CN111537656B - 一种苦荞提取物的鉴别方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种苦荞提取物鉴别方法，其通过同一高效液相色谱条件，能够分离苦荞提取物中五种黄酮类成分，并且有效的测定苦荞提取物中特征峰槲皮素‑3‑芸香糖苷‑7‑葡萄糖苷和芦丁含量，达到苦荞提取物产品鉴别的目的。

Description

一种苦荞提取物的鉴别方法
技术领域
本发明涉及生物质检测技术领域，具体涉及一种苦荞提取物的鉴别方法。
背景技术
苦荞即苦荞麦，属蓼科，是我国药食同源文化的典型体现。苦荞被誉为“五谷之王”，三降食品(降血压，降血糖，降血脂)。苦荞拥有独特、全面、丰富的营养成份，而且药用特性好，有人体所必须的多种营养成份。苦荞有通便排毒的功效，民间又称其为“净肠草”。苦荞还可以炒制后做成茶饮，每日饮用对三高患者有辅助治疗作用。苦荞是自然界中甚少的药食两用作物，苦荞集七大营养素于一身，不是药，不是保健品，是能当饭吃的食品，因为其特殊的生长环境，本身苦荞就富含硒的，可以对人体起到自然补充硒的作用，有着卓越的营养保健价值和非凡的食疗功效。
苦荞营养丰富，是所有粮食作物中营养价值和药用价值较好的食品资源，其主要功效成分黄酮类化合物具有较好的降血糖、降血压、抗氧化等功效。目前，苦荞及其产品的精加工与深加工等开发利用程度依然较低，其药效作用开发应用较少，有必要进一步充分认识苦荞的价值、研究现状及不足。
近年来，随着社会的发展和人们生活水平的提高，具有功能性的食品原料得到了越来越广泛的开发和应用。苦荞由于其良好的营养价值和药用价值被进一步的深度开发，其提取物产品和下游健康产品(如苦荞茶、苦荞酒、苦荞蛋糕等)在市场上备受青睐。人们自我保健意识的不断增强，对疾病的关注已经由单纯的治疗转向预防，在新的医学模式影响下，具备功能性或活性的植物提取物产品备受青睐。目前，植物提取物产业发展越来越快，其发展的速度已经超过药品发展速度，成为独立的新兴行业，在世界范围内得到广泛认可。苦荞中的黄酮类成分及价值远高于其他植物，因此富含黄酮类成分的苦荞提取物具有广泛的应用前景。
苦荞提取物中黄酮类成分较高且较全面，然而，很多消费者缺乏对苦荞提取物及其制品的全面了解，部分提取物商家以次充好、以假乱真，用伪劣商品掺假导致提取物产品参差不齐，质量不佳。如今市面上的掺假手段复杂，掺假问题经常发生，严重阻碍了苦荞提取物的发展进度和行业的健康秩序管理，因此，在此基础之上，研发一种可以准确鉴别苦荞提取物的方法，显得尤为迫切。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有的苦荞提取物难于鉴别的问题，通过提供一种高效液相色谱技术简单、准确的判定苦荞提取物的方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供的技术方案如下：
一种苦荞提取物的鉴别方法，步骤如下：
(1)制备混合对照品溶液：
制备含有槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷和芦丁的甲醇溶液作为混合对照品溶液；
(2)制备待测试品溶液：
制备含有待测试品的乙醇溶液作为混合对照品溶液；
(3)液相色谱仪测定：
分别取对混合对照品溶液和待测试品溶液注入液相色谱仪进行测定，获取色谱图中槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷、芦丁的峰面积；
(4)确定槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷和芦丁含量，判断是否为苦荞提取物。
优选地，步骤(1)包括如下步骤：
精密称量槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷10mg于100mL的容量瓶中，加入20％甲醇溶液80mL，超声溶解十分钟后，放置至室温，用20％甲醇溶解定容至刻度，摇匀即得槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷母液；
精密称量芦丁10mg于10mL的容量瓶中，加入甲醇溶液8mL，超声溶解十分钟后，放置至室温，用甲醇溶解定容至刻度，摇匀即得芦丁母液；
精密吸取槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷母液1.0mL、芦丁母液5.0mL于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀即得。
优选地，步骤(2)包括如下步骤：
精密称量待测试品30mg于50mL容量瓶中，加入60％乙醇40mL，超声溶解十分钟后，放置至室温，用60％乙醇溶解定容至刻度，摇匀后，用0.22μm针式过滤器过滤，即得。
优选地，步骤(3)中，色谱柱为：十八烷基键合硅胶柱，具体色谱条件为：流动相为乙腈和0.1％磷酸，梯度洗脱，流速1.0mL/min，检测波长360nm，柱温30℃。
优选地，步骤(3)中，梯度洗脱的条件为：
Figure BDA0002547336980000031
优选地，步骤(4)中，以质量分数w计，数值以％表示，槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷和芦丁含量按照以下公式计算：
Figure BDA0002547336980000032
式中：
w—待测试品中槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷、芦丁的质量分数(％)；
C—对照品溶液中槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷、芦丁浓度(mg/L)：
Ai—待测试品溶液中槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷、芦丁的峰面积；
A0—对照品溶液中槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷、芦丁的峰面积；
V—待测试品溶液的稀释体积(mL)；
m—待测试品溶液的称样量(mg)。
优选地，若槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷含量按干燥品计算不低于0.70％，芦丁含量按干燥品计算不低于60％，则认定该待测试品为苦荞提取物。
本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：
一、通过同一高效液相色谱条件，能够分离苦荞提取物中五种黄酮类成分，并且有效的测定苦荞提取物中特征峰槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷含量，能够有效测定其有效成分芦丁含量。
二、通过该色谱条件下的色谱峰及其特征成分含量，能够有效的判定苦荞提取物中是否掺杂芦丁和槐米提取物成分，达到苦荞提取物产品鉴别的目的。
附图说明
图1是混合对照品检测图谱；
图2是苦荞提取物检测图谱；
图3为本发明采用的不同批次苦荞提取物的检测图谱。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的鉴别方法，由下述步骤组成：
(1)参考色谱条件和系统适用性
a)色谱柱：十八烷基键合硅胶柱(250mm*4.6mm，5μm)。
b)流动相：乙腈-0.1％磷酸按照表1梯度洗脱。
表1梯度洗脱表
Figure BDA0002547336980000051
c)流速：1.0mL/min。
d)柱温：30℃。
e)检测波长：360nm。
f)理论塔板数按芦丁峰计算应不低于2000。
(2)溶液制备
对照品溶液制备
精密称量槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷10mg于100mL的容量瓶中，加入20％甲醇溶液约80mL，超声(250W，53KHz)溶解十分钟后，放置至室温，用20％甲醇溶解定容至刻度，摇匀即得槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷母液。
精密称量芦丁对照品10mg于10mL的容量瓶中，加入甲醇溶液约8mL，超声(250W，53KHz)溶解十分钟后，放置至室温，用甲醇溶解定容至刻度，摇匀即得芦丁母液。
精密称量山奈酚-3-O-芸香糖苷对照品10mg于50mL的容量瓶中，加入甲醇溶液约40mL，超声(250W，53KHz)溶解十分钟后，放置至室温，用甲醇溶解定容至刻度，摇匀即得山奈酚-3-O-芸香糖苷母液。
精密称量异鼠李素-3-O-芸香糖苷对照品10mg于50mL的容量瓶中，加入甲醇溶液约40mL，超声(250W，53KHz)溶解十分钟后，放置至室温，用甲醇溶解定容至刻度，摇匀即得异鼠李素-3-O-芸香糖苷母液。
精密称量槲皮素对照品10mg于25mL的容量瓶中，加入甲醇溶液约20mL，超声(250W，53KHz)溶解十分钟后，放置至室温，用甲醇溶解定容至刻度，摇匀即得槲皮素母液。
精密称量山奈素对照品10mg于100mL的容量瓶中，加入甲醇溶液约80mL，超声(250W，53KHz)溶解十分钟后，放置至室温，用甲醇溶解定容至刻度，摇匀即得山奈素母液。
分别精密量取槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷、芦丁、山奈酚-3-O-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、槲皮素、山奈素1mL、5mL、1mL、1mL、1mL、1mL于10mL容量瓶中，甲醇定容，得混合对照品溶液。
待测试品溶液制备
精密称量待测试品30mg于50mL容量瓶中，加入60％乙醇约40mL，超声(250W，53KHz)溶解十分钟后，放置至室温，用60％乙醇溶解定容至刻度，摇匀后，用0.45μm针式过滤器过滤后，即得待测试品溶液。
(3)测定
分别吸取对照品溶液和待测试品溶液10μL进行测定，见图1-2。
从图1-2中可以看出，槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷、芦丁、山奈酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素、山奈素保留时间基本一致的色谱峰，且苦荞提取物待测试品溶液中不应有异鼠李素-3-O-芸香糖苷色谱峰。
表2对照品溶液对应组分保留时间
Figure BDA0002547336980000071
以下实施例确定采用槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷和芦丁作为对照品成分进行鉴别。
实施例
(1)仪器和设备
高效液相色谱仪(附紫外检测器)
电子天平(十万分之一)
(2)试剂和材料
乙腈、磷酸：色谱纯
甲醇、乙醇：分析纯
纯化水
(3)参考色谱条件和系统适用性
a)色谱柱：十八烷基键合硅胶柱(250mm*4.6mm，5μm)。
b)流动相：乙腈-0.1％磷酸按照表1梯度洗脱。
c)流速：1.0mL/min。
d)柱温：30℃。
e)检测波长：360nm。
f)理论塔板数按芦丁峰计算应不低于2000。
(4)溶液制备
对照品溶液制备
精密称量槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷10mg于100mL的容量瓶中，加入20％甲醇溶液约80mL，超声(250W，53KHz)溶解十分钟后，放置至室温，用20％甲醇溶解定容至刻度，摇匀即得槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷母液。
精密称量芦丁对照品10mg于10mL的容量瓶中，加入甲醇溶液约8mL，超声(250W，53KHz)溶解十分钟后，放置至室温，用甲醇溶解定容至刻度，摇匀即得芦丁母液。
精密吸取槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷母液1.0mL、芦丁母液5.0mL于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀即得对照品储备液。
待测试品溶液制备
精密称量待测试品约30mg于50mL容量瓶中，加入60％乙醇约40mL，超声(250W，53KHz)溶解十分钟后，放置至室温，用60％乙醇溶解定容至刻度，摇匀后，用0.22μm针式过滤器过滤后，即得待测试品溶液。
(5)测定与计算
分别取对照品溶液和待测试品溶液10μL注入液相色谱仪进行测定，根据所得对照品溶液和待测试品溶液色谱图中槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷、芦丁峰面积计算待测试品中待测组分槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷、芦丁含量，以质量分数w计，数值以％表示，公式按(E.1)计算：
Figure BDA0002547336980000081
式中：
w—待测试品中槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷、芦丁的质量分数(％)；
C—对照品溶液中槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷、芦丁浓度(mg/L)：
Ai—待测试品溶液中槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷、芦丁的峰面积；
A0—对照品溶液中槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷、芦丁的峰面积；
V—待测试品溶液的稀释体积(mL)；
m—待测试品溶液的称样量(mg)。
采用上述方法对不同批次产地的待测试品进行检测，检测结果见图3及下表筛选出槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷含量按干燥品计算均不低于0.70％，芦丁含量按干燥品计算均不低于60％的待测试品为苦荞提取物。
表3苦荞提取物①槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷、②芦丁含量检测
Figure BDA0002547336980000091
验证例
(1)精密度试验
1)重复性试验
取苦荞提取物(批号为Z171180305)同一天按照供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液，按参考色谱条件测定，①槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷平均含量为0.96％，RSD值为1.28％，②芦丁平均含量为64.56％，RSD值为0.75％。分离度应大于1.5。见表4。
表4重复性试验结果
Figure BDA0002547336980000101
2)中间精密度
取苦荞提取物(批号为Z171180305)，由不同人员按照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，在不同日期不同仪器(Waters e2695-2489高效液相色谱仪)测定6次，①槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷平均含量为0.96％，RSD值为1.36％，②芦丁平均含量为64.85％，RSD值为1.09％。见表5。
表5中间精密度试验结果
Figure BDA0002547336980000102
(2)准确度试验
取苦荞提取物(批号为Z171180305，①槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷平均含量为0.96％，②芦丁平均含量为64.56％)精密称定约15mg于9个50mL容量瓶中。
另取①槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷对照品(The nature network，纯度93.5％)9.24mg于50mL容量瓶中，加20％甲醇溶解并定容(此对照溶液中含槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷172.7880mg/L)，分别吸取该对照品溶液0.4mL(以槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷计0.0691mg)、0.8mL(以槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷计0.1382mg)、1.2mL(以槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷计0.2073mg)，分别加入含样品的9个容量瓶中。
另取②芦丁对照品(中检所，纯度91.9％)121.02mg于50mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容(此对照品溶液中含芦丁2224.3476mg/L)，分别吸取该对照品溶液2.2mL(以芦丁计4.8936mg)、4.4mL(以芦丁计9.7871mg)、6.6mL(以芦丁计14.6807mg)，分别加入含样品的9个容量瓶中。
静置10分钟后，加入60％乙醇溶液约40mL，超声(250W，53KHz)提取10min后，放置至室温，用60％乙醇溶液定容至刻度，制成供回收率测定用供试品溶液，按照参考色谱条件测定，计算①槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷平均回收率为99.56％(95％-105％)，RSD值为1.92％，②芦丁平均回收率为100.59％(95％-105％)，RSD值为1.80％，均符合要求。见表6-7。
表6①槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷回收率结果
Figure BDA0002547336980000111
表7②芦丁回收率结果
Figure BDA0002547336980000121
上述方法学验证表明，苦荞提取物中槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷、芦丁含量的高效液相色谱法其精密度、准确度等均符合要求，该方法稳定、可靠、可行，可以作为苦荞提取物中槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷、芦丁的含量测定方法。
综上所述，苦荞提取物中槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷含量按干燥品计算应当不低于0.70％，芦丁含量按干燥品计算应当不低于60％。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (1)

1.一种苦荞提取物的检测方法，其特征在于，由下述步骤组成：
（1）参考色谱条件和系统适用性
a）色谱柱：十八烷基键合硅胶柱；
b）流动相：乙腈-0.1%磷酸按照如下条件进行梯度洗脱：
时间/min 乙腈 0.1%磷酸 0 10 90 20 25 75 40 40 60
c）流速：1.0 mL/min；
d）柱温：30℃；
e）检测波长：360 nm；
f）理论塔板数按芦丁峰计算应不低于2000；
（2）溶液制备
对照品溶液制备
精密称量槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷10mg于100mL的容量瓶中，加入20%甲醇溶液80mL，超声溶解十分钟后，放置至室温，用20%甲醇溶解定容至刻度，摇匀即得槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷母液；
精密称量芦丁对照品10mg于10mL的容量瓶中，加入甲醇溶液8mL，超声溶解十分钟后，放置至室温，用甲醇溶解定容至刻度，摇匀即得芦丁母液；
精密称量山奈酚-3-O-芸香糖苷对照品10mg于50mL的容量瓶中，加入甲醇溶液40mL，超声溶解十分钟后，放置至室温，用甲醇溶解定容至刻度，摇匀即得山奈酚-3-O-芸香糖苷母液；
精密称量异鼠李素-3-O-芸香糖苷对照品10mg于50mL的容量瓶中，加入甲醇溶液40mL，超声溶解十分钟后，放置至室温，用甲醇溶解定容至刻度，摇匀即得异鼠李素-3-O-芸香糖苷母液；
精密称量槲皮素对照品10mg于25mL的容量瓶中，加入甲醇溶液20mL，超声溶解十分钟后，放置至室温，用甲醇溶解定容至刻度，摇匀即得槲皮素母液；
精密称量山奈素对照品10mg于100mL的容量瓶中，加入甲醇溶液80mL，超声溶解十分钟后，放置至室温，用甲醇溶解定容至刻度，摇匀即得山奈素母液；
分别精密量取槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷、芦丁、山奈酚-3-O-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、槲皮素、山奈素1mL、5mL、1mL、1mL、1mL、1mL于10mL容量瓶中，甲醇定容，得混合对照品溶液；
待测试品溶液制备
精密称量待测试品30mg于50mL容量瓶中，加入60%乙醇40mL，超声溶解十分钟后，放置至室温，用60%乙醇溶解定容至刻度，摇匀后，用0.45 μm针式过滤器过滤后，即得待测试品溶液；
（3）测定
分别吸取对照品溶液和待测试品溶液10μL进行测定；
苦荞提取物待测试品溶液中具有槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷、芦丁、山奈酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素、山奈素保留时间基本一致的色谱峰，不具有异鼠李素-3-O-芸香糖苷色谱峰；对照品溶液对应组分保留时间具体为：槲皮素-3-芸香糖苷-7-葡萄糖苷的保留时间为10.27min、芦丁的保留时间为18.38min、山奈酚-3-O-芸香糖苷的保留时间为21.09min、异鼠李素-3-O-芸香糖苷的保留时间为21.63min，槲皮素的保留时间为31.73min、山奈素的保留时间为38.81min。
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