藻糖支链只连接在糖醛酸上。经过对比证明，(GalNAc)1(Fuc)1(SO4)n(n＝1-4)是北极刺参中特有的二糖。
采用ThermoScientificQExactiveTM质谱(ThermoQ-E)检测目标寡糖的质谱图。
图1是(GalNAc)1(Fuc)1(SO4)n(n＝1-4)在ThermoQ-E质谱上的质谱图。
其母离子、电荷和糖链组成如表1所示。
表1(GalNAc)1(Fuc)1(SO4)n(n＝1-4)的母离子、电荷数和糖链组成
备注：GalNAc-乙酰氨基半乳糖，Fuc-岩藻糖，GlcA-葡萄糖醛酸，SO4-硫酸根，数字代表单糖和硫酸根的个数。
2.北极刺参独有的己糖硫酸寡糖
北极刺参独有的己糖硫酸寡糖(GalNAc)1(Hex)1(SO4)n(n＝2-3)，来自北极刺参中的硫酸软骨素，是由乙酰氨基半乳糖(GalNAc)和己糖(Hex：半乳糖、葡萄糖或甘露糖)组成的二糖，分别有2-3个硫酸根，说明己糖(半乳糖、葡萄糖或甘露糖)主要连接在乙酰氨基半乳糖上，而且己糖上也有硫酸根取代。虽然在细胞的N-糖链中存在这种二糖，比较刺参、海地瓜、美国肉参、墨西哥参的硫酸寡糖，确定(GalNAc)1(Hex)1(SO4)n(n＝2-3)为北极刺参中独有的寡糖。
己糖三糖(GalNAc)1(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝1-4)、四糖(GalNAc)2(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝2-6)、五糖(GalNAc)3(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝4-7)，来自北极刺参中的硫酸软骨素，是由乙酰氨基半乳糖(GalNAc)、葡萄糖醛酸(GlcA)和己糖(Hex：半乳糖、葡萄糖或甘露糖)组成的寡糖，说明在硫酸软骨素的糖链上，有己糖(半乳糖、葡萄糖或甘露糖)构成的支链。而刺参、海地瓜、美国肉参、墨西哥参的硫酸软骨素中只有岩藻糖支链，未发现己糖(半乳糖、葡萄糖或甘露糖)支链。对比刺参、海地瓜、美国肉参、墨西哥参，这些寡糖是北极刺参中特有的硫酸寡糖。
采用ThermoScientificQExactiveTM(ThermoQ-E)质谱仪法检测目标寡糖的质谱图
图2是(GalNAc)1(Hex)1(SO4)n(n＝2-3)在ThermoQ-E质谱上的质谱图
图3是(GalNAc)1(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝1-4)在ThermoQ-E质谱上的质谱图，
图4是(GalNAc)2(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝2-6)在ThermoQ-E质谱上的质谱图，
图5是(GalNAc)3(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝4-7)在ThermoQ-E质谱上的质谱图
其糖链组成、母离子和电荷数入表2所示。
表2北极刺参中目标硫酸寡糖的母离子、电荷和糖链结构
其中GalNAc-乙酰氨基半乳糖，Fuc-岩藻糖，Hex-己糖(半乳糖、葡萄糖或甘露糖)，GlcA-葡萄糖醛酸，SO4-硫酸根，数字代表单糖或硫酸根的个数
实施例2对北极海参的检测步骤
对待测海参样本进行分析的步骤包括
(一)样本前处理步骤：
(1)固体干海参(含水率低于10％的北极刺参，该％为质量％)均质成粉末状态。称取1g粉状物，加入30mL0.1mol/L的磷酸缓冲溶液(pH8.0，15mmol/LEDTA-Na2、5mmol/L半胱氨酸)、50mg碱性蛋白酶和15mg胰蛋白酶，50℃水浴搅拌酶解24h。之后将反应物沸水浴5min灭酶活，冷却至室温。离心(5000×g，10min)，取上清液。
(2)、将步骤1)所得上清液(即海参酶解液)中加入1.6mL质量浓度为10％氯化十六烷基吡啶水溶液，室温静置5h，离心(2000×g，15min，20℃)，弃上清，得沉淀。
(3)、将步骤2)所得的沉淀溶解于15mLNaCl的乙醇溶液(3mol/L氯化钠，86％乙醇)中溶解。然后再加入30mL95％乙醇，4℃下放置5h，离心(4000×g，15min，20℃)，取沉淀。将沉淀用30mL95％乙醇洗涤2次，得硫酸多糖的混合物(即海参硫酸多糖粗品)。
(4)将步骤3)所得的海参硫酸多糖粗品溶于5mL0.5mol/LNa2HPO4溶液中，加入100μL150mmol/L醋酸铜溶液、50μL4.5％H2O2，60℃水浴反应3h。然后用2mol/LNaOH调节溶液pH9.0，离心(4000×g，15min，20℃)，取上清液。
(5)取步骤(4)得到的上清液，用1kDa的滤膜4000×g超滤10min，收集上层的滤液，再用30μL水清洗上层滤膜，合并滤液，定容到100μL，加入100μL乙腈，10000×g离心10min后，取上清液，得到北极刺参硫酸多糖自由基氧化降解产物(海参硫酸多糖降解物)，待上机检测。
(二)液相色谱与质谱条件
实验仪器和试剂如下：
液相色谱：Agilent1260，质谱：QExactiveTM质谱仪(ThermoFisherScientific)将步骤(4)所得的海参硫酸多糖降解物加入等体积的乙腈，离心(10000×g，10min，20℃)。色谱条件：色谱柱：LunaHILIC柱(2.0×150mm，5μm)，流动相A：5mM醋酸铵水溶液，流动相B：乙腈，进样量为4μL，流动相A的洗脱梯度是10％-35％，0-40min洗脱，柱温30℃，流速150μL/min。
质谱的条件：负离子模式，电喷雾源，质量分析器为Orbitrap-傅里叶转换，负离子电力模式，毛细管电压-40V，套管透镜补偿电压-50V，毛细管温度设为275°层流量为30，辅助气体的流量6，扫描分子量300-1000u，Xcalibur质谱软件中处理。
分析结果：
1.北极刺参中岩藻糖支链硫酸软骨素寡糖的鉴定
经海参粗糖提取、降解和液相色谱-质谱联用分析，可以得到北极刺参的硫酸寡糖的全指纹谱图。根据目标寡糖离子的荷质比，在硫酸寡糖混合物中找到了4个目标寡糖(GalNAc)1(Fuc)1(SO4)n(n＝1-4)。根据这4个目标寡糖的液相色谱-质谱联用分析中的提取离子色谱图，计算出每个电荷的离子强度，比较各离子的含量。证明含有3个硫酸根的(GalNAc)1(Fuc)1(SO4)3的含量最高，是(GalNAc)1(Fuc)1(SO4)2的2倍。(GalNAc)1(Fuc)1(SO4)4和(GalNAc)1(Fuc)1(SO4)1最少。图6为北极刺参硫酸寡糖的液相色谱-质谱联用分析的总离子流图，图7是15个目标寡糖在北极刺参中的质谱图，图8为北极刺参中检测到的目标硫酸寡糖(GalNAc)1(Fuc)1(SO4)n(n＝1-4)在液相色谱-质谱联用分析中的提取离子色谱图。其糖链组成、母离子、电荷数和离子强度如表3所示。
表3.北极刺参中(GalNAc)1(Fuc)1(SO4)n(n＝1-4)的糖链组成、母离子、电荷数和离子强度。
2、北极刺参的己糖硫酸寡糖的鉴定
经海参粗糖提取、降解和液相色谱-质谱联用分析，根据目标寡糖离子的荷质比，在硫酸寡糖混合物中找到了15个己糖硫酸寡糖。根据这4个目标寡糖的液相色谱-质谱联用分析中的提取离子色谱图，计算出每个电荷的离子强度，比较各离子的含量。其中(GalNAc)1(Hex)1(SO4)3、(GalNAc)1(Hex)1(SO4)2、(GalNAc)1(GlcA)1(Hex)1(SO4)4、(GalNAc)2(GlcA)1(Hex)1(SO4)5、(GalNAc)3(GlcA)1(Hex)1(SO4)4的含量最高。其中图8是(GalNAc)1(Fuc)1(SO4)n(n＝1-4)在液相色谱-质谱联用分析的提取质谱图，图9是(GalNAc)1(Hex)1(SO4)n(n＝2-3)在液相色谱-质谱联用分析的提取质谱图；图10是(GalNAc)1(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝1-4)在液相色谱-质谱联用分析的提取质谱图，图11是GalNAc)2(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝2-6)液相色谱-质谱联用分析的提取质谱图；图12是(GalNAc)3(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝4-7)在液相色谱-质谱联用分析的提取质谱图；其离子的糖链组成、荷质比、电荷数和离子强度见表4所示。
表4北极刺参中检测到的己糖硫酸寡糖在质谱中的离子荷质比、电荷数和离子强度。

Claims (7)

1.一种用于检测北极刺参的硫酸寡糖组合，其特征在于，所述的寡糖组合，其中第一组合为(GalNAc)1(Fuc)1(SO4)n，其中n＝1-4；第二组合为(GalNAc)1(Hex)1(SO4)n(n＝2-3)、(GalNAc)1(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝1-4)、(GalNAc)2(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝4-6)、(GalNAc)3(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝4-7)、(GalNAc)3(GlcA)1(Hex)1(SO4)n(n＝5-7)。
2.权利要求1所述的硫酸寡糖组合在检测北极刺参中的应用。
3.一种检测北极刺参的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
1)对待侧样本进行液相色谱-质谱前处理，获得待测硫酸寡糖溶液；
2)通过液相色谱-质谱联用法检验待测样本的硫酸寡糖成分，分析样本中的北极刺参成分，检测是否出现权利要求1所述的硫酸寡糖组合。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的液相色谱-质谱前处理包括如下的步骤：
1)固体干海参粉碎成粉末状态，加入0.1mol/L的磷酸缓冲溶液(pH8.0，15mmol/LEDTA-Na2、5mmol/L半胱氨酸)、碱性蛋白酶和胰蛋白酶，50℃酶解24h；将反应物沸水浴5min灭酶活后离心，取上清液；
2)取氯化十六烷基吡啶水溶液加入上述上清液中，室温静置，离心，收集沉淀；
3)将步骤2)收集的沉淀用添加了NaCl的乙醇溶液溶解后，加入95％乙醇，4℃下放置24h，离心后，收集沉淀，完成海参硫酸多糖的提取；
4)将海参硫酸多糖溶于0.5mol/LNa2HPO4溶液中，加入醋酸铜溶液和H2O2，60℃水浴降解3h；然后用NaOH调节溶液至pH9.0，离心后，取上清液；
5)采用1kDa的滤膜4000×g超滤10min，收集上层的滤液，完成海参硫酸寡糖溶液的制备。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的添加了NaCl的乙醇溶液，是添加了终浓度为3mol/LNaCl的86％乙醇溶液。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的液相色谱-质谱联用法检测，其色谱条件如下：色谱柱：LunaHILIC柱，流动相A：5mM醋酸铵水溶液，流动相B：乙腈，进样量为4μL，流动相A的洗脱梯度是10％-35％，0-40min洗脱，流速150μL/min；质谱的条件：负离子模式，电喷雾源，质量分析器为Orbitrap-傅里叶转换，负离子电力模式，毛细管电压-40V，套管透镜补偿电压-50V，毛细管温度设为275°层流量为30，辅助气体的流量6，扫描分子量300-1000u，Xcalibur质谱软件中处理。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的分析样本中的北极海参成分，是将待测样品的质谱结果对比上述组合的寡糖的质谱谱图，同时出现权利要求1所述的寡糖组合的各条特异性的硫酸寡糖的质谱检测谱图时，判断该组织样品为北极刺参样本。
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