CN112552387A - 一种黄花菜抗肿瘤活性蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物蛋白的制备和应用领域，具体属于一种黄花菜抗肿瘤活性蛋白及其制备方法和应用。具体制备方法是将黄花菜剪碎，加入蛋白提取液4℃搅拌过夜，随后加入预冷的丙酮低温沉淀蛋白，离心后用蛋白提取液溶解得到黄花菜粗蛋白；采用硫酸铵分级沉淀和阳离子交换色谱对黄花菜粗蛋白中抗肿瘤活性组分进行分离和纯化，得到黄花菜抗肿瘤活性蛋白。该蛋白可明显抑制肝癌HepG2和Bel‑7402细胞、大肠癌DLD1细胞、乳腺癌MCF‑7细胞、宫颈癌HeLa细胞和卵巢腺癌SKOV3细胞的存活，可以在制备抗肿瘤药物中应用。

Description

一种黄花菜抗肿瘤活性蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及植物蛋白的制备和应用领域，具体属于一种黄花菜抗肿瘤活性蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
黄花菜(Hemerocallis citrina Baroni)，属百合科多年生草本植物，又名金针菜、忘忧草、萱草，是一种营养价值很高的保健蔬菜。黄花菜不仅可作为一道高档菜肴加以品尝，更主要的是它独特的营养成份可制成多种健脑、降压、利尿、安神、防癌等补品。黄花菜含有糖类、蛋白质、维生素、无机盐及多种人体必需的氨基酸。研究发现，黄花菜在抗肿瘤方面表现出一定的潜能。黄花菜提取物如2-羟基大黄酚、大黄酸等可以抑制癌细胞的增殖，此外，黄花菜中含有的秋水仙碱对细胞有丝分裂有明显抑制作用，能抑制癌细胞的增长，在临床上已用于乳腺癌、皮肤癌、白血病的治疗。黄花菜在我国资源丰富，具有进一步开发应用的价值。到目前为止，国内外对黄花菜的化学和药理研究不够系统和深入。并且国内外关于黄花菜抗肿瘤活性蛋白的研究报道较少。
发明内容
针对上述问题本发明的目的在于提供一种黄花菜抗肿瘤活性蛋白及其制备方法，以及该蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
本发明提供一种黄花菜抗肿瘤活性蛋白，通过包括如下步骤的方法制得：
步骤1，取干黄花菜，剪碎后，加入蛋白提取液，4℃下浸泡并搅拌过夜，离心后取上清液，即为黄花菜蛋白粗提液；
步骤2，在黄花菜蛋白粗提取液中边搅拌边加入5倍体积的-20℃预冷的丙酮，-20℃沉淀蛋白1-2小时，4℃离心30min，收集沉淀，用丙酮清洗沉淀2-3次，沉淀风干，得到黄花菜粗蛋白；
步骤3，将黄花菜粗蛋白用pH 7.4的Tris-Hcl缓冲液在冰上溶解，离心30min后取上清液，按0℃下的硫酸铵溶液饱和度计算表，加入60％饱和度的硫酸铵粉末，充分搅拌溶解后，静置40min，离心30分钟收集沉淀，沉淀用pH 7.4的Tris-Hcl缓冲液溶解，然后将其装入透析袋中，透析24小时，浓缩后冷冻干燥，即得到黄花菜抗肿瘤粗蛋白；
步骤4，将上述黄花菜抗肿瘤粗蛋白溶解于Tris-Hcl缓冲液中，离心后取上清液，加入到SP阳离子交换层析柱，用pH 7.4的Tris-Hcl缓冲液洗柱子，再用0.02mol/L和0.04mol/L的Nacl溶液洗脱后，收集洗脱液；
步骤5，将上述洗脱液再一次过SP阳离子交换层析柱，用pH 7.4的Tris-Hcl缓冲液洗柱子，再用0.02mol/L和0.04mol/L的Nacl溶液洗脱后，收集洗脱液，然后浓缩，即为黄花菜抗肿瘤活性蛋白。
进一步，所述步骤1中黄花菜和蛋白提取液的质量比为1:3～6，所述蛋白提取液为pH7.4的磷酸缓冲液。
优选的，所述步骤1中黄花菜和蛋白提取液的质量比为1:5。
更进一步，所述步骤1、3、4、5均在0-4℃条件下进行。
本发明还提供一种黄花菜抗肿瘤活性蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
本发明获得的黄花菜抗肿瘤活性蛋白经体外抗肿瘤活性检测，该蛋白具有良好的抗肿瘤细胞的活性，可明显的抑制肝癌HepG2和Bel-7402细胞、大肠癌DLD1细胞、乳腺癌MCF-7细胞、宫颈癌HeLa细胞和卵巢腺癌SKOV3细胞的存活，而对正常细胞没有明显毒副作用，可以在制备抗肿瘤药物中应用。
附图说明
图1黄花菜抗肿瘤活性蛋白SDS-PAGE电泳图(经SP阳离子交换层析柱纯化后所得纯蛋白样品，上样量为5μg；图中：M，标准分子量；1，粗蛋白；2，60％饱和度的硫酸铵沉淀蛋白；3，第一次SP阳离子交换层析洗脱蛋白；4，目的蛋白)。
图2黄花菜抗肿瘤活性蛋白对细胞存活的影响。图中*代表P<0.05，**代表P<0.01。
具体实施方式
下面结合本发明实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行具体、详细的说明。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。
实施例1
黄花菜抗肿瘤活性蛋白的制备，包括如下步骤：
第一步：取干黄花菜200g，剪刀剪碎后，加入1L的磷酸缓冲液(1L的磷酸缓冲液体系里含8g NaCl，0.2g KCl，3.63g Na2HPO4.12H2O，0.24g KH2PO4，pH7.4)，4℃下浸泡并搅拌过夜，4℃，11000rpm离心30min后取上清液，即为黄花菜蛋白粗提液。离心后的滤渣可重复提取1-2次；
第二步：向第一步黄花菜蛋白粗提取液中加入5倍体积-20℃提前预冷的丙酮，边加边搅拌，将其置于-20℃冰箱放置2h沉淀，4℃，11000rpm离心30min，弃上清，收集沉淀，用丙酮清洗沉淀3次，沉淀风干，获得黄花菜粗蛋白。
第三步：将第二步中得到的黄花菜粗蛋白用pH 7.4的Tris-Hcl缓冲液在冰上溶解，离心(4℃，11000rpm离心30min，)后取上清液，按硫酸铵溶液饱和度计算表(0℃)向上清液中加入60％饱和度的硫酸铵粉末，充分搅拌溶解后，静置40min，离心(4℃，11000rpm离心30min)，收集沉淀，用PH7.4的Tris-Hcl缓冲液溶解，离心(4℃，12000rpm离心30min)后收集上清，然后将其装入透析袋中，置于pH 7.4的Tris-Hcl缓冲液中，在4℃下过夜透析，浓缩后冷冻干燥，即得到抗肿瘤粗蛋白；
第四步：将第三步黄花菜抗肿瘤粗蛋白溶解于Tris-Hcl缓冲液中，离心后取上清液，过SP阳离子交换层析柱，用pH 7.4的Tris-Hcl缓冲液洗柱子，再用0.02mol/L和0.04mol/L的Nacl溶液洗脱后，收集洗脱液。
第五步：将第四步洗脱液再一次过SP阳离子交换层析柱，用pH 7.4的Tris-Hcl缓冲液冲洗柱子，再用0.02mol/L和0.04mol/L的Nacl溶液洗脱后，收集洗脱液，然后浓缩后即为黄花菜抗肿瘤活性蛋白。
第一步、第三步、第四步、第五步均在0-4℃条件下进行。
采用SDS-PAGE凝胶电泳技术，通过与标准分子量对比，得到黄花菜抗肿瘤活性蛋白的分子量约为21kDa(图1)。
实施例2
黄花菜抗肿瘤活性蛋白对肿瘤细胞存活的影响
将对数生长期的肝癌HepG2和Bel-7402细胞、正常肝细胞HL7702、大肠癌DLD1细胞、乳腺癌MCF-7细胞、宫颈癌HeLa细胞和卵巢腺癌SKOV3细胞，以5×103个/孔传入96孔培养板。37℃，含5％的CO2培养箱孵育24h后，分别加入实施例1的黄花菜抗肿瘤活性蛋白，使终浓度分别为2.5μg/mL、5μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL，每个浓度设六个复孔，并用含相同体积Tris-Hcl缓冲液的培养基作为对照。孵育24h后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，继续孵育4h后终止培养。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150μL DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。在酶标仪上570nm波长处，测定各孔光吸收值。
图2结果表明：黄花菜抗肿瘤活性蛋白可明显抑制肝癌HepG2和Bel-7402细胞、大肠癌DLD1细胞、乳腺癌MCF-7细胞、宫颈癌HeLa细胞和卵巢腺癌SKOV3细胞的存活，而对人正常肝细胞HL7702生长基本无影响。

Claims (5)

1.一种黄花菜抗肿瘤活性蛋白，其特征在于，通过包括如下步骤的方法制得：
步骤1，取干黄花菜，剪碎后，加入蛋白提取液，4℃下浸泡并搅拌过夜，离心30min后取上清液，即为黄花菜蛋白粗提液；
步骤2，在黄花菜蛋白粗提取液中边搅拌边加入5倍体积的-20℃预冷的丙酮，-20℃沉淀蛋白1-2小时，4℃离心30min，收集沉淀，用丙酮清洗沉淀2-3次，沉淀风干，得到黄花菜粗蛋白；
步骤3，将黄花菜粗蛋白用pH 7.4的Tris-Hcl缓冲液在冰上溶解，离心30min后取上清液，按0℃下的硫酸铵溶液饱和度计算表，加入60％饱和度的硫酸铵粉末，充分搅拌溶解后，静置40min，离心30分钟收集沉淀，沉淀用pH 7.4的Tris-Hcl缓冲液溶解，离心，收集上清，然后将其装入透析袋中，透析24小时，浓缩后冷冻干燥，即得到黄花菜抗肿瘤粗蛋白；
步骤4，将上述黄花菜抗肿瘤粗蛋白溶解于Tris-Hcl缓冲液中，离心后取上清液，加入到SP阳离子交换层析柱，用pH 7.4的Tris-Hcl缓冲液洗柱子，再用0.02mol/L和0.04mol/L的Nacl溶液洗脱后，收集洗脱液；
步骤5，将上述洗脱液再一次过SP阳离子交换层析柱，用pH 7.4的Tris-Hcl缓冲液洗柱子，再用0.02mol/L和0.04mol/L的Nacl溶液洗脱后，收集洗脱液，然后浓缩，即为黄花菜抗肿瘤活性蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种黄花菜抗肿瘤活性蛋白，其特征在于：所述步骤1中黄花菜和蛋白提取液的质量比为1:3-6，所述蛋白提取液为pH7.4的磷酸缓冲液。
3.根据权利要求1所述的一种黄花菜抗肿瘤活性蛋白，其特征在于：所述步骤1中黄花菜和蛋白提取液的质量比为1:5。
4.根据权利要求1所述的一种黄花菜抗肿瘤活性蛋白，其特征在于：所述步骤1、3、4、5均在0-4℃条件下进行。
5.一种权利要求1所述的黄花菜抗肿瘤活性蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
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