CN104730009A - 一种茶树花中多糖含量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种茶树花中多糖含量的检测方法，具体为：茶树花样品的预处理；茶树花中多糖提取与精制，得到精制的茶树花多糖制品；采用分光光度法测定精制的茶树花多糖制品中多糖含量，得到茶树花样品中多糖检测浓度和多糖含量；采用离子色谱法检测茶树花粗多糖水解液中茶树花粗多糖中多糖含量；根据利用分光光度法得到的茶树花粗多糖中多糖含量和利用离子色谱法测出的单糖组分含量，确定两者的换算因子；分光光度法所测的多糖检测浓度乘以换算因子得到最终茶树花多糖含量。本发明的方法可以获得准确的测定茶树花中的多糖含量，准确性与色谱法测定无显著差异，但是，本发明的方法简单，容易，成本低，而且容易推广。

Description

一种茶树花中多糖含量的检测方法

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体涉及一种茶树花中多糖含量的检测方法。

背景技术

茶树花含有丰富的内含物质，其主要化学成分与茶叶大体相同。但是其活性成分的比例却与茶叶相差甚远，其中茶树花含有总糖(≥35％)要高于茶叶，尤其是其中的多糖要高于茶叶，而咖啡因(≤1％)却低于茶叶。但是近年来关于茶树原料多糖的检测方法一直没有达到统一。茶树原料多糖大多沿用其他多糖的检测方法，有少量科学工作者在茶叶中多糖的检测方法研究上做了一定工作，如利用色谱方法(HPLC、GC)直接分析多糖中单糖组分，用间接方法(苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法)分析多糖含量；前者由于前处理工作过于复杂(如HPLC需要样品衍生化、GC需预先转化成易挥发性、热稳定的衍生物)，尤其是分析得到的仅是单糖组分或还原糖情况等，不利于被广泛应用。后者虽然比较简单，但是由于难于找到一种合适的对照品，加上准确度很难保证，无法成为茶树原料多糖的有效检测方法，尤其是对于茶树花中的多糖检测方法研究的没有大的突破。

发明内容

本发明的目的是提供一种茶树花中多糖含量的检测方法，本发明基于茶源多糖检测的现有技术，比较离子色谱法和分光光度法对茶源多糖含量的分析，结果表明，无论采用哪种单糖(如阿拉伯糖、核糖、木糖、甘露糖、岩藻糖、葡萄糖、半乳糖)作为分光光度法检测的对照品，与离子色谱分析的结果都存在较大差异。本发明将两种检测技术结合，探索一种改良换算因子蒽酮-硫酸分光光度检测茶树花多糖的新方法，利用分光光度法检测的便捷、简单、设备成本低的优点，又避免离子色谱法检测的前期处理复杂、设备成本高、不利推广的缺点，该方法同样适用于茶树其他组织中多糖的分析，以及其他途径天然产物源中多糖含量检测分析。

本发明所采用的技术方案是，一种茶树花中多糖含量的检测方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1、茶树花样品的预处理；

步骤2、茶树花中多糖提取与精制，得到精制的茶树花多糖制品；

步骤3、采用分光光度法测定精制的茶树花多糖制品中多糖含量，得到茶树花样品中多糖检测浓度c(mg/ml)和多糖含量c1(％)；

步骤4、采用离子色谱法检测茶树花粗多糖水解液中茶树花粗多糖中多糖含量c2(％)；

步骤5、根据利用分光光度法得到的茶树花粗多糖中多糖含量c1(％)和利用离子色谱法测出的茶树花粗多糖中多糖含量c2(％)，确定两者的换算因子f；

步骤6、分光光度法所测的多糖检测浓度乘以换算因子f得到最终茶树花多糖含量(％)。

本发明的特点还在于，

步骤1中茶树花样品的预处理具体按照以下步骤实施：

步骤1.1、将茶树花样品，置于80℃环境下的电热鼓风烘箱中，干燥3h后用高速粉碎机进行粉碎，过20目筛后，备用；

步骤1.2、称取过20目筛后的干燥茶树花粉末，使用80％乙醇，90℃-100℃条件下水浴回流提取0.5h-1.5h，趁热抽滤，其中，干燥茶树花粉末与乙醇的质量体积比(g/ml)为1﹕30-1:50；滤渣中加入80％热乙醇，超声振荡1min，其中，滤渣与乙醇的质量体积比(g/ml)为1﹕30-1:50，抽滤，重复一次，滤渣45℃低温干燥备用。

步骤2中茶树花中多糖提取与精制具体按照以下步骤实施：称取经80％乙醇预处理后干燥茶树花，加入蒸馏水，在60℃下，超声辅助提取30min，其中，经80％乙醇预处理后干燥茶树花与蒸馏水的质量体积比(g/ml)为1:40-1:60；将提取液用布氏漏斗减压抽滤后，滤液减压浓缩至100mL，用300mL95％乙醇沉淀，边加边搅拌，放于4℃低温条件下醇沉24h，10000r/min，冷冻离心，沉淀用无水乙醇洗涤3次，于冷冻干燥器中干燥至恒重，即得精制的茶树花多糖制品，称重，备用。

步骤3中采用分光光度法测定茶树花粗多糖中多糖含量具体按照以下步骤实施：

步骤3.1、配制蒽酮-硫酸溶液，称取0.20g蒽酮，加入100mL 75％浓硫酸，溶解混匀，备用；

步骤3.2、葡萄糖标准曲线制备，称取200mg烘至恒重的葡萄糖，蒸馏水定容至100mL为母液，吸取10mL母液定容至100mL为工作液，摇匀；准确吸取工作液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于10mL具塞试管，用水定容至1mL，再加入蒽酮-硫酸溶液4mL，摇匀，冰浴冷却后，沸水浴煮沸10min后，再冰浴冷却10min，在620nm波长下检测吸光度；葡萄糖标准样品浓度及对应吸光度绘制标准曲线的线性关系为y＝9.5686x-0.0058，相关性r＝0.9995，线性范围：0mg/mL～0.2mg/mL；

步骤3.3、半乳糖标准曲线制备，称取200mg烘至恒重的半乳糖，蒸馏水定容至100mL为母液，吸取20mL母液定容至100mL为工作液，摇匀；按葡萄糖标准曲线制作法制做半乳糖标准曲线，半乳糖标准样品浓度及对应吸光度绘制标准曲线的线性关系为y＝5.0521x+0.0046，相关性r＝0.9981，线性范围：0mg/mL～0.2mg/mL，x为检测浓度(mg/mL)，y为吸光度A；

步骤3.4、多糖含量测定，精密称取精制茶树花多糖0.0500g，用蒸馏水溶解，于50mL容量瓶中定容，按标准曲线制作方法，取1mL样液于10mL具塞试管中，加入蒽酮标准液4mL，摇匀，冰浴冷却后，沸水浴煮沸10min，再冰浴冷却10min，在620nm波长下检测吸光度，将其分别代入葡萄糖对照品标准曲线和半乳糖对照品标准曲线，分别计算出以葡萄糖和半乳糖为对照的茶树花多糖的检测浓度c(mg/ml)，并计算出精制茶树花多糖含量c1(％)。

步骤4中采用离子色谱法检测茶树花粗多糖水解液中茶树花粗多糖中多糖含量具体按照以下步骤实施：

步骤4.1、分别称取岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸11种对照品，将其配制成各个对照品浓度为10ug/mL的混合对照品，用离子色谱进行检测；

步骤4.2、茶树花多糖水解：称取应步骤2处理得到的精制的茶树花多糖制品51.9mg，加入4mL，2mol/L的三氟乙酸进行溶解后充入氮气封口，120℃水解6h，水解结束后，离心，取上清液，在40℃下，用氮吹仪吹干，用甲醇溶解吹赶残留的三氟乙酸，重复3次，最后定容至50mL，过0.45um微孔膜，进行离子色谱分析；

步骤4.3、离子色谱分析的条件为流速：1.0mL/min，进样量10uL，柱温30℃，安培积分检测，金电极，Dionex公司CarboPacPA10250mm×3mm，流动相：A：water；B：100mMNaOH；C：100mMNaOH/0.5MNaAc；梯度洗脱：0～20min：70％A，30％B；21～25min：90％B→80％B，10％C→20％C；25～35min：80％B→50％B，20％C→50％C；36～46min：70％A，30％B；根据茶树花多糖水解后单糖溶液离子色谱图的保留时间和峰面积，计算出上述11个单糖的总质量占精制的茶树花多糖制品的质量的百分比，即为茶树花多糖含量c2(％)。

步骤5中根据利用分光光度法得到的茶树花粗多糖中多糖含量和利用离子色谱法测出的茶树花多糖含量，确定两者的换算因子f具体为：依次按照分光光度法和离子色谱法检测其多糖含量，得到换算因子其中c₁是分光光度法检测精制茶多糖中多糖含量，c₂离子色谱法检测精制茶多糖中多糖含量。

步骤6中分光光度法检测精制茶多糖的检测浓度乘以换算因子求出最终茶树花多糖含量，茶树花多糖含量具体为：

其中，c为分光光度法检测所得浓度(mg/mL)；

f为换算因子；

M为茶树花重量(g)；

m为茶树花干物质的百分含量(％)；M*m为实施例1中得到的干燥茶树花粉末的质量；

v为分光光度法检测所用的体积。

本发明的有益效果是：利用分光光度法检测的便捷、简单、设备成本低的优点，又能避免离子色谱法检测的前期处理复杂、设备成本高、不利推广的缺点，该方法同样适用于茶树其他组织中多糖的分析，以及其他途径天然产物源中多糖含量检测分析。通过本方法可以正确的得出茶树花中多糖含量，避免因为检测液本身颜色而引起的误差，同时在得出正确含量的情况下简化检测方法。

附图说明

图1是葡萄糖对照品标准曲线；

图2是半乳糖对照品标准曲线；

图3是11种单糖对照品混合后离子色谱图，其中，1为岩藻糖，2为鼠李糖，3为阿拉伯糖，4为木糖，5为半乳糖，6为葡萄糖，7为甘露糖，8为果糖，9为核糖，10为半乳糖醛酸，11为葡萄糖醛酸；

图4是茶树花多糖水解后单糖溶液离子色谱检测，1为岩藻糖，2为鼠李糖，3为阿拉伯糖，4为木糖，5为半乳糖，6为葡萄糖，7为甘露糖，8为果糖，9为核糖，10为半乳糖醛酸，11为葡萄糖醛酸。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

以下的材料和试剂为本发明一些具体方式中所使用，在此一并列举。

1.材料和仪器：

1.1主要药材：干燥茶树花(1#茶树花，产于安徽芜湖，安徽省宣城市中林绿源茶树花有限公司；2#茶树花产于四川泸州，雨露茶花籽油有限公司；3#茶树花，产于浙江省开化县，浙江开化益农芳茶业有限公司，以花瓣张开度达到70﹪为宜)。

1.1.1主要试剂：乙醇为食用级；蒽酮、硫酸、三氟乙酸均为分析纯；氢氧化钠、醋酸钠均为优级纯，水为超纯水；岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸等11种标准对照品(中国药品生物制品检定所)。

1.1.2主要仪器：紫外分光光度计(T6北京普析通用有限公司)；分析天平(SPS202F梅特勒-托利多称重设备系统有限公司)；超声波清洗器(KQ-500DA昆山市超声仪器有限公司)；电热鼓风烘箱(BPG-9070A上海一恒仪器有限公司)；旋转蒸发仪(RE-52AA上海亚荣生化仪器厂)；真空泵(SHB-III郑州长城科工贸有限公司)；高速离心机(DL-5型上海安亭科学仪器厂)；高速粉碎机(WK-200B青州市精诚医药装备制造有限公司)；数显恒温水浴锅(HH-S8金坛市华特实验仪器有限公司)；氮吹仪(MD200-2上海甄明科学仪器有限公司)；离子色谱仪(ICS3000中国戴安仪器有限公司)。

实施例1茶树花样品的预处和精致处理获得粗糖样品

2.茶树花样品的预处和精致处理获得粗糖样品

2.1茶树花样品的预处理

将1#茶树花样品，置于80℃环境下的电热鼓风烘箱中，干燥3h后用高速粉碎机进行粉碎，过20目筛后，备用。

称取过20目筛后的干燥茶树花粉末1000.00g，使用80％乙醇以1﹕40料液比，95℃条件下水浴回流提取1h，趁热抽滤；滤渣中加入80％热乙醇500mL，超声振荡1min，抽滤，重复一次，以除去滤渣表面吸附的杂糖，滤渣45℃低温干燥备用。

2.2茶树花中多糖提取与精制

称取经80％乙醇预处理后干燥茶树花10.00g于1000mL烧杯中，以1：50料液比加入500mL蒸馏水，在60℃下，超声辅助提取30min，利用超声波对细胞壁的破碎作用，促进胞内多糖的溶出。将提取液用布氏漏斗减压抽滤后，滤液减压浓缩至100mL，用300mL95％乙醇沉淀(边加边搅拌)，放于4℃低温条件下醇沉24h，10000r/min，冷冻离心，沉淀用无水乙醇洗涤3次，于冷冻干燥器中干燥至恒重，即得精制的茶树花多糖制品，称重，备用。

实施例2茶树花粗多糖(精制的茶树花多糖制品)中多糖含量的分析-蒽酮-硫酸法

3.茶树花粗多糖中多糖含量的分析-蒽酮-硫酸法

3.1.蒽酮-硫酸溶液配制：称取0.20g蒽酮，加入100mL 75％浓硫酸，溶解混匀，备用(现配现用)。

3.2.葡萄糖标准曲线制备

称取200mg烘至恒重的葡萄糖，蒸馏水定容至100mL为母液，吸取10mL母液定容至100mL为工作液，摇匀。准确吸取工作液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于10mL具塞试管，用水定容至1mL，再加入蒽酮-硫酸溶液4mL，摇匀，冰浴冷却后，沸水浴煮沸10min后，再冰浴冷却10min，在620nm波长下检测吸光度。同一浓度的标准溶液分别重复测定3次，取其平均值。标准曲线图1所示。根据葡萄糖标准样品浓度及对应吸光度绘制标准曲线如图1，其线性关系为y＝9.5686x-0.0058，相关性r＝0.9995，线性范围：0mg/mL～0.2mg/mL。

3.3.半乳糖标准曲线制备：

称取200mg烘至恒重的半乳糖，蒸馏水定容至100mL为母液，吸取20mL母液定容至100mL为工作液，摇匀。按葡萄糖标准曲线制作法制做半乳糖标准曲线。同一浓度的标准溶液分别重复测定3次，取其平均值。标准曲线图2所示。

根据半乳糖标准样品浓度及对应吸光度绘制标准曲线，如图2，其线性关系为y＝5.0521x+0.0046，相关性r＝0.9981，线性范围：0mg/mL～0.2mg/mL。

3.4.茶树花粗多糖中多糖含量的测定：

多糖含量测定：精密称取实施例1中精制茶树花多糖0.0500g，用蒸馏水溶解，于50mL容量瓶中定容，按标准曲线制作方法，取1mL样液于10mL具塞试管中，加入蒽酮标准液4mL，摇匀，冰浴冷却后，沸水浴煮沸10min，再冰浴冷却10min，在620nm波长下检测吸光度，将其分别代入工作曲线方程(葡萄糖对照品标准曲线和半乳糖对照品标准曲线)，分别计算出以葡萄糖和半乳糖为对照的茶树花多糖的含量。

其吸光度为A＝0.372，分别带入葡萄糖和半乳糖标准曲线算出其浓度。以葡萄糖为对照品，得茶树花多糖检测浓度为0.079mg/ml，0.0500g样品中多糖质量为0.079mg/ml*50ml＝0.00395g，茶树花多糖的含量为7.9％；以半乳糖为对照品，得茶多糖检测浓度为0.125mg/ml，0.0500g样品中多糖含量为0.00625毫克，茶树花多糖的含量为12.5％。

实施例3-离子色谱法检测茶树花粗多糖中多糖含量的测定

4.离子色谱法检测茶树花粗多糖中多糖含量的测定

4.1.标准样品检测液制备：分别称取岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸等11种对照品，将其配制成各个对照品浓度为10ug/mL的混合对照品，用离子色谱进行检测。

茶树花多糖水解：称取51.9mg粗多糖，加入4mL，2mol/L的三氟乙酸进行溶解后充入氮气封口，120℃水解6h，水解结束后，离心，取上清液，在40℃下，用氮吹仪吹干，用甲醇溶解吹赶残留的三氟乙酸，重复3次，最后定容至50mL，过0.45um微孔膜，进行离子色谱分析。

4.2.流动性相选择

在流速为0.8ml/min，单独以NaOH为淋洗液，溶液的浓度分别为10、30、50、70、100mmol/L分离11中单糖混标，结果显示30mmol/L的洗脱液分离效果最好，但醛酸类单糖未被分离开，因此在最后分离过程中加入100mMNaOH/0.5MNaAc淋洗液，先以30mmol/L NaOH为洗脱液，分离葡萄糖等不含醛酸单糖，然后再以NaOH和NaOH/NaAc混合液为流动相，采用梯度洗脱，醛酸类单糖能很好的分离出来，最后确定流动相为：0～20min：70％A，30％B；21～25min：90％B→80％B，10％C→20％C；25～35min：80％B→50％B，20％C→50％C；36～46min：70％A，30％B。

4.3.流速的选择

在确定洗脱流动性后，分别以0.6、0.8、1.0、1.2ml/min的流速进行洗脱，结果显示在0.6、0.8、1.0ml/min条件下，所有组分都能很好的分离，出峰时间随着流速的增大而缩短，1.2ml/min流速下，葡萄糖和甘露糖分离效果不好，因此选择1.0ml/min为洗脱流速。

4.4.色谱柱温度的选择

100.0mmol/L NaOH和100mMNaOH/0.5MNaAc溶液作流动相，梯度洗脱下，分别在25、30、35、40℃的柱温条件下考察糖混合溶液的分离情况。当色谱柱温度超过40℃时，半乳糖和葡萄糖的分离变差；色谱柱温度为25℃时，各色谱峰的峰宽变大，灵敏度有一定程度的损失，果糖尤为明显。11种单糖在25～35℃之间分离效果好，峰形也较好，可以满足分析要求，因此，选择色谱柱温为30℃。

4.5.最终确定的离子色谱检测条件：

流速：1.0mL/min，进样量10uL，柱温30℃，安培积分检测，金电极，Dionex公司CarboPacPA10(250mm×3mm)，流动相：A：water；B：100mMNaOH；C：100mMNaOH/0.5MNaAc。梯度洗脱：0～20min：70％A，30％B；21～25min：90％B→80％B，10％C→20％C；25～35min：80％B→50％B，20％C→50％C；36～46min：70％A，30％B。

4.6.结果：

茶树花多糖含量：

称取干燥茶多糖51.9毫克经三氟乙酸水解后，进行离子色谱检测，其检测结果图1和表1，将表1中的各个单糖的含量相加的总和乘以定容后的体积50ml，通过计算得出分离出的所有单糖组分总和(0.0171g)，占粗多糖样品中的32.95％。结果显示茶树花多糖由岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸聚合而成，其中以半乳糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸为主，占摩尔百分比的75％以上，其中半乳糖最多，达到34.43％，其次为木糖，达到22.78％。

表1茶多糖水解后单糖组分之间的摩尔比

5.换算因子的测定

通过实施例2-3的测定，不同的方法测得最终多糖含量占粗糖的百分比也不一样。例如，按照蒽酮-硫酸法，以照葡萄糖标准计算，测得的多糖占整个粗糖的百分比为7.9％；以半乳糖为标准品，测得的多糖占整个粗糖的百分比为12.5％，而离子色谱法检测精制茶多糖中多糖含量，多糖占整个粗糖的百分比含量为34.20％。从蒽酮-硫酸法和离子色谱法检测同一精制茶树花多糖，得到不同含量数值来看，以葡萄糖或半乳糖等单糖作为标准对照品，用蒽酮-硫酸法来检测茶树花多糖含量，确实存在很大误差，需要一个换算因子修正。

采用精密称取精制茶多糖0.0519g和0.050g，依次按照蒽酮-硫酸法和离子色谱法检测其多糖含量c₁、c₂。换算因子其中c₁是蒽酮-硫酸法检测精制茶多糖中多糖含量，c₂离子色谱法检测精制茶多糖中多糖含量。

葡萄糖为标准品的换算因子： $f=\frac{c2}{c1}=32.95\%/7.9\%=4.17;$

半乳糖为标准品的换算因子： $f=\frac{c2}{c1}=32.95\%/12.5\%=2.64.$

5.1.改良换算因子蒽酮-硫酸法

通过换算因子换算后，采用蒽酮-硫酸法测定茶树花中茶多糖含量为：

式中：c为分光光度法检测所得浓度(mg/mL)；

f为换算因子，其中，当采用葡萄糖为标准品时，换算因子当采用半乳糖为标准品时，换算因子 $f\frac{c2}{c1}=32.95\%/12.5\%=2.64;$

M为茶树花重量(g)；

m为茶树花干物质的百分含量(％)；M*m为实施例1中得到的干燥茶树花粉末的质量；

v为分光光度法检测所用的体积(mL)。

5.2.改良换算因子蒽酮-硫酸法

精密吸取供试液(0.0500g溶于50ml的溶液)1mL于具塞刻度试管中，按照2.2.3.1检测方法测定吸光度(A)，按改良换算因子蒽酮-硫酸法测定茶多糖含量，其浓度为0.35mg/ml，纯度为34.17％。

6.改良换算因子蒽酮-硫酸法验证

稳定性试验：称取干燥多糖样品50.0mg两份，分别按“实施例2”和“实施例3”方法进行处理和测量，分别于0、2、4、8、18、20、24h进行蒽酮-硫酸法和离子色谱法检测，观察其稳定性。

稳定性试验：通过稳定性试验，计算得葡萄糖的RSD为1.7％，半乳糖得RSD为1.0％，表明待测物在24h内稳定。

精密度试验：称取干燥多糖样品50.0mg两份，分别按“实施例2”和“实施例3”分别进行蒽酮硫酸法连续检测6次和离子色谱法连续进样6次，计算葡萄糖和半乳糖质量RSD值。

精密度试验：连续进样检测6次，计算葡萄糖和半乳糖的RSD值。得葡萄糖质量的RSD为1.4％，半乳糖质量的RSD为2.0％，表明仪器的精密度良好。

重复性试验：平行称取干燥多糖样品50.0mg 12份，分成两组，分别按实施例2”和“实施例3”方法进行处理，进行蒽酮-硫酸法和离子色谱法检测，计算葡萄糖和半乳糖质量RSD值。

重复性试验：通过重复试验，计算葡萄糖和半乳糖质量RSD值。得葡萄糖质量的RSD为3.2％，葡萄糖质量的RSD为2.5％，表明该水解方法和测定方法都具有良好的重复性。

加样回收率：平行取干燥多糖样品6份(每份25.0mg)，随机平均分成2组，一组分别加入待测样品的80％，100％，120％的葡萄糖标样，另一组分别加入待测样品的80％，100％，120％的半乳糖标样，混合均匀后，分别按照“实施例2”和“实施例3”的方法进行处理，分别计算葡萄糖、半乳糖的加样回收率。

加样回收率：采用加标样，分别计算葡萄糖、半乳糖的加样回收率。见表2和表3，结果表明，葡萄糖的加样回收率在91.3％～104.1％之间；半乳糖的加样回收率在95.9％～104.4％之间，该方法准确度较高，可很好地应用于日常分析和检测。

表2葡萄糖加样回收率测定结果(n＝3)

表3半乳糖加样回收率测定结果(n＝3)

借助离子色谱分析来测定换算因子，比博强(博强，谢明勇，聂少平等.茶叶中多糖含量的测定[J].食品科学，2001，11(22)：69-73)等研究报道的利用多次透析纯化技术来测定换算因子要简化稳定及准确得多，4.494要比4.268要高。博强等(博强，谢明勇，聂少平等.茶叶中多糖含量的测定[J].食品科学，2001，11(22)：69-73)研究报道的换算因子测定方法程序复杂，整个操作需要72小时的透析，耗时太长，重现性差，同时测定值还不准确，不便于推广应用。

若有离子色谱仪可以直接借助其来检测茶树花中多糖含量，没有离子色谱仪，可以利用本发明中的换算因子f(以葡萄糖为标准对照品，可以设定为4.2)，用蒽酮硫酸法测定吸光度，然后用该文章报道的换算因子求出更接近的正确值。

7.不同产地茶树花多糖含量

称取一定量的1#、2#、3#茶树花样品各40g，分别加入600毫升80％的乙醇回流1h，趁热抽滤，滤渣中加入80％热乙醇100mL，超声振荡1min，抽滤，重复一次，以除去滤渣表面吸附的杂糖。在滤渣中加入600mL蒸馏水，100℃水浴浸提1h，趁热过滤，重复一次，合并滤液，浓缩、离心(6000r/min，10min)，上清液至于250ml容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀备用。采用蒽酮硫酸法并对其检测，通过换算因子计算其含量(公式2)。

7.1.不同产地茶树花多糖含量

采用蒽酮-硫酸法对不同产地的三种茶树花进行茶多糖检测，然后通过换算因子法换算后结果如表4。其中，四川产地的茶树花样品所含的茶多糖含量最高，为26.02％，可见不同产地的茶树花所含茶多糖成分有所不同。

表4不同产地茶树花中多糖含量测定结果

同样，按照实施例3中的方法，采用色谱法度不同产地的茶花中的多糖的含量进行测定，获得的测量结果与采用蒽酮硫酸法并对其检测，通过换算因子计算其含量(公式2)的结果一样，其中，色谱法测定结果如下：1#样品为18.65％；2#样品为25.98％；3#样品为20.48％。这表明，本发明的方法以及公式可以获得准确的测定茶树花中的多糖含量，准确性与色谱法测定无显著差异，但是，本发明的方法简单，容易，成本低，而且容易推广。

本文主要研究将离子色谱法与蒽酮硫酸法两种检测技术进行联合检测茶树花中多糖含量的一种新方法。先用分光光度法测出溶液中茶多糖含量，同时利用离子色谱法测出其水解液中单糖组分含量，确定其相互之间的换算因子，通过分光光度法所测浓度乘以换算因子求出最终茶树花多糖含量。以葡萄糖为标准样品的换算因子为4.17，半乳糖为标准样品的换算因子为2.64。1#茶树花茶多糖含量为18.43％，2#茶树花茶多糖含量为24.17％，3#茶树花茶多糖含量为19.15％；通过比较四川产地的茶树花中茶多糖含量最高。

8.讨论

(1)本实验多糖含量测定的原理是先用80％乙醇回流提取以除去单糖、双糖、低聚糖、甙类及醇溶性蛋白质等干扰成分，从而不必用其他方式去除杂质，然后用水提取其中所含的可溶性多糖，其结果比直接提取准确性较高。

(2)多糖是有多种单糖组合合成，同时通过离子色谱法检测发现，不同的多糖其组成的单糖成分比例各不相同，因此我们平常单用葡萄糖做为对照品来检测多糖提取液中多糖含量，往往会有所偏小，不能全部代替整个多糖含量，本实验通过结合蒽酮-硫酸法和离子色谱法，换算出转化因子，将蒽酮-硫酸法检测结果与换算因子相结合求出真实值。

(3)不同组织中的多糖组成、结构、含量会有所不同，因此，换算因子也会有所不同，在实际测定茶树其余组织中，需要对换算因子进行适当的调整。

Claims (7)

1.一种茶树花中多糖含量的检测方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：

步骤1、茶树花样品的预处理；

步骤2、茶树花中多糖提取与精制，得到精制的茶树花多糖制品；

步骤3、采用分光光度法测定精制的茶树花多糖制品中多糖含量，得到茶树花样品中多糖检测浓度c(mg/ml)和多糖含量c1(％)；

步骤4、采用离子色谱法检测茶树花粗多糖水解液中茶树花粗多糖中多糖含量c2(％)；

步骤5、根据利用分光光度法得到的茶树花粗多糖中多糖含量c1(％)和利用离子色谱法测出的茶树花粗多糖中多糖含量c2(％)，确定两者的换算因子f；

步骤6、分光光度法检测精制茶多糖的检测浓度乘以换算因子f得到最终茶树花多糖含量(％)。

2.根据权利要求1所述的茶树花中多糖含量的检测方法，其特征在于，所述步骤1中茶树花样品的预处理具体按照以下步骤实施：

步骤1.1、将茶树花样品，置于80℃环境下的电热鼓风烘箱中，干燥3h后用高速粉碎机进行粉碎，过20目筛后，备用；

步骤1.2、称取过20目筛后的干燥茶树花粉末，使用80％乙醇，90℃-100℃条件下水浴回流提取0.5h-1.5h，趁热抽滤，其中，干燥茶树花粉末与乙醇的质量体积比(g/ml)为1﹕30-1:50；滤渣中加入80％热乙醇，超声振荡1min，其中，滤渣与乙醇的质量体积比(g/ml)为1﹕30-1:50，抽滤，重复一次，滤渣45℃低温干燥备用。

3.根据权利要求2所述的茶树花中多糖含量的检测方法，其特征在于，所述步骤2中茶树花中多糖提取与精制具体按照以下步骤实施：称取经80％乙醇预处理后干燥茶树花，加入蒸馏水，在60℃下，超声辅助提取30min，其中，经80％乙醇预处理后干燥茶树花与蒸馏水的质量体积比(g/ml)为1:40-1:60；将提取液用布氏漏斗减压抽滤后，滤液减压浓缩至100mL，用300mL95％乙醇沉淀，边加边搅拌，放于4℃低温条件下醇沉24h，10000r/min，冷冻离心，沉淀用无水乙醇洗涤3次，于冷冻干燥器中干燥至恒重，即得精制的茶树花多糖制品，称重，备用。

4.根据权利要求3所述的茶树花中多糖含量的检测方法，其特征在于，所述步骤3中采用分光光度法测定茶树花粗多糖中多糖含量具体按照以下步骤实施：

步骤3.1、配制蒽酮-硫酸溶液，称取0.20g蒽酮，加入100mL 75％浓硫酸，溶解混匀，备用；

步骤3.2、葡萄糖标准曲线制备，称取200mg烘至恒重的葡萄糖，蒸馏水定容至100mL为母液，吸取10mL母液定容至100mL为工作液，摇匀；准确吸取工作液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于10mL具塞试管，用水定容至1mL，再加入蒽酮-硫酸溶液4mL，摇匀，冰浴冷却后，沸水浴煮沸10min后，再冰浴冷却10min，在620nm波长下检测吸光度；葡萄糖标准样品浓度及对应吸光度绘制标准曲线的线性关系为y＝9.5686x-0.0058，相关性r＝0.9995，线性范围：0mg/mL～0.2mg/mL；

步骤3.3、半乳糖标准曲线制备，称取200mg烘至恒重的半乳糖，蒸馏水定容至100mL为母液，吸取20mL母液定容至100mL为工作液，摇匀；按葡萄糖标准曲线制作法制做半乳糖标准曲线，半乳糖标准样品浓度及对应吸光度绘制标准曲线的线性关系为y＝5.0521x+0.0046，相关性r＝0.9981，线性范围：0mg/mL～0.2mg/mL，x为检测浓度(mg/mL)，y为吸光度A；

步骤3.4、多糖含量测定，精密称取精制茶树花多糖0.0500g，用蒸馏水溶解，于50mL容量瓶中定容，按标准曲线制作方法，取1mL样液于10mL具塞试管中，加入蒽酮标准液4mL，摇匀，冰浴冷却后，沸水浴煮沸10min，再冰浴冷却10min，在620nm波长下检测吸光度，将其分别代入葡萄糖对照品标准曲线和半乳糖对照品标准曲线，分别计算出以葡萄糖和半乳糖为对照的茶树花多糖的检测浓度c(mg/ml)，并计算出精制茶树花多糖含量c1(％)。

5.根据权利要求4所述的茶树花中多糖含量的检测方法，其特征在于，所述步骤4中采用离子色谱法检测茶树花粗多糖水解液中茶树花粗多糖中多糖含量具体按照以下步骤实施：

步骤4.1、分别称取岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸11种对照品，将其配制成各个对照品浓度为10ug/mL的混合对照品，用离子色谱进行检测；

步骤4.2、茶树花多糖水解：称取应步骤2处理得到的精制的茶树花多糖制品51.9mg，加入4mL，2mol/L的三氟乙酸进行溶解后充入氮气封口，120℃水解6h，水解结束后，离心，取上清液，在40℃下，用氮吹仪吹干，用甲醇溶解吹赶残留的三氟乙酸，重复3次，最后定容至50mL，过0.45um微孔膜，进行离子色谱分析；

步骤4.3、离子色谱分析的条件为流速：1.0mL/min，进样量10uL，柱温30℃，安培积分检测，金电极，Dionex公司CarboPacPA10250mm×3mm，流动相：A：water；B：100mMNaOH；C：100mMNaOH/0.5MNaAc；梯度洗脱：0～20min：70％A，30％B；21～25min：90％B→80％B，10％C→20％C；25～35min：80％B→50％B，20％C→50％C；36～46min：70％A，30％B；根据茶树花多糖水解后单糖溶液离子色谱图的保留时间和峰面积，计算出上述11个单糖的总质量占精制的茶树花多糖制品的质量的百分比，即为茶树花多糖含量c2(％)。

6.根据权利要求5所述的茶树花中多糖含量的检测方法，其特征在于，所述步骤5中根据利用分光光度法得到的茶树花粗多糖中多糖含量和利用离子色谱法测出的茶树花多糖含量，确定两者的换算因子f具体为：依次按照分光光度法和离子色谱法检测其多糖含量，得到换算因子其中c₁是分光光度法检测精制茶多糖中多糖含量，c₂离子色谱法检测精制茶多糖中多糖含量。

7.根据权利要求6所述的茶树花中多糖含量的检测方法，其特征在于，所述步骤6中分光光度法检测精制茶多糖的检测浓度乘以换算因子求出最终茶树花多糖含量，茶树花多糖含量具体为：

其中，c为分光光度法检测所得浓度(mg/mL)；

f为换算因子；

M为茶树花重量(g)；

m为茶树花干物质的百分含量(％)；M*m为实施例1中得到的干燥茶树花粉末的质量；

v为分光光度法检测所用的体积(mL)。