CN104133032A - 一种菊粉的高效液相检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种菊粉的高效液相检测方法，包括标准品和样品的准备、高效液相色谱检测：色谱条件：检测器：蒸发光散射检测器；色谱柱：waters XBridge Amide 5μm4.6×250mm Column；柱温：35℃；流速：1mL/min；进样量10～20μL；流动相：乙腈与水初始体积比为75：25，在0～35min之内，体积比等度梯度变化为50：50；将标准品溶液和酶解样品溶液及样品溶液分别进样；最后通过一系列公式进行计算和判断。本发明建立了国内首个关于菊粉全成分的高效液相色谱检测方法。

Description

一种菊粉的高效液相检测方法

技术领域

本发明属于检测分析技术领域，具体涉及菊粉的检测分析方法。

背景技术

菊粉为一类天然果聚糖，是聚合度从2～60的混合物，是除了淀粉外植物的另一种储藏性多糖。但是物理化学性质又与淀粉不同，它溶于温水，不呈碘反应。菊粉主要见于菊科植物，例如，菊苣的块根、菊芋的块茎中。

果聚糖是果糖单元通过β(2-1)链联接而成并以葡萄糖单元终止的碳水化合物。可被酸或菊粉酶水解主要生成D-果糖。通常商品化菊粉中果聚糖的平均聚合度为10-30。

菊粉是近十年来国内外市场上逐渐广泛使用的一种新型多功能天然食品配料、动物饲料配料、医药原料。具有控制血脂；降低血糖；与金属离子螯合促进矿物质的吸收；增殖肠道内双歧杆菌；防止便秘等功能。同时菊粉凝胶具有脂肪的空间结构和口感，可以替代脂肪；可以和卡拉胶、明胶等协同作用，减少胶体的使用量；可以和阿斯巴甜、安赛蜜等强力甜味剂使用，减少使用量，还可以掩盖其金属后味。2009年中华人民共和国卫生部批准菊粉为新资源食品。

目前国内菊粉相关国家标准还不健全，产品含量检测方法不明确，国内没有任何关于菊粉的国家、行业或地方现行的标准。没有任何现行的检测标准对菊粉分析工作带来很大的困难。菊粉中除了含有有效成分果聚糖之外，其他杂质为果糖、葡萄糖、蔗糖，这三种杂质的含量决定了菊粉的品质和价格，且杂质在菊粉生产工艺中是无法完全去除的，所以良好的菊粉含量的检测方法有急切的必要性。

菊粉起源于欧洲，所以最早的检测方法是1988年制糖统一分析方法国际委员会(ICUMSA)制定的关于菊粉的薄层色谱法。以目视法比较测定溶液产生的蓝色亮点与标准果聚糖产生的蓝色强度，来确定存在于测定溶液中果聚糖的量。该方法简单且易于操作。采用目视法测量无法定量，同时人为影响因素太大。

美国1999和1997年制定的AOAC999.03和AOAC997.08两种检测食品中果聚糖含量的方法。其中AOAC999.03的方法涵盖了食品中果聚糖含量为50-100％的范围，但是采用酶解方法和紫外吸收分光光度计相结合的方法，试剂盒为国外公司制作，成本高，难获得；AOAC997.08的方法采用酶法和离子色谱相结合的方法，但实施起来非常耗力。当六份菊粉或果聚糖含量为4％～40％的双盲样品被送往五个国家的几个合作机构进行检测时，只有三个实验室能够正确地按该方法进行测定，且测定结果也不理想[Prosky L，Hoebregs,H.Methods to Determine Food Inulin and Oligofructose.Journal of Nutrition,1999；129:1418s-1423s]。

美国USP机构2008年发布FCC《食品化学法典》第六版首次纳入菊粉的检测方法，主要采用酶法和高效液相色谱法，但是使用该方法公布的主要信息，如色谱柱、流动相和检测器后发现无法复检菊粉中蔗糖、葡萄糖、果糖含量。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种更加准确和有效的菊粉的高效液相检测方法。

为解决上述技术问题，本发明的思路如下：

由于现在市场中的菊粉除了真正的果聚糖产品之外，还有添加了淀粉和低聚异麦芽糖等价格低廉、品质较差的伪菊粉的现象，所以本发明方法的第一步，需要鉴别菊粉的真伪性：用菊粉内切和外切酶对菊粉进行水解，然后鉴别水解后单糖分子是否多为果糖。只有果糖分子占据果聚糖聚合物结构中分子数的一定比例才能称为果聚糖。由于果聚糖聚合物水解后形成的葡萄糖和果糖分子同为还原糖，因此选用技术稳定且较常用的高效液相色谱法。本发明方法的第二步：检验菊粉产品中的杂质果糖、葡萄糖、蔗糖含量。其中果糖、葡萄糖为还原糖，蔗糖和有效成分果聚糖为非还原性的糖类，所以无论菊粉总含量还是杂质含量的鉴别和定量方法不能用单纯的还原糖检测的方法。需要先区分杂质和果聚糖后，才能定量，所以选用高效液相色谱法。并且由于国际范围内没有果聚糖聚合度为2-60范围内的所有标准品，所以选用液相色谱法中的峰面积归一化法作为最后结果的统计方法。

具体的技术方案如下：

一种菊粉的高效液相检测方法，它包括如下步骤：

(1)标准品和样品的准备：

(1a)样品溶液的制备：

将液体样品或固体样品用水溶解，冷却至室温，过滤或离心，收集滤液或上清液作为样品溶液；

(1b)酶解样品溶液的制备：

取部分步骤(1a)制备得到的样品溶液，加入醋酸缓冲溶液，再加入菊粉外切酶，加热进行酶解，冷却至室温，过滤或离心，收集滤液或上清液作为酶解样品溶液；

(1c)标准品溶液的制备：

以果糖、葡萄糖、蔗糖为标准品，分别用水配成的水溶液；

(2)高效液相色谱检测：

色谱条件：检测器：蒸发光散射检测器；色谱柱：waters XBridge Amide 5μm4.6×250mm Column；柱温：35℃；流速：1mL/min；进样量10～20μL；流动相：乙腈与水初始体积比为75：25，在0～35min之内，体积比等度梯度变化为50：50；

将标准品溶液和酶解样品溶液及样品溶液分别进样；

(3)计算和判断：

(3a)酶解样品溶液

按式I计算酶解样品溶液中的果糖和葡萄糖的百分含量：

Xi＝(Cst×Asa)/(Ast×W)×100      I

其中：Xi＝样品中果糖或葡萄糖占干物质的百分含量；

Cst＝标准品溶液中果糖或葡萄糖的含量，mg/100mL；

Asa＝样品溶液中果糖或葡萄糖高效液相峰面积；

Ast＝标准品溶液果糖或葡萄糖高效液相峰面积；

W＝样品溶液中样品以干物质计算的含量，mg/100mL；

酶解样品溶液中，含有90％以上的果糖和10％以下的葡萄糖，则该样品为合格样品，即未人为添加杂质的菊粉样品。

(3b)样品溶液

按式II计算果糖、葡萄糖和蔗糖中的每个组分糖占干物质的百分含量：

Pi＝Asa/ΣAsa×100       II

其中：Pi＝样品中组分i占干物质的百分含量；

Asa＝样品中组分i的峰面积；

ΣAsa＝样品中所有成分峰面积的总和；

所述的组分i为果糖、葡萄糖和蔗糖中的任意一种；

按式III计算样品中菊粉的百分含量：

Inulin％＝(1-F-G-GF)×100      III

其中：Inulin％＝菊粉占干物质的百分含量；

F＝样品溶液中果糖占干物质的百分含量；

G＝样品溶液中葡萄糖占干物质的百分含量；

GF＝样品溶液中蔗糖占干物质的百分含量。

本发明所述的干物质：固体样品采用GB5009.3-2010食品中水分的测定方法，干物质wt％＝100wt％-水分wt％；液体样品采用阿贝折光仪测定，干物质wt％＝阿贝折光仪读数，或者参考GB5009.3-2010食品中水分的测定，用烘箱法直接除去水分计算干物质的重量。

步骤(1a)中，所述的水为二次蒸馏水或超纯水。

步骤(1a)中，将液体样品或固体样品用超纯水溶解，溶解温度为80-90℃，优选80℃；溶解至菊粉含量为20-40mg/mL。

步骤(1a)或(1b)中，所述的过滤为用0.45μm膜过滤；所述的离心为8000～15000r/min(优选12000r/min)离心5min以上。

步骤(1b)中，所述的醋酸缓冲溶液是由0.44mol醋酸钠和0.056mol醋酸混合配制成1L的水溶液。醋酸缓冲溶液的添加量为样品溶液体积的1-1.2倍，优选1倍。

步骤(1b)中，菊粉外切酶的添加量相对于样品溶液为15-20U/mL，优选15U/mL；酶解温度控制在55-60℃，优选60℃；酶解时间30-35min，优选30min。

菊粉外切酶的酶活定义为：1个单位(U)菊粉外切酶活是指在pH4.6、温度55℃-60℃条件下，每分钟释放蔗果三糖中的1微摩尔的还原糖。

步骤(1c)中，标准品溶液中，溶质的浓度为4-7mg/mL，优选5mg/mL。

本发明方法用于检测商品菊粉。更具体的说是用于检测菊芋或菊苣根经过热水提取、纯化除杂、浓缩或喷雾后制备得到的商品菊粉。

有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优势：

1.国内首个关于菊粉全成分的高效液相色谱检测方法。

2.与AOAC999.03和AOAC997.08相比，检测标准偏差较低，排除了AOAC999.03中使用蔗糖酶的专一性对菊粉检测含量偏低的影响，菊粉含量检测重现性和精密度提高。

3.与FCC相比，果糖、葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖分离度R≥1.5，更加准确的测量菊粉含量。

附图说明

图1为样品溶液高效液相色谱图。其中：1号峰为果糖、3号峰为蔗糖，菊粉样品溶液由于含有太少的游离葡萄糖，低于检出限，无法检出。

图2为标准品的高效液相色谱图。其中：1号峰为果糖、2号峰为葡萄糖、3号峰为蔗糖。

图3为酶解样品高效液相色谱图。其中：1号峰为果糖、2号峰为葡萄糖。

图4为美国FCC方法得到的标准品图谱。

图5为菊粉产品加入低聚异麦芽糖产品水解后液相图谱。其中：1号峰为果糖、2号峰为葡萄糖。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：

1仪器

高效液相色谱仪(waters2696)。

2试剂

水：二次蒸馏水或超纯水(过0.45μm水系微孔滤膜)。

乙腈：德国Merck HPLC乙腈(过0.45μm水系微孔滤膜)。

标准品：果糖(sigma-aldrich)、葡萄糖(sigma-aldrich)、蔗糖(sigma-aldrich)。

醋酸缓冲溶液：0.44mol醋酸钠和0.056mol醋酸配制成1L的水溶液。

3检测方法

一种菊粉的高效液相检测方法，它包括如下步骤：

(1)标准品和样品的准备：

(1a)样品溶液的制备：

将液体样品或固体样品用超纯水80℃，溶解至20-40mg/mL，使各种组分含量应在标准溶液线性范围内，冷却至室温，定容至100mL，摇匀后，0.45μm膜过滤或12000r/min离心5min，收集滤液或上清液作为样品溶液。

(1b)酶解样品溶液的制备：

取步骤(1a)制备得到的样品溶液10mL，加入醋酸缓冲溶液10mL，再加入菊粉外切酶150U，60℃水浴加热进行酶解30min，冷却至室温，定容至25mL，摇匀后，0.45μm膜过滤或12000r/min离心5min，收集滤液或上清液作为酶解样品溶液。

(1c)标准品溶液的制备：

以果糖、葡萄糖、蔗糖为标准品，分别用水配成的5mg/mL的标准品水溶液。

(2)高效液相色谱检测：

色谱条件：检测器：蒸发光散射检测器；色谱柱：waters XBridge Amide 5μm4.6×250mm Column；柱温：35℃；流速：1mL/min；进样量10μL；流动相：乙腈与水初始体积比为75：25，在0～35min之内，体积比等度梯度变化为50：50。

在测定前一天安上色谱柱，柱温为室温，接通蒸发光散射检测器电源，预热稳定。正式进样分析前，调节流速至1.0mL/min走基线，待基线走稳后即可进样。

将标准品溶液在0.1mg/mL～5mg/mL范围内配置5个不同浓度的标准液系列，分别进样后，以标准样品浓度对峰面积做标准曲线。线性关系R≥0.9990，否则需调整浓度范围。

将标准品溶液和酶解样品溶液及样品溶液分别进样；根据标准品的保留时间定性样品中各组分的色谱峰，根据样品的峰面积，以外标法和峰面积归一化法分别对样品进行糖分百分含量的计算。

(3)计算和判断：

(3a)酶解样品溶液

样品水解完全后，应当为果糖和葡萄糖，按式I计算酶解样品溶液中的果糖和葡萄糖的百分含量：

Xi＝(Cst×Asa)/(Ast×W)×100     I

其中：Xi＝样品中果糖或葡萄糖占干物质的百分含量；

Cst＝标准品溶液中果糖或葡萄糖的含量，mg/100mL；

Asa＝样品溶液中果糖或葡萄糖高效液相峰面积；

Ast＝标准品溶液果糖或葡萄糖高效液相峰面积；

W＝样品溶液中样品以干物质计算的含量，mg/100mL。

计算结果保留1位小数。

酶解样品溶液中，含有90％以上的果糖和10％以下的葡萄糖，则该样品为合格样品。

(3b)样品溶液

用峰面积归一化法计算各组分糖占干物质的百分含量，因为所有组分均能出峰，各组分是同系物，其矫正因子相同，按式II计算果糖、葡萄糖和蔗糖中的每个组分糖占干物质的百分含量：

Pi＝Asa/ΣAsa×100      II

其中：Pi＝样品中组分i占干物质的百分含量；

Asa＝样品中组分i的峰面积；

ΣAsa＝样品中所有成分峰面积的总和；

所述的组分i为果糖、葡萄糖和蔗糖中的任意一种；

计算结果保留1位小数。

按式III计算样品中菊粉的百分含量：

Inulin％＝(1-F-G-GF)×100     III

其中：Inulin％＝菊粉占干物质的百分含量；

F＝样品溶液中果糖占干物质的百分含量；

G＝样品溶液中葡萄糖占干物质的百分含量；

GF＝样品溶液中蔗糖占干物质的百分含量。

计算结果保留1位小数。

实施例2：

1.青海威德特种糖业有限公司批号为2013121617033的菊粉成品按照实施例1的方法进行检测，结果如图3所示：菊粉称量为1.00g，完全水解后，果糖含有97.29％，葡萄糖含有2.71％，证明菊粉产品没有添加如可溶性淀粉、低聚异麦芽糖等非果聚糖类物质，是合格的果聚糖产品。

如图1所示，菊粉含量中含有1.35％的游离果糖，含有7.24％的蔗糖，按照公式计算，菊粉含量为91.37％。

批号为2013121617033的菊粉，重复6次，为91.37％、91.41％、91.35％、91.26％、91.46％、91.23％，RSD＜1。根据AOAC997.08和AOAC999.03的测定方法，RSD值一般在2左右，证明本发明方法可以用来确定检测结果是比较准确的。同时将同一批样品送样至德国欧陆检测公司，采用AOAC997.08方法进行第三方检测，结果为91.3％，结果和专利方法差异不大。

2.菊粉成品添加50％低聚异麦芽糖后的成品采用实施例1的方法检测，结果如图5所示：混合品称量为1.00g，完全水解后，果糖含有46.70％，葡萄糖含有53.30％，证明产品中含有非果聚糖成分。成品液相图谱由于添加物质和菊粉化学分子量相同，结构相似，所以峰形相同。

实施例3：

1.线性和灵敏度

实验葡萄糖、果糖和蔗糖在专利方法下的线性，校准曲线表明在广泛浓度内(0.8,1.6,3.2和6.4mg/mL)峰区和浓度有线性关系(r≥0.99)。果糖、葡萄糖、蔗糖的检测极限分别为0.05，0.05，和0.06mg/mL(信噪比＞10)。

2.重复性

采用线性、灵敏度同一样品，分别在同一天进行了6个重复测定，并在不同的三天进行了三次测定。可重复性CV低于4.8％，日间CV低于5.0％，说明此方法具有良好的可重复性。

3.回收率

回收率通过测量菊粉外切酶水解后样品中的果糖浓度得出。样品中加入0.25mg/ml、1.25mg/ml、5mg/ml三个级别的标准浓度果糖。所有浓度的溶液回收率都大于99.97％。此方法显现了非常高的回收率。

实施例4：

选用美国FCC方法，和本专利方法同时进行果糖、葡萄糖、蔗糖三个标准品分离度实验，FCC方法分离度R＜1，本专利方法分离度R＞3。

FCC方法图谱见图4。

实施例5：

在确定本专利之前一共选用示差检测器；shodex KS-802和YMC-Pack Ployamine进行流动相等度洗脱，发现所有峰的分离度R＜1。

选用蒸发光检测器；YMC-Pack NH2、Agilent ZORBAX Carbohydrate、InertsustainNH2、Purospher STAR NH2等柱子；甲醇：水、乙腈：水系统进行梯度洗脱，发现各色谱柱方法均不如本专利方法中色谱柱的分离度效果理想。

Claims (7)

1.一种菊粉的高效液相检测方法，其特征在于，它包括如下步骤：

(1)标准品和样品的准备：

(1a)样品溶液的制备：

将液体样品或固体样品用水溶解，冷却至室温，过滤或离心，收集滤液或上清液作为样品溶液；

(1b)酶解样品溶液的制备：

取部分步骤(1a)制备得到的样品溶液，加入醋酸缓冲溶液，再加入菊粉外切酶，加热进行酶解，冷却至室温，过滤或离心，收集滤液或上清液作为酶解样品溶液；

(1c)标准品溶液的制备：

以果糖、葡萄糖、蔗糖为标准品，分别用水配成的水溶液；

(2)高效液相色谱检测：

色谱条件：检测器：蒸发光散射检测器；色谱柱：waters XBridge Amide 5μm4.6×250mm Column；柱温：35℃；流速：1mL/min；进样量10～20μL；流动相：乙腈与水初始体积比为75：25，在0～35min之内，体积比等度梯度变化为50：50；

将标准品溶液和酶解样品溶液及样品溶液分别进样；

(3)计算和判断：

(3a)酶解样品溶液

按式I计算酶解样品溶液中的果糖和葡萄糖的百分含量：

Xi＝(Cst×Asa)/(Ast×W)×100     I

其中：Xi＝样品中果糖或葡萄糖占干物质的百分含量；

Cst＝标准品溶液中果糖或葡萄糖的含量，mg/100mL；

Asa＝样品溶液中果糖或葡萄糖高效液相峰面积；

Ast＝标准品溶液果糖或葡萄糖高效液相峰面积；

W＝样品溶液中样品以干物质计算的含量，mg/100mL；

酶解样品溶液中，含有90％以上的果糖和10％以下的葡萄糖，则该样品为合格样品；

(3b)样品溶液

按式II计算果糖、葡萄糖和蔗糖中的每个组分糖占干物质的百分含量：

Pi＝Asa/ΣAsa×100      II

其中：Pi＝样品中组分i占干物质的百分含量；

Asa＝样品中组分i的峰面积；

ΣAsa＝样品中所有成分峰面积的总和；

所述的组分i为果糖、葡萄糖和蔗糖中的任意一种；

按式III计算样品中菊粉的百分含量：

Inulin％＝(1-F-G-GF)×100      III

其中：Inulin％＝菊粉占干物质的百分含量；

F＝样品溶液中果糖占干物质的百分含量；

G＝样品溶液中葡萄糖占干物质的百分含量；

GF＝样品溶液中蔗糖占干物质的百分含量。

2.根据权利要求1所述的菊粉的高效液相检测方法，其特征在于，步骤(1a)中，所述的水为二次蒸馏水或超纯水。

3.根据权利要求1所述的菊粉的高效液相检测方法菊粉的高效液相检测方法，其特征在于，步骤(1a)中，将液体样品或固体样品用超纯水溶解，溶解温度为80-90℃；溶解至菊粉含量为20-40mg/mL。

4.根据权利要求1所述的菊粉的高效液相检测方法菊粉的高效液相检测方法，其特征在于，步骤(1a)或(1b)中，所述的过滤为用0.45μm膜过滤；所述的离心为8000～15000r/min离心5min以上。

5.根据权利要求1所述的菊粉的高效液相检测方法菊粉的高效液相检测方法，其特征在于，步骤(1b)中，所述的醋酸缓冲溶液是由0.44mol醋酸钠和0.056mol醋酸混合配制成1L的水溶液；醋酸缓冲溶液的添加量为样品溶液体积的1-1.2倍。

6.根据权利要求1所述的菊粉的高效液相检测方法，其特征在于，步骤(1b)中，菊粉外切酶的添加量相对于样品溶液为15-20U/mL；酶解温度控制在55-60℃；酶解时间30-35min。

7.根据权利要求1所述的菊粉的高效液相检测方法，其特征在于，步骤(1c)中，标准品溶液中，溶质的浓度为4-7mg/mL。