CN112268973A - 一种松花粉中柚皮素hplc含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种松花粉中柚皮素HPLC含量测定方法，建立了松花粉中柚皮素成分的含量测定方法，并对多个产地松花粉柚皮素进行了含量测定，具有操作简便、快速、专属性强、重复性好的特点；柚皮素在松花粉中含量稳定且高，故可作为松花粉药材质量控制的指标成分，对松花粉的研究具有重要意义，有助于药材后续研究，有利于扶正化瘀片/胶囊等中药及其他含松花粉保健品的质量控制和表征。
Description
技术领域
本发明属于松花粉测定领域，特别涉及一种松花粉中柚皮素HPLC含量测定方法。
背景技术
松花粉为松科植物马尾松(Pinus massoniana Lamb.)、油松(Pinustabulieformis Carr.)或同属数种植物的干燥花粉。松花粉别名松黄、松花，是我国传统的药食两用药材之一，具有收敛止血，燥湿敛疮的功效，可用于外伤出血、皮肤糜烂、湿疹、黄水疮等症。松花粉是中药扶正化瘀片/胶囊(国药准字Z20020047/Z20050573)原料药材之一，也是松花粉灵芝片、松花粉蒲公英颗粒等保健品的原材料之一。松花粉通常于春季花刚开时进行采摘，花穗晒干，收集花粉，除去杂质即得。干燥的松花粉呈光滑椭圆状，淡黄色，体质轻，易飞扬，手感滑润，不沉于水，气微香，味有油腻感，其营养丰富，含多种维生素类、多糖类、黄酮类、核酸类、脂肪酸类、氨基酸类，膳食纤维类等营养物质，有“花粉之王”之美称。
松花粉于1985年就已被《中国药典》收载，而《中国药典》、《上海市中药饮片炮制规范》等各省、地方标准的标准中只有性状、显微鉴别、水分、总灰分等质量控制项目。未对松花粉进行化学成分含量测定的控制和表征。因此有必要建立松花粉含量测定方法，用以控制和表征松花粉质量。研究表明，黄酮类成分属于松花粉的主要活性成分，总黄酮含量高达1.60％～2.95％。松花粉中二氢黄酮类化合物柚皮素(C15H12O5)，具有降血脂、抗菌、抗氧化、抗肿瘤、抗癌、抗纤维化等多种药理活性，具有良好的药用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种松花粉中柚皮素HPLC含量测定方法，该方法具有操作简便、快速、专属性强、重复性好的特点。
本发明提供了一种松花粉中柚皮素HPLC含量测定方法，包括：
(1)取供试品加入乙醇溶液溶解，加热回流，过滤，取滤液得到供试品溶液；
(2)取柚皮素对照品加入甲醇溶解，制得对照品溶液；
(3)分别吸取供试品溶液和对照品溶液，进行HPLC测定；其中，色谱条件为：色谱柱为C18色谱柱；流动相为甲醇-0.05％磷酸溶液；柱温为20-40℃；检测波长为285-303nm；流速为0.5-2ml/min；进样量为1-20μl；理论塔板数按柚皮素峰计算应不低于3000。
所述步骤(1)中的乙醇浓度为60-80％。
所述步骤(1)中的加热回流时间为1-2.5h。
所述步骤(2)中的甲醇浓度为80-100％。
所述步骤(3)中的甲醇与0.05％磷酸溶液的体积比为45:55，流动相甲醇可在其相对值±30％的范围内进行调整，0.05％磷酸溶液随之进行调整。
所述步骤(3)中的检测波长为288nm。
所述步骤(2)中将柚皮素对照品逐级稀释成9.3、15.6、25.9、43.2、72.0、120.0、200.0μg/ml7个不同等级的质量浓度，分别测定峰面积，以柚皮素质量浓度为横坐标，柚皮素峰面积为纵坐标，进行线性回归。
有益效果
本发明具有操作简便、快速、专属性强、重复性好的特点；柚皮素在松花粉中含量稳定且高，故可作为松花粉药材质量控制的指标成分，对松花粉的研究具有重要意义，有助于药材后续研究和相关中药及保健食品的质量控制。
附图说明
图1为松花粉中柚皮素HPLC色谱图；其中，A为阴性对照；B为柚皮素对照品；C为松花粉供试品。
图2为柚皮素溶液最大吸收波长。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1材料和方法
1.1实验材料
松花粉样品由上海黄海制药有限责任公司提供(表6)。柚皮素对照品，批号：3597，纯度：98％，购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；HPLC级甲醇和96％磷酸，均购自上海安谱科技股份有限公司。
1.2实验仪器
Agilent1260高效液相色谱仪(Agilent公司)；HWS24型电热恒温水浴锅(上海-恒科技有限公司)；XP-105电子天平(梅特勒-托利多)；Diamonsil C18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm，上海迪科马分析技术有限公司)。
1.3柚皮素含量测定方法
1.3.1色谱条件
流动相：甲醇-0.05％磷酸溶液(45:55)；柱温：30℃；检测波长为288nm；流速1.0ml/min；进样量10ml；理论塔板数按柚皮素峰计算应不低于3000。
1.3.2溶液制备
1)对照品溶液的制备
取柚皮素对照品适量，精密称取，置容量瓶中，加入甲醇制成每1ml含有80μg柚皮素对照品的溶液。
2)供试品溶液的制备
取供试品约1.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇50ml，密塞，称定重量，加热回流2h，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液备用。
3)空白溶液制备
以70％乙醇按“供试品溶液”制备方法制备。
1.4系统适用性考察
1.4.1专属性
测定空白溶液，结果应对照柚皮素与空白溶液相同保留时间处无对应的色谱峰出现。使用DAD检测器测定供试品柚皮素峰纯度，峰纯度应≥980。
1.4.2线性关系
将柚皮素对照品逐级稀释成9.3、15.6、25.9、43.2、72.0、120.0、200.0μg/ml 7个不同等级的质量浓度，分别测定峰面积，以柚皮素为横坐标，柚皮素峰面积为纵坐标，进行线性回归。
1.4.3精密度试验
精密吸取柚皮素对照品10μl，连续进样5针，计算柚皮素峰面积RSD，考察仪器精密度。
1.4.4稳定性试验
取同一供试品溶液(批号：DYC200311)，在室温放置0、2、4、8、12、24、48h时取样测定，计算柚皮素含量，其RSD≤2％。
1.4.5重复性试验
取同一批号供试品溶液(批号：DYC200311)6份，进行柚皮素含量测定，计算RSD≤2％。
1.4.6准确度试验
精密取同一批样品(批号：DYC200311)9份，分别精密加入低、中、高3个浓度水平的对照品溶液，测定原液与加标供试液，计算回收率和RSD值。
1.4.7检测限和定量限
将对照品逐级稀释，分别按信噪比(S/N)等于10(定量限)和3(检测限)计算确定，检测相应的检测限和定量限。
1.5提取与分析方法研究
1.5.1采用Agilent1260II液相色谱仪DAD检测器进行全波长扫描，确定柚皮素最大波长范围。
1.5.2不同浓度的提取溶剂的含量比较
取松花粉1.5g，分别加入不同浓度的乙醇(30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇、100％乙醇)和甲醇(30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、90％甲醇、100％甲醇)50ml，超声1h后，测定含量。
1.5.3不同提取方法
取松花粉1.5g，加入70％乙醇50ml，选择超声和回流1h，测定含量。
1.5.4不同提取时间
取松花粉1.5g，加入70％乙醇50ml，选择不同时间点回流，测定含量。
1.5.6先选择不同产地和批次的松花粉进行柚皮素的含量测定。
2.结果
2.1专属性
供试品和柚皮素对照品的HPLC保留时间相同，柚皮素与其他成分的色谱峰分离度良好，对照柚皮素与空白溶液相同保留时间处无对应的色谱峰出现(图1)。使用DAD检测器测定供试品柚皮素峰纯度，峰纯度为999。
2.2精密度试验
柚皮素对照品溶液峰面积分别为：39.81、39.88、40.34、40.01、39.77，平均峰面积为：39.96，RSD为0.58％(≤2％)，说明仪器精密度良好。
2.3线性关系的考察
计算得回归方程为Y＝0.590 1x+0.847 3，相关系数r＝1.000 0，结果表明柚皮素质量浓度在10.0～216.0mg/ml范围内有较好的线性关系。
2.4重复性试验
重复性试验的结果表明，该方法重复性良好，RSD为0.52％(≤2％)(表1)。
表1柚皮素重复性试验结果
2.5稳定性试验
在室温放置不同时间时测定的柚皮素含量分别为：0.22％、0.21％、0.22％、0.21％、0.21％、0.21％、0.22％，RSD为0.31％(≤2％)。表明供试品溶液在48h内稳定。
2.6准确度试验
柚皮素回收率在90％～108％范围内，平均回收率99％，RSD为1.04％。符合《中国药典》2015年版四部指导原则9101的要求(表2)。
表2柚皮素加样回收试验
2.7定量限和检测限
对照品质量溶度为0.77μg/ml(S/N＝52)及1.29μg/ml(S/N＝84)时，检测均无干扰，因此确定检测限质量浓度为0.77μg/ml、定量限质量浓度为1.29μg/ml。
2.8采用Agilent1260II液相色谱仪DAD检测器全波长扫描，柚皮素最大波长在289.8nm左右。因此在289±4nm的波长进行检测可获得较好的准确性。
2.9不同浓度的提取溶剂比较
取松花粉1.5g，分别加入不同浓度的乙醇(30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇、100％乙醇)和甲醇(30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、90％甲醇、100％甲醇)50ml，超声1h后，测定含量，结果显示70％乙醇条件下柚皮素含量较高(表3)。
表3不同浓度的提取溶解柚皮素含量
2.10不同提取方法比较
取松花粉1.5g，加入70％乙醇50ml，选择超声和回流1h，测定含量，结果显示回流条件下柚皮素含量较高(表4)。
表4不同提取方法柚皮素含量
| 溶剂浓度 | 回流含量％ | 超声含量％ |
| 70％乙醇 | 0.22 | 0.021 |
2.11不同提取时间比较
取松花粉1.5g，加入70％乙醇50ml，选择不同时间点回流，测定含量，结果显示2h条件下柚皮素含量较高(表5)。
表5不同提取时间柚皮素含量
| 时间 | 柚皮素含量％ |
| 0.5h | 0.15 |
| 1h | 0.18 |
| 1.5h | 0.21 |
| 2.0h | 0.24 |
| 2.5h | 0.21 |
2.12不同产地松花粉中柚皮素的含量测定(表6)
表6不同产地12批次松花粉中柚皮素的含量
分别取不同产地药材12批次进行含量测定，柚皮素色谱峰的峰形对称、分离效果良好。
3讨论
本发明前期进行了松花粉破壁(室温、冷冻)处理、去脂(乙醚、石油醚)、提取溶剂(不同浓度的乙醇、甲醇)、提取方法(回流、超声)、提取时间、提取温度以及料液比等因素的考察。结果显示，药材粉碎方式对结果影响不大；未去脂条件下柚皮素含量较高；70％乙醇回流2h提取效果较好。选择甲醇-水和甲醇-磷酸水溶液等体系考察，发现当加入0.05％磷酸时，效果较佳、基线平稳、峰形尖锐、分析采集时间适宜，故选择甲醇-0.05％磷酸溶液体系作为流动相。
从含量测定结果数据分析，柚皮素普遍存在于不同产地、不同松树品种的松花粉中，且含量测定准确、稳定，可作为松花粉质量控制的指标性成分。
4.采用不同色谱条件及样品处理方法作为对比例1与实施例1进行比较(表7)。
表7不同色谱条件及样品处理方法作为对比例1与实施例1比较
4.1实施例1采用Agilent1260II DAD全波长扫描，柚皮素最大波长在289.8nm，采用288nm左右比360nm更能真实的反应出柚皮素的紫外吸收，测定数据更准确。
4.2对比例1采用梯度洗脱，柚皮素出峰大约在27min；实施例1为等度洗脱，出峰大约在16min，峰形好、分离度好，提高了效率、降低了分析成本。
4.3采用对比例1提取方法测得9批松花粉中柚皮素平均0.017％；采用实施例1提取方法测定同样9批松花粉中柚皮素平均0.21％，实施案例1的柚皮素含量明显高于对比例1含量，准确性更高(表8)。
表8不同产地9批松花粉中柚皮素含量汇总
由此可见本发明更能真实的反应松花粉中柚皮素的含量。
Claims (7)
1.一种松花粉中柚皮素HPLC含量测定方法，包括：
(1)取供试品加入乙醇溶液溶解，加热回流提取，过滤，取滤液得到供试品溶液；
(2)取柚皮素对照品加入甲醇溶解，制得对照品溶液；
(3)分别吸取供试品溶液和对照品溶液，进行HPLC测定；其中，色谱条件为：色谱柱为C18色谱柱；流动相为甲醇-0.05％磷酸溶液；柱温为20-40℃；检测波长为285-303nm；流速为0.5-2ml/min；进样量为1-20μl；理论塔板数按柚皮素峰计算应不低于3000。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的乙醇浓度为60-80％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的加热回流时间为1-2.5h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的甲醇浓度为80-100％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的甲醇与0.05％磷酸溶液的体积比为45:55。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的检测波长为288nm。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将柚皮素对照品逐级稀释成9.3、15.6、25.9、43.2、72.0、120.0、200.0μg/ml 7个不同等级的质量浓度，分别测定峰面积，以柚皮素质量浓度为横坐标，柚皮素峰面积为纵坐标，进行线性回归。
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| CN101040879A (zh) * | 2007-04-27 | 2007-09-26 | 上海现代中医药技术发展有限公司 | 扶正化瘀植物药中松花粉原料指纹图谱质量控制方法 |
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