CN102495168A - 萱草花及其制剂的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了萱草花及其制剂的检测方法，萱草花制剂的检测方法包括如下鉴别方法和/或含量测定中的一种或几种：A薄层色谱鉴别；B紫外分光光度法含量测定；C是HPLC法含量测定；D原药材的HPLC指纹图谱，本发明还进一步提供萱草花的HPLC检测方法和HPLC指纹图谱检测方法；本发明的萱草花及其制剂的检测方法中的鉴别专属性很好，方法经济适用、结果快速；含量测定方法可以很有效的对产品进行质量检测；指纹图谱测定中分析方法稳定可靠有效，为萱草花制剂和药材的鉴别和质量评价与控制提供了依据。

Description

萱草花及其制剂的检测方法

技术领域

本发明涉及一种中药及其制剂的检测方法，特别涉及萱草花及其制剂的检测方法。

背景技术

萱草花，即萱草花(Hemerocallis citrina Baroni)，又名“金针菜”、“一日百合”，俗称“忘忧草”，属百合科萱草属多年生草本植物植物，在我国各地多有种植，其具有丰富的营养成份，主要化学成分有蛋白质、脂肪、碳水化合物，还有多种维生素、生物碱、苷、黄酮类、胡萝卜素、挥发油、鞣质以及无机矿物钙、磷，以黄酮类化合物为主要成分，可以药食两用，明代李时珍在《本草纲目》中称其有安神醒脑、增智宽胸、美容养血、解热消毒、除烦通乳之功效。

现代研究萱草花具有补脑健智、化瘀止血、通络止痛、抗菌消炎等功效，它具有增强免疫力、活血化瘀、保肝抗炎、抗菌抗病毒、抑制肿瘤、清除氧自由基和抑菌作用等多种功能。近年来有研究表明萱草花有明显的抗抑郁作用，萱草花提取制成的制剂能有效的治疗抑郁症，但目前对萱草花制剂的质量检测研究尚少，这会影响产品的质量和疗效，不利于药品的标准化生产及提高生产效率，也不符合现代中药发展的趋势。

发明内容

本发明的目的在于公开了萱草花的检测方法。

本发明另一个目的在于公开萱草花制剂的检测方法。

本发明目的是通过如下技术方案实现的：

萱草花制剂的检测方法包括如下鉴别方法和/或含量测定中的一种或几种：

A、薄层色谱鉴别

取萱草花制剂，用10-50％乙醇溶解，离心取上清液，作为供试品溶液；

取芦丁标准品，加甲醇制成1mg/ml溶液，作为芦丁对照品溶液；

吸取等量供试品及对照品溶液，分别点于同一聚酰胺板上，以1-5∶1-5的甲醇∶水为展开剂，展开，取出，喷0.5％-2％三氯化铝展开剂显色，置300-400nm紫外光灯下检视；

优选的，用10-50％乙醇超声溶解；

优选的，置365nm紫外光灯下检视；

B、紫外分光光度法含量测定

供试品溶液的制备：萱草花制剂加10-50％乙醇提取；

对照品溶液的制备：称取芦丁对照品，加甲醇制成每1mL含0.1-0.4mg的溶液；

标准曲线的制备：分别量取不同容量的对照品溶液，分别置容器中，各容器中先后相同加入3％-8％亚硝酸钠溶液、4％-15％硝酸铝溶液、氢氧化钠试液；在波长400～600nm内选择波长，测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程；

取供试品溶液，置量瓶中，先后相同加入3％-8％亚硝酸钠溶液、4％-15％硝酸铝溶液、氢氧化钠试液；按标准曲线选取的紫外波长测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含芦丁的浓度，计算，即得；

供试品溶液的制备优选用10-50％乙醇超声提取；

对照品溶液的制备优选：制成每1mL含0.2mg的溶液；

所述亚硝酸钠溶液的浓度优选为：5％；

所述酸铝溶液的浓度优选为：10％；

C、HPLC法含量测定

测定条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以30-50∶50-70的甲醇∶0.5％冰醋酸溶液为流动相；检测波长为200-300nm，理论塔板数按芦丁峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备：称取芦丁对照品，加甲醇制成对照品溶液；

供试品溶液的制备：称取萱草花制剂加10-50％乙醇提取5-20分钟，过滤，取滤液，即得；

测定法：分别吸取相同体积的对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，既得；

供试品溶液的制备方法中，优选乙醇超声提取；

D、原药材的HPLC指纹图谱

测定条件：C18色谱柱，流动相为甲醇-水(0.5％冰醋酸)梯度洗脱，梯度洗脱的条件为：第0-20min：甲醇为20％，0.5％的冰醋酸水溶液为80％；第20-30min：甲醇为30％，0.5％的冰醋酸水溶液为70％；第30-70min：甲醇为30％，0.5％的冰醋酸水溶液为70％；第70min至最后：甲醇为80％，0.5％的冰醋酸水溶液为20％；流速0.5-1.5mL/min^-1，检测波长200-300nm，柱温20-30℃；

对照品溶液的制备：称取芦丁对照品加甲醇制成对照品溶液；

供试品溶液的制备：称取萱草花置容量瓶中，加甲醇，超声处理20-45分钟，静置放冷，取上清液，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

按上述方法色谱条件测定，记录指纹图谱；

所述指纹图谱包括12个共有特征峰，以3号为芦丁为参照峰，相对保留时间及相对峰面积分别为：1号峰相对保留时间为0.232，相对峰面积为：0.051-0.278；2号峰相对保留时间为0.936，相对峰面积为：0.020-0.212；4号峰相对保留时间为1.039，相对峰面积为：0.023-0.041；5号峰相对保留时间为1.079，相对峰面积为：0.008-0.178；，6号峰相对保留时间为1.095，相对峰面积为：0.005-0.029；7号峰相对保留时间为1.115，相对峰面积为：0.045-0.367；8号峰相对保留时间为1.135，相对峰面积为：0.049-0.269；9号峰相对保留时间为1.159，相对峰面积为：0.004-0.023；10号峰相对保留时间为1.171，相对峰面积为：0.003-0.014；11号峰相对保留时间为1.218，相对峰面积为：0.012-0.062；12号峰相对保留时间为1.326，相对峰面积为：0.002-0.313。

萱草花制剂的检测方法优选包括如下鉴别方法和/或含量测定中的一种或几种：

A、薄层色谱鉴别

取萱草花制剂，用10-50％乙醇超声溶解，离心取上清液，作为供试品溶液；另取芦丁标准品，加甲醇制成1mg/ml溶液，作为芦丁对照品溶液；吸取等量供试品及对照品溶液，分别点于同一聚酰胺板上，以1-5∶1-5的甲醇∶水为展开剂，展开，取出，喷1％三氯化铝展开剂显色，置365nm紫外光灯下检视；

B、紫外分光光度法含量测定

供试品溶液的制备：萱草花制剂加10-50％乙醇超声提取；

对照品溶液的制备：称取芦丁对照品，加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液；

标准曲线的制备：分别量取不同容量的对照品溶液，分别置容器中，各容器中先后相同加入5％亚硝酸钠溶液、10％硝酸铝溶液、氢氧化钠试液；在波长400～600nm内选择波长，测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程；

取供试品溶液，置量瓶中，先后相同加入5％亚硝酸钠溶液、10％硝酸铝溶液、氢氧化钠试液；按标准曲线选取的紫外波长测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含芦丁的浓度，计算，即得。

C、HPLC法含量测定

测定条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以30-50∶50-70的甲醇∶0.5％冰醋酸溶液为流动相；检测波长为200-300nm，理论塔板数按芦丁峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备：称取芦丁对照品，加甲醇制成对照品溶液；

供试品溶液的制备：称取萱草花制剂加10-50％乙醇超声5-20分钟，过滤，取滤液，即得；

测定法：分别吸取相同体积的对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，既得；

D、原药材的HPLC指纹图谱

测定条件：C18色谱柱，流动相为甲醇-水(0.5％冰醋酸)梯度洗脱，梯度洗脱的条件为：第0-20min：甲醇为20％，0.5％的冰醋酸水溶液为80％；第20-30min：甲醇为30％，0.5％的冰醋酸水溶液为70％；第30-70min：甲醇为30％，0.5％的冰醋酸水溶液为70％；第70min至最后：甲醇为80％，0.5％的冰醋酸水溶液为20％；流速0.5-1.5mL/min^-1，检测波长200-300nm，柱温20-30℃；

对照品溶液的制备：称取芦丁对照品加甲醇制成对照品溶液；

供试品溶液的制备：称取萱草花置容量瓶中，加甲醇，超声处理20-45分钟，静置放冷，取上清液，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

按上述方法色谱条件测定，记录指纹图谱；

所述指纹图谱包括12个共有特征峰，以3号为芦丁为参照峰，相对保留时间及相对峰面积分别为：1号峰相对保留时间为0.232，相对峰面积为：0.051-0.278；2号峰相对保留时间为0.936，相对峰面积为：0.020-0.212；4号峰相对保留时间为1.039，相对峰面积为：0.023-0.041；5号峰相对保留时间为1.079，相对峰面积为：0.008-0.178；，6号峰相对保留时间为1.095，相对峰面积为：0.005-0.029；7号峰相对保留时间为1.115，相对峰面积为：0.045-0.367；8号峰相对保留时间为1.135，相对峰面积为：0.049-0.269；9号峰相对保留时间为1.159，相对峰面积为：0.004-0.023；10号峰相对保留时间为1.171，相对峰面积为：0.003-0.014；11号峰相对保留时间为1.218，相对峰面积为：0.012-0.062；12号峰相对保留时间为1.326，相对峰面积为：0.002-0.313。

本发明还进一步提供萱草花的检测方法：

色谱条件C18色谱柱，甲醇-0.5％冰醋酸溶液为流动相二元梯度洗脱，梯度洗脱的条件为：第0-20min：甲醇为20％→30％，0.5％的冰醋酸水溶液为80％→70％；第20-30min：甲醇为30％，0.5％的冰醋酸水溶液为70％；第30-70min：甲醇为30％→80％，0.5％的冰醋酸水溶液为70％→20％；流速0.5-1.5mL·min-1，检测波长200-300nm，柱温20-30℃；

对照品溶液的制备：称取芦丁对照品加甲醇制成对照品溶液；

供试品溶液的制备：称取萱草花置容量瓶中，加甲醇，超声处理20-45分钟，静置放冷，取上清液，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别吸取相同体积的对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，既得。

本发明还进一步提供萱草花的HPLC指纹图谱检测方法：

色谱条件：C18色谱柱，流动相为甲醇-水(0.5％冰醋酸)梯度洗脱，梯度洗脱的条件为：第0-20min：甲醇为20％，0.5％的冰醋酸水溶液为80％；第20-30min：甲醇为30％，0.5％的冰醋酸水溶液为70％；第30-70min：甲醇为30％，0.5％的冰醋酸水溶液为70％；第70min至最后：甲醇为80％，0.5％的冰醋酸水溶液为20％，流速0.5-1.5mL/min^-1，检测波长200-300nm，柱温20-30℃；

对照品溶液的制备：称取芦丁对照品加甲醇制成对照品溶液；

供试品溶液的制备：称取萱草花置容量瓶中，加甲醇，超声处理20-45分钟，静置放冷，取上清液，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

按上述方法色谱条件测定，记录指纹图谱；

所述指纹图谱包括12个共有特征峰，以3号为芦丁为参照峰，相对保留时间及相对峰面积分别为：1号峰相对保留时间为0.232，相对峰面积为：0.051-0.278；2号峰相对保留时间为0.936，相对峰面积为：0.020-0.212；4号峰相对保留时间为1.039，相对峰面积为：0.023-0.041；5号峰相对保留时间为1.079，相对峰面积为：0.008-0.178；，6号峰相对保留时间为1.095，相对峰面积为：0.005-0.029；7号峰相对保留时间为1.115，相对峰面积为：0.045-0.367；8号峰相对保留时间为1.135，相对峰面积为：0.049-0.269；9号峰相对保留时间为1.159，相对峰面积为：0.004-0.023；10号峰相对保留时间为1.171，相对峰面积为：0.003-0.014；11号峰相对保留时间为1.218，相对峰面积为：0.012-0.062；12号峰相对保留时间为1.326，相对峰面积为：0.002-0.313。

本发明萱草花制剂由萱草花单味药提取后制成。

所述萱草花单味药提取方法包括水提取或有机溶剂提取。

所述萱草花单味药提取方法优选有机溶剂提取；

所述萱草花单味药提取方法更优选乙醇提取；

所述萱草花单味药提取方法更优选乙醇加热回流提取；

所述萱草花单味药提取方法更优选萱草花乙醇加热回流提取后通过大孔树脂柱精制；

所述萱草花单味药提取方法更优选萱草花60-95％乙醇加热回流提取后通过大孔树脂柱精制；

所述萱草花单味药提取方法更优选为：取萱草花，用60-95％乙醇加热回流提取1-4次，每次0.5-1小时，过滤，合并滤液，回收乙醇，得浸膏A，浸膏A用蒸馏水稀释后过滤，通过大孔树脂柱，蒸馏水洗至流出液透明，先后用20％-95％乙醇洗脱2-6倍柱体积，分别回收乙醇，得提取物。

所述萱草花单味药提取方法更优选为：将萱草花60-95％乙醇加热回流提取1-4次，每次0.5-1小时，过滤，合并滤液，回收乙醇，得浸膏A，残渣I，残渣I用20-80％乙醇加热提取1-4次，每次20-60min，过滤，合并滤液，回收乙醇，得浸膏B，将浸膏A与浸膏B用蒸馏水稀释后过滤，通过大孔树脂柱，蒸馏水洗至流出液透明，先后用20％-95％乙醇洗脱2-6倍柱体积，分别回收乙醇，得提取物。

本发明提供萱草花制剂的最优方法，该方法为包括萱草花用60-75％乙醇冷浸或渗漉，得提取物。

上述提取物按常规的制剂工艺制成临床可接受的任意剂型，例如胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液、丸剂等制剂。

为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料，例如：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：PEG6000，PEG4000，虫蜡等。

本发明所提供的萱草花及其制剂的检测方法，是通过大量具体创造性试验筛选后得到，鉴别方法中通过对样品处理方法的筛选，展开剂的选择，使得鉴别专属性很好，而且方法经济适用、结果快速；含量测定方法中通过对样品、供试品处理方法的筛选，展开剂的选择，使得含量测定方法可以很有效的对产品进行质量检测；指纹图谱测定中分析方法稳定可靠有效，为萱草花制剂和药材的鉴别和质量评价与控制提供了依据。

附图说明

图1HPLC含量测定阴性样品溶液图谱；

图2HPLC含量测定芦丁对照图谱；

图3HPLC含量测定样品图谱；

图4萱草花药材HPLC含量测定样品图谱；

图5萱草花药材HPLC含量测定芦丁对照品图谱；

图6萱草花药材HPLC含量测定阴性样品溶液图谱；

图7系统生成的萱草花对照图谱(3号为芦丁)；

图8不同省份萱草花药材样品的指纹图谱。

具体实施方式

实验例1薄层色谱鉴别实验

1仪器与材料

1.1仪器TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；SD-20岛津液相色谱仪(日本)，四元泵(LC-20ATvp)，SPD-M20A二极管阵列检测器，LC-液相色谱工作站。Sartorius电子分析天平(BT 125D)。KQ3200DE型超声仪(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2材料制剂样品由北京中医药大学制备(同实施例1)；芦丁对照品购自中国食品药品检定研究院(100080-200707)，甲醇为色谱纯(Fisher公司)；水为屈臣氏纯净水；其他试剂均为分析纯。

2鉴别

取制剂(由实施例1制备)0.5g，用适量30％乙醇超声溶解，离心取上清液，作为供试品溶液。另取芦丁标准品，加甲醇制成1mg/ml溶液，作为芦丁对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一聚酰胺板上，以甲醇∶水(1∶1)为展开剂，展开，取出，喷1％三氯化铝展开剂显色，置紫外光灯(365nm)下检视。

3结果

检测色谱中，供试液在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

实验例2紫外分光光度法的总黄酮含量测定实验

1测定波长的选择

芦丁标准溶液和萱草提取液分别按实验方法显色后，在波长4OO～600nm范围内扫描，结果芦丁标准溶液显色后在510nm处有最大吸收，萱草提取液显色在此波长下也有吸收，实验选用510nm为测定波长。

2供试品溶液的制备

精密称取制剂(由实施例1制备)20mg，置10mL量瓶中，加30％乙醇至刻度，超声处理10min，即得。

3对照品溶液的制备

精密称取芦丁对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液，摇匀，即得。

4标准曲线的制备

精密量取对照品溶液0.5ml，1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，6ml，分别置25ml量瓶中，各加水至6.0ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应试剂为空白，在510nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y＝13.65X+0.0128，r＝0.9997，结果表明芦丁浓度在0.004026～0.048312mg/ml与吸光度具有良好的线性关系。

5测定方法

取供试品溶液1ml，置25ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加水至6.0ml”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含芦丁的浓度，计算，即得。

6方法学考察结果

6.1精密度试验

按样品测定项下的方法对批号为20110530的药材处理得供试液，UV法进行测定，一份样品连续测定6次，结果见表1，RSD为0.16％。

表1精密度试验结果

6.2稳定性试验

取同一样品溶液，每隔10分钟测定一次吸光度，样品在1小时内稳定性良好，结果见表2。

表2稳定性试验结果

结果显示，样品在1小时内稳定性良好，RSD值为1.20％。

6.3重现性试验，

按样品测定项下的方法对批号20110530的样品进行测定，共测定6份，结果见表3。

表3重现性试验结果

结果含量平均值为0.6111，RSD值为2.90％。

6.4加样回收率试验

精密称取样品(批号为20110530，总黄酮含量0.61％)1g，共称定6份，分别置25mL量瓶中，加入0.9250mg/ml的芦丁对照品溶液0.4mL，按上述方法制备供试品溶液，测定含量，计算加样回收率，结果见表4。

表4萱草中芦丁加样回收率

结果显示加样回收率平均值为101.28％，RSD值为1.10％。

7样品测定

精密称取三批样品，分别按供试品溶液的制备方法制备，按上述紫外分光光度法测定，结果见下表5：

表5制剂的含量测定

8结论

本发明药物所采用的紫外分光光度法含量测定方法其在0.004026～0.048312mg/ml范围内，r＝0.9997，平均回收率为101.28％，RSD值为1.10％，线性关系良好，稳定性、精密度、重现性等均良好，能够有效控制药物制剂质量。

实验例3HPLC法的芦丁含量测定实验

1色谱条件与系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇∶0.5％冰醋酸溶液(40∶60)为流动相；理论塔板数按芦丁峰计算应不低于3000。

2测定波长的选择

分别取芦丁对照品和样品溶液进液相，DAD检测器检测，芦丁的光谱图显示在254nm和365nm有两个大的吸收峰，但是样品在254nm检测出的峰个数较多，故选择254nm作为测定波长。

3对照品溶液的制备

精密称取芦丁对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.4mg的溶液，摇匀，即得。

4供试品溶液的制备

精密称取制剂(由实施例1制备)20mg，置10mL量瓶中，加30％乙醇至刻度，超声10分钟，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

5测定法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，既得。

6专属性试验

取制剂辅料糊精10mg，置10mL量瓶中，加30％乙醇至刻度，超声10分钟，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得阴性样品溶液。进样10μl，按以上色谱条件测定，结果无干扰峰出现，见图1、2、3。

7线性关系的考察

精密吸取浓度为0.3830mg/ml的芦丁对照品0，1，3，5，7，9，11μl，分别注入高效液相色谱仪，测得峰面积y；以进样量(μg)为横坐标，以峰面积为纵坐标，计算回归方程。

回归方程为Y＝2×10⁶X-34857，r＝1，结果表明芦丁进样量在0～4.2130μg与峰面积具有良好的线性关系。

8精密度试验

取供试品溶液10μl，按以上色谱条件连续进样6次，测定峰面积，结果见表6，RSD为0.74％。

表6精密度试验

9稳定性试验

每隔2小时进样一针，结果显示，供试品溶液在10h内稳定性良好。结果见表7，RSD值为0.32％。

表7稳定性试验

10重复性试验

按样品含量测定项下的方法对批号20110530的样品进行测定，共测定6份，结果见表8，含量平均值为18.60％，RSD值为1.64％。

表8重复性试验

11加样回收率试验

精密称取样品(批号20110530，芦丁含量18.60％)10mg，共测定6份，置10mL量瓶中，加入0.3830mg/ml的芦丁对照品溶液4mL，按样品方法制备供试品溶液，测定含量，计算加样回收率，结果见下表9。

表9样品中芦丁加样回收率

12样品测定结果

精密称取三批样品，分别按供试品溶液的制备方法制备，按以上高效液相色谱法测定，结果见下表10。

表10制剂的含量测定

批号	芦丁含量(％)
		20110530	18.60
20110610-2	16.61
		20110610-3	15.76

13结论

本发明药物所采用的HPLC含量测定方法其在0～4.2130μg范围内，r＝1，平均回收率为97.32％，RSD值为1.44％，线性关系良好，稳定性、精密度、重现性等均良好，能够有效控制本发明药物制剂质量。

实验例4萱草花药材的HPLC含量测定实验

1试药与仪器

SD-20岛津液相色谱仪(日本)，四元泵(LC-20ATvp)，SPD-M20A二极管阵列检测器，LC-液相色谱工作站。Sartorius电子分析天平(BT 125D)。KQ3200DE型超声仪(昆山市超声仪器有限公司)；

萱草花购自北京、河北、广东等省，共10份，药材经60℃减压干燥，粉碎，过60目筛备用；

对照品芦丁购自中国食品药品检定研究院(批号：100080-200707)。甲醇为色谱纯(Fisher公司)；水为屈臣氏纯净水；其他试剂均为分析纯；

2方法与结果

2.1色谱条件Diamonsil ODS C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，以甲醇为流动相A，以0.5％冰醋酸溶液为流动相B，按下表11进行梯度洗脱，流速1mL·min-1，检测波长254nm，柱温25℃。

表11梯度洗脱条件表

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0～20	20→30	80→70
20～30	30	70
			30～70	30→80	70→20

2.2对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.2176mg的溶液，摇匀，即得。

2.3供试品溶液的制备甲醇超声提取和70％乙醇回流提取，芦丁提取率，实验结果表明甲醇超声的芦丁提取率高。比较甲醇超声10min、20min和30min，结果30min提取的量最高。故确定甲醇超声30min。

精密称取本品粉末2g，置25mL量瓶中，加甲醇至刻度，超声处理30分钟，甲醇补足损失的重量，静止放冷，取上清液，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4专属性试验本品为单一药材，所以用供试品溶媒甲醇作为阴性样品溶液。进样10μl，按以上色谱条件测定，无干扰峰出现，结果见图4、5、6。

2.5线性关系的考察精密吸取浓度为0.1969mg/ml的芦丁对照品0，3，5，7，9，11μl，分别注入高效液相色谱仪，测得峰面积y。以进样量(μg)为横坐标，以峰面积为纵坐标，计算回归方程。回归方程为Y＝2×106X，r＝0.9999。结果表明芦丁进样量在0～2.1659μg与峰面积具有良好的线性关系。

2.6精密度试验取样品溶液10μl，按以上色谱条件连续进样6次，测定峰面积，结果RSD为0.42％。

2.7稳定性试验经以上精密度试验，结果显示，供试品溶液在8h内(连续进样6次，每针运行80分钟，共8小时)稳定性良好。

2.8重复性试验按样品含量测定项下的方法对产地北京批号20101002的样品进行测定，共测定6份，RSD为2.77％。

2.9回收率试验精密称取样品(北京产批号20101002，芦丁含量0.09％)1g，共测定6份，置25mL量瓶中，加入0.1969mg/ml的芦丁对照品溶液5mL，按2.3项下方法制备供试品溶液，测定含量，计算加样回收率，结果见下表12。

表12萱草中芦丁加样回收率

2.10样品测定精密称取全国不同产地的供试品2g，按供试品溶液的制备方法制备，按上述色谱条件，进样，进行分析，测定结果见下表13。

表13萱草中芦丁的含量

购(产)地	含量(％)
		北京	0.092
河北保定	0.056
		陕西	0.049
山西	0.040
		山东	0.049
湖南	0.049
		黑龙江	0.049
广东	0.083
		福建	0.063
安徽	0.050

3讨论

本实验建立了萱草中芦丁的HPLC测定法，并测定了不同产地10个样品中芦丁的含量，方法稳定可靠，重复性好，适合于萱草花的质量检测。

实验例5萱草花药材的HPLC指纹图谱实验

1仪器与材料

SD-20高效液相色谱仪(日本岛津公司)；LC-20ATVP四元泵(日本岛津)；芦丁对照品(批号100080-200707，中国药品生物制品检定所)；甲醇为色谱纯(Fisher公司)；水为哇哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯，试验10批样品来源见表14。

表14萱草花药材来源

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱为Agilent(规格C18，4.6*250mm，5μm)流动相甲醇一水(0.5％冰醋酸)梯度洗脱，条件见表15，流速1mL/min-1，检测波长254nm，柱温25℃。

表15梯度洗脱条件

2.2对照品溶液的制备：精密称取芦丁对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.2176mg的溶液，摇匀，即得。

2.3供试品溶液的制备：精密称取样品粉末2g，置25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，超声处理30分钟，甲醇补足损失的重量，静置放冷，取上清液，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4方法学考察

2.4.1精密度试验：精密吸取同一供试品溶液10μl，连续进样6针，测定其RP-HPLC图谱，以芦丁为参照峰(3号峰)，计算各共有峰相对保留时间的RSD值为0.02-2.75，表明方法精密度良好。

2.4.2重现性试验：取同一批萱草花药材6份，按照2.3项下方法制备供试品溶液，分别进样，测得各共有峰相对保留时间的RSD值为0.02-5.94，表明方法重现性良好。

2.4.3.稳定性试验：精密吸取供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8小时进样，测得各共有峰相对保留时间的RSD值为0.03-2.61，表明此方法8小时内稳定。

2.5样品指纹图谱的测定：

按上述液相色谱条件检测10个省的萱草花药材的指纹图谱，分别将10批药材的指纹图谱输入国家药典委员会制定的《中药指纹图谱相似度评价系统研究版(2004A)》中，进行共有峰匹配，最后得到12个共有特征峰，见图7、图8。

2.6相似度评价

2.6.1根据相似度评价软件，选择芦丁做参照峰，各峰相对保留时间、相对峰面积结果，见下表16：

表1610批萱草花药材的HPLC指纹图谱分析结果

2.6.2将10批药材指纹图谱的AIA数据导入《中药指纹图谱相似度评价系统研究版(2004A)》中，计算各指纹图谱与对照图谱的相似度，结果见下表17：

表1710批样品的指纹图谱的相似度结果

样品	S1	S2	S3	S4	S5	S6	S7	S8	S9	S10
											相似度	0.994	0.995	0.995	0.993	0.937	0.944	0.987	0.995	0.999	0.993

3结论

不同省份的10批药材在本实验液相条件下，共12个共有特征峰，该分析方法稳定可靠，为萱草花药材的鉴别和质量评价与控制提供了依据。

实验例6制备方法工艺研究

1仪器和材料

1.1仪器：水浴锅(国华电器有限公司，数显恒温水浴锅)；TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；分析天平(北京普析通用有限公司)；KQ-250B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2材料和药品：甲醇(北京化工分析纯)；水(哇哈哈纯净水，去离子水)；95％医用酒精；其他试剂均为分析纯。芦丁对照品(中国药品生物制品检定所，批号100080-200707)。萱草花，购自北京康仁堂药业有限公司、河北保定市农贸市场、广东产地药材。

2方法与结果

2.1乙醇热回流法的工艺考察

2.1.1正交试验设计：因素水平表见表18.

表18因素水平表

2.1.2试验方法：

2.1.2.1乙醇热回流提取方法：按L₉(3⁴)正交试验安排表中条件，精密称取5克药材，加入一定体积和浓度的乙醇溶剂，置100ml圆底烧瓶中，水浴回流提取。将合并后的提取液定容至100ml，从中精密取2ml药液，定容至25ml，进行总黄酮的含量测定。共处理9份样品。含量测定结果见表19.

2.1.2.2分光光度测定方法：取样品液2ml，置于25ml容量瓶中，加水至6ml，加5％NaNO₂溶液1ml，使混匀，放置6min，加10％Al(NO₃)₃1ml摇匀，放置6min，加4％NaOH10ml，再加水到刻度，摇匀，放置15min，在510nm测定。

2.1.2.3标准曲线的绘制：

精密称量芦丁标准品11.30mg(瓶上写UV按92.5％计)，合芦丁10.4525mg，用甲醇完全溶解至50ml容量瓶中，水定容为0.2091mg/ml的标准品储备液，备用。

精密量取对照品溶液0、1、、2、3、4、5、6ml分别置于25ml容量瓶中，各加水至6ml，照2.2.2项下方法进行测定。以A为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。回归方程为y＝0.0067+0.0118x R＝0.9990.

2.1.2.4加样回收率试验：取样品粉末，精密称取5份，分别加入混合标准溶液1ml，按2.2.1项下优选方法提取、测定，测得平均回收率为98.11％

2.1.2.5精密度测定：取一份样品溶液，重复测定5次，记录吸光度，计算RSD分别为1.91％，表明精密度良好

表19正交设计实验数据

表20方差分析表

SPSS软件统计分析结果显示，各提取条件p值均大于0.05，无显著性差异，结合生产实际情况，综合考虑，乙醇回流提取工艺确定为正交表中提取量最高的条件：A₃B₃C₂，即70％乙醇，8倍量体积，回流2次。

由于乙醇回流法提取浓缩的药材溶液在D101柱分离之前会有大量脂溶性杂质析出，粘稠难以上柱。

2.2.水煮法：用药材8倍量的水，煎煮两次，每次1h。水煮提总黄酮为5.35mg/g。因为水煮法处理的样品液上柱，水溶性杂质提取的量大，对树脂的污染严重，不利于树脂的再生利用，所以此法放弃。

2.3冷浸法：

用30％乙醇浸渍、50％乙醇浸渍、70％乙醇浸渍。

方法：将30g萱草花药材(广东产地)置三角瓶中，加入8倍体积相应浓度乙醇，浸泡24h，滤过；滤渣再加入8倍量乙醇，浸泡24h，滤过；滤渣再加入8倍量乙醇，浸泡24h，滤过。重复操作至浸渍4天；测定每次滤液的总黄酮量。结果见表21。

表21浸渍液的总黄酮含量测定

据上表可知，随乙醇浓度的增加总黄酮的提取量逐渐增大，70％乙醇对总黄酮的提取量最高。故继续考察80％、95％乙醇浸渍对总黄酮提取量的影响。结果见表22。

表22浸渍液总黄酮的含量测定2

结果显示，70％乙醇的浸渍效果最好，浸泡两天总黄酮达到5.3mg/g，即可达到提取率近90％，综合考虑经济因素和提取效率，确定用70％乙醇浸泡2次，每次24小时。

3结论：

乙醇冷浸法提出杂质明显少于热回流法，大生产时浸渍药液不会因放置产生沉淀而堵塞大孔树脂柱子，且总黄酮提取率近90％，故最终提取方案定为：将70％乙醇8倍量室温浸渍两次，每次24小时，合并两次浸渍液，80℃以下减压回收乙醇。

下述实施例均能够实现上述实验例所述的效果

实施例1：胶囊剂

取9900g萱草花，95％乙醇浸泡过夜，95％乙醇加热提取3次，从沸腾开始计时，时间分别为40min，30min，30min，过滤，合并滤液，回收乙醇，得浸膏A；残渣用60％乙醇加热提取2次，每次40min，过滤，合并滤液，回收乙醇，得浸膏B，将浸膏A用蒸馏水稀释后过滤，通过已处理好的AB-8大孔树脂柱，蒸馏水洗至流出液透明，用60％乙醇洗脱3倍柱体积，回收乙醇，得到样1；同法处理浸膏B，得样2，样1为64.3101g，样2为60.9338g，合并样1和样2，干燥，按1∶0-5加入乳糖(或淀粉、或糊精)，混合均匀，制成颗粒或直接罐装于胶囊中即得胶囊剂。

实施例2：颗粒剂

取9900g萱草花，95％乙醇浸泡过夜，95％乙醇加热提取2次，过滤，合并滤液，回收乙醇，得浸膏干燥，加入糊精经常规颗粒剂工艺制成颗粒剂。

实施例3：片剂

取9900g萱草花，85％乙醇提取2次，过滤，合并滤液，回收乙醇，得浸膏A。残渣用60％乙醇加热提取2次，每次40min，过滤，合并滤液，回收乙醇，得浸膏B，将浸膏A用蒸馏水稀释后过滤，通过已处理好的AB-8大孔树脂柱，蒸馏水洗至流出液透明，用60％乙醇洗脱3倍柱体积，回收乙醇，得到样1；同法处理浸膏B，得样2合并样1和样2，加入淀粉、乳糖、糊精经常规工艺制成颗粒后，按常规加入润滑剂，压制成片剂。

实施例4：实施例1胶囊剂鉴别

取本品胶囊内容物约0.5g，用适量30％乙醇超声溶解，离心取上清液，作为供试品溶液。另取芦丁标准品，加甲醇制成1mg/ml溶液，作为芦丁对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一聚酰胺板上，以甲醇∶水(1∶1)为展开剂，展开，取出，喷1％三氯化铝展开剂显色，置紫外光灯(365nm)下检视。

实施例5：实施例1胶囊剂紫外含量测定

供试品溶液的制备：精密称取本品粉末20mg，置10mL量瓶中，加30％乙醇至刻度，超声处理10min，即得。

对照品溶液的制备：精密称取芦丁对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液，摇匀，即得。

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.5ml，1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，6ml，分别置25ml量瓶中，各加水至6.0ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应试剂为空白，在510nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。得回归方程为Y＝13.65X+0.0128，r＝0.9997。

测定方法：取供试品溶液1ml，置25ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加水至6.0ml”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含芦丁的浓度，计算，即得。

实施例6：实施例1胶囊剂HPLC法测定芦丁含量

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇∶0.5％冰醋酸溶液(40∶60)为流动相；检测波长为254nm。理论塔板数按芦丁峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备：精密称取芦丁对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.4mg的溶液，摇匀，即得。

供试品溶液的制备：精密称取本品粉末20mg，置10mL量瓶中，加30％乙醇至刻度，超声10分钟，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，既得。

实施例7：实施例1胶囊检测方法

鉴别：取本品胶囊内容物约0.5g，用适量30％乙醇超声溶解，离心取上清液，作为供试品溶液。另取芦丁标准品，加甲醇制成1mg/ml溶液，作为芦丁对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一聚酰胺板上，以甲醇∶水(1∶1)为展开剂，展开，取出，喷1％三氯化铝展开剂显色，置紫外光灯(365nm)下检视。

紫外含量测定：供试品溶液的制备：精密称取本品粉末20mg，置10mL量瓶中，加30％乙醇至刻度，超声处理10min，即得。对照品溶液的制备：精密称取芦丁对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液，摇匀，即得。标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.5ml，1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，6ml，分别置25ml量瓶中，各加水至6.0ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应试剂为空白，在510nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。得回归方程为Y＝13.65X+0.0128，r＝0.9997。测定方法：取供试品溶液1ml，置25ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加水至6.0ml”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含芦丁的浓度，计算，即得。

HPLC法测定芦丁含量：色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇∶0.5％冰醋酸溶液(40∶60)为流动相；检测波长为254nm。理论塔板数按芦丁峰计算应不低于3000。对照品溶液的制备：精密称取芦丁对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.4mg的溶液，摇匀，即得。供试品溶液的制备：精密称取本品粉末20mg，置10mL量瓶中，加30％乙醇至刻度，超声10分钟，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，既得。

实施例8：萱草含量测定

萱草药材经60℃减压干燥，粉碎，过60目筛备用；

色谱条件Diamonsil ODS C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，以甲醇为流动相A，以0.5％冰醋酸溶液为流动相B，按表进行梯度洗脱，流速1mL·min-1，检测波长254nm，柱温25℃。

梯度洗脱条件表

对照品溶液的制备：精密称取芦丁对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.2176mg的溶液，摇匀，即得。

供试品溶液的制备：精密称取本品粉末2g，置25mL量瓶中，加甲醇至刻度，超声处理30分钟，甲醇补足损失的重量，静止放冷，取上清液，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

实施例9：萱草花HPLC指纹图谱

色谱条件：色谱柱为Agilent(规格C18，4.6*250mm，5μm)流动相甲醇一水(0.5％冰醋酸)梯度洗脱，条件见表流速1mL/min-1，检测波长254nm，柱温25℃。

梯度洗脱条件

对照品溶液的制备：精密称取芦丁对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.2176mg的溶液，摇匀，即得。

供试品溶液的制备：精密称取样品粉末2g，置25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，超声处理30分钟，甲醇补足损失的重量，静置放冷，取上清液，0.22μm微孔滤膜滤过，取滤液，即得；

按上述方法色谱条件测定，记录指纹图谱

Claims (10)

1.萱草花制剂的检测方法，其特征在于该方法包括如下含量测定方法：

测定条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以30-50∶50-70的甲醇∶0.5％冰醋酸溶液为流动相；检测波长为254nm，理论塔板数按芦丁峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备：取芦丁对照品，加甲醇制成对照品溶液；

供试品溶液的制备：取萱草花制剂加10-50％乙醇超声5-20分钟，过滤，取滤液，即得；

测定法：分别吸取相同体积的对照品与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于该方法还包括如下方法中的一种或几种：

A、薄层色谱鉴别

取萱草花制剂，用10-50％乙醇溶解，离心取上清液，作为供试品溶液；

取芦丁标准品，加甲醇制成1mg/ml溶液，作为芦丁对照品溶液；

吸取等量供试品及对照品溶液，分别点于同一聚酰胺板上，以1-5∶1-5的甲醇∶水为展开剂，展开，取出，喷0.5％-2％三氯化铝展开剂显色，置300-400nm紫外光灯下检视；

B、紫外分光光度法含量测定

供试品溶液的制备：萱草花制剂加10-50％乙醇提取；

对照品溶液的制备：称取芦丁对照品，加甲醇制成每1mL含0.1-0.4mg的溶液；

标准曲线的制备：分别量取不同容量的对照品溶液，分别置容器中，各容器中先后相同加入3％-8％亚硝酸钠溶液、4％-15％硝酸铝溶液、氢氧化钠试液；在波长400～600nm内选择波长，测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程；

取供试品溶液，置量瓶中，先后相同加入3％-8％亚硝酸钠溶液、4％-15％硝酸铝溶液、氢氧化钠试液；按标准曲线选取的紫外波长测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含芦丁的浓度，计算，即得；

C、HPLC法含量测定

测定条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以30-50∶50-70的甲醇∶0.5％冰醋酸溶液为流动相；检测波长为200-300nm，理论塔板数按芦丁峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备：称取芦丁对照品，加甲醇制成对照品溶液；

供试品溶液的制备：称取萱草花制剂加10-50％乙醇提取5-20分钟，过滤，取滤液，即得；

测定法：分别吸取相同体积的对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于该方法中，

流动相为：甲醇∶0.5％冰醋酸溶液＝40∶60；对照品溶液由芦丁加甲醇制成每1mL含0.4mg的溶液。

4.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于该方法中对原药材的HPLC指纹图谱检测方法中：流速1mL/min-1，检测波长254nm，柱温25℃。

5.如权利要求1-4任一所述的检测方法，其特征在于该方法中所述萱草花制剂为：萱草花单味药提取后，所得提取物按常规的制剂工艺制成临床可接受的任意剂型。

6.萱草花的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于该方法为：

色谱条件：C18色谱柱，流动相为甲醇-0.5％冰醋酸水溶液梯度洗脱，梯度洗脱的条件为：第0-20min：甲醇为20％，0.5％的冰醋酸水溶液为80％；第20-30min：甲醇为30％，0.5％的冰醋酸水溶液为70％；第30-70min：甲醇为30％，0.5％的冰醋酸水溶液为70％；第70min至最后：甲醇为80％，0.5％的冰醋酸水溶液为20％，流速0.5-1.5mL/min^-1，检测波长200-300nm，柱温20-30℃；

对照品溶液的制备：称取芦丁对照品加甲醇制成对照品溶液；

供试品溶液的制备：称取萱草花置容量瓶中，加甲醇，超声处理20-45分钟，静置放冷，取上清液，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

按上述方法色谱条件测定，记录指纹图谱。

7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于该方法中：

指纹图谱包括12个共有特征峰，以3号为芦丁为参照峰，相对保留时间及相对峰面积分别为：1号峰相对保留时间为0.232，相对峰面积为：0.051-0.278；2号峰相对保留时间为0.936，相对峰面积为：0.020-0.212；4号峰相对保留时间为1.039，相对峰面积为：0.023-0.041；5号峰相对保留时间为1.079，相对峰面积为：0.008-0.178；，6号峰相对保留时间为1.095，相对峰面积为：0.005-0.029；7号峰相对保留时间为1.115，相对峰面积为：0.045-0.367；8号峰相对保留时间为1.135，相对峰面积为：0.049-0.269；9号峰相对保留时间为1.159，相对峰面积为：0.004-0.023；10号峰相对保留时间为1.171，相对峰面积为：0.003-0.014；11号峰相对保留时间为1.218，相对峰面积为：0.012-0.062；12号峰相对保留时间为1.326，相对峰面积为：0.002-0.313。

8.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于该方法中：

流速为：1mL·min-1；检测波长为：254nm；柱温为25℃。

9.萱草花的检测方法，其特征在于该方法为：

色谱条件C18色谱柱，甲醇-0.5％冰醋酸溶液为流动相二元梯度洗脱，梯度洗脱的条件为：第0-20min：甲醇为20％→30％，0.5％的冰醋酸水溶液为80％→70％；第20-30min：甲醇为30％，0.5％的冰醋酸水溶液为70％；第30-70min：甲醇为30％→80％，0.5％的冰醋酸水溶液为70％→20％；流速0.5-1.5mL·min-1，检测波长200-300nm，柱温20-30℃；

对照品溶液的制备：称取芦丁对照品加甲醇制成对照品溶液；

供试品溶液的制备：称取萱草花置容量瓶中，加甲醇，超声处理20-45分钟，静置放冷，取上清液，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别吸取相同体积的对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，既得。

10.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于该方法中：

流速为：1mL·min-1；检测波长为：254nm；柱温为25℃。

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