CN111481564B - 桑葚多糖mfp-90-2在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

桑葚多糖mfp-90-2在制备抗肿瘤药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了桑葚多糖MFP‑90‑2在制备抗卵巢癌和胰腺癌的药物中的应用。MFP‑90‑2对OVCAR‑3细胞的增殖表现出了较好的抑制活性，且具有明显的量效关系和时间依赖性，还具有抑制OVCAR‑3细胞迁移的作用，与其他植物多糖相比，MFP‑90‑2的抑制活性更好或者抑制活性相当而作用时间更短；其作为天然提取物，原料丰富易得，制备方法成熟稳定，为安全、低毒、高效的抗肿瘤药物的开发与应用奠定了基础；本发明也为桑葚作为功能性食品的开发和商业运用之外，提供了一个新的产业开发和应用方向。

Description

桑葚多糖MFP-90-2在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明属于植物提取物的应用技术领域，具体涉及桑葚多糖MFP-90-2在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
目前，最常见的癌症治疗方法基本是将手术切除与术后放疗、化疗相结合的综合治疗方案，而市场上的化学治疗药物通常不具有特异性，在杀死肿瘤细胞的同时也会对正常的机体细胞造成不可磨灭的损伤。当前主要研究方向是从植物中发现具有一定生物活性的先导化合物。植物多糖是由植物细胞代谢产生的聚合度超过十的大分子化合物，因其良好的生物活性和安全性而引起了国内外学者的关注。研究表明，植物多糖具有多种生物活性，如抗氧化剂，降血，降血脂，免疫调节等，也是潜在的抗肿瘤活性物质。植物多糖作为一种潜在的抗肿瘤先导化合物，具有很高的安全性，具有深入研究的意义和价值。
桑葚(Mori Fructus)，具有滋阴补血、生津润燥的药效，用于肝肾阴虚、眩晕耳鸣、心悸失眠、须发早白、津伤口渴、内热消渴、肠燥便秘等功效，记载于2015年版药典，并进入了药食同源原料目录(2017)中。桑葚多糖是桑葚中重要的生物活性物质，具有如抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗菌，降血糖、降血脂以及免疫调节等多种生理活性。桑葚产量大，易于获得，其中多糖组分的生物活性较为广泛，因而受到医药、保健功能食品研发方向的科研人员的关注，是新药研发的主要目标之一。现有治疗癌症的手段虽然能显著减轻患者的相关症状，但治疗成本高、复发率高，给患者带来极高的治疗负担，鉴于市场上常见化疗药物的不足，新型、低毒、高效的抗肿瘤药物的研究与开发具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供桑葚多糖MFP-90-2在制备抗肿瘤药物中的应用，其首次被发现具有抑制OVCAR-3细胞的活性，作为天然提取物，高效、安全，原料丰富易得，且制备方法成熟稳定。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
桑葚多糖MFP-90-2在制备抗卵巢癌及胰腺癌药物中的应用。
前述桑葚多糖MFP-90-2的应用中，所述桑葚多糖MFP-90-2的单糖组成为甘露糖5.51％-6.09％、鼠李糖14.63％-16.17％、葡糖醛酸2.76％-3.05％、半乳糖醛酸2.85％-3.15％、葡萄糖34.68％-38.33％、木糖20.14％-22.26％和阿拉伯糖14.44％-15.96％。
前述桑葚多糖MFP-90-2的应用中，所述桑葚多糖MFP-90-2的制备方法如下：将桑葚粉碎，依次用索氏提取法进行脱脂，用热水浸提法提取桑葚多糖，用Sevag法脱蛋白，再以低浓度乙醇分级沉淀法分离得不同组分桑葚粗多糖，然后采用DEAE-52纤维素柱层析对乙醇分级沉淀时乙醇浓度为90％的桑葚粗多糖MFP-90进行纯化并除掉其中色素，其中用0.05mol·L-1NaCl洗脱得到的即桑葚多糖MFP-90-2。
前述桑葚多糖MFP-90-2的应用中，所述桑葚多糖MFP-90-2的制备方法具体包括以下步骤：
(1)桑葚粉碎、脱脂：称取桑葚样品，粉碎成粉末，按料液比1∶2加入石油醚，用索氏提取法对其进行脱脂处理，每次2h，脱脂3次，脱脂后滤掉废液，得脱脂桑葚；
(2)桑葚多糖的提取：采用热水浸提法，将脱脂桑葚置于洁净容器中，按料液比1∶3加入蒸馏水，于90℃恒温条件下进行热水浸提，2h后用纱布过滤，保存滤液，滤渣继续在相同条件下进行热水浸提，反复3次并合并滤液，将滤液离心去除小颗粒杂质，收集上清液，在60℃条件下用旋转蒸发仪对其进行浓缩，即得桑葚多糖提取物，备用；
(3)桑葚多糖提取物脱蛋白：采用Sevag法，将桑葚多糖提取物置于分液漏斗中，按体积比1∶2加入V三氯甲烷∶V正丁醇＝4∶1的Sevag试剂，充分摇匀，静置，直至分液漏斗中的液体分层完毕后除去底层有机溶剂及中间层蛋白质，收集上层液，反复操作，直至分液漏斗中的溶液无明显絮状物沉淀析出为止，将收集的上层液离心除去蛋白质，收集上清液，备用；
(4)桑葚粗多糖的制备：采用低浓度乙醇分级沉淀的方法，向步骤(3)所得上清液中加入无水乙醇至乙醇浓度为90％，将其静置于4℃环境中24h，然后离心，收集上清液并获取沉淀，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤沉淀3次，真空冷冻干燥，即得桑葚粗多糖MFP-90；
(5)桑葚多糖的纯化：采用DEAE-52纤维素柱层析对MFP-90进行纯化并除掉其中色素，具体为：准确称取MFP-90，加入蒸馏水搅拌溶解，配制浓度为6mg·mL-1的MFP-90溶液，将20mL 6mg·mL-1的MFP-90溶液依次用300mL蒸馏水和300mL 0.05mol·L-1NaCl经DEAE-52纤维素柱进行分段洗脱，每段每管各收集10mL洗脱液，收集30管，采用苯酚-硫酸法对每段洗脱液进行紫外跟踪测定，直至无多糖为止，按照吸收峰情况合并每组分，浓缩，透析，真空冷冻干燥，得桑葚多糖，其中用0.05mol·L-1NaCl洗脱得到的即桑葚多糖MFP-90-2。
前述桑葚多糖MFP-90-2的应用中，所述卵巢癌为OVCAR-3细胞相关的卵巢癌；所述胰腺癌为OVCAR-3细胞相关的胰腺癌。
发明人偶然发现桑葚多糖对于某种肿瘤细胞具有良好的抑制其增殖的作用，因而开展了相关研究。本发明重点研究了桑葚多糖MFP-90-2对人卵巢癌细胞OVCAR-3的抑制活性，并研究了其抑制OVCAR-3细胞迁移能力，为寻找安全有效的抗肿瘤化合物提供了数据支持。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了桑葚多糖MFP-90-2在制备抗卵巢癌和胰腺癌的药物中的应用。桑葚多糖MFP-90-2在制备抗卵巢癌和胰腺癌药物中的用途为首次发现，其对OVCAR-3细胞的增殖表现出了较好的抑制作用，且具有明显的量效关系和时间依赖性，还具有抑制OVCAR-3细胞迁移的作用，与其他植物多糖相比，MFP-90-2的抑制活性更好或者抑制活性相当而作用时间更短。而且MFP-90-2作为天然提取物，原料丰富易得，制备方法成熟稳定，为安全、低毒、高效的抗肿瘤药物的开发与应用奠定了基础。本发明也为桑葚作为功能性食品的开发和商业运用之外，提供了一个新的产业开发和应用方向。
附图说明
图1是MTT法测定桑葚多糖MFP-90-2等(2.0mg·mL-1)对OVCAR-3细胞增殖的抑制作用；
图2是MTT法测定不同浓度的桑葚多糖MFP-90-2对OVCAR-3细胞生长抑制作用的量效关系；
图3是桑葚多糖MFP-90-2抑制OVCAR-3细胞迁移作用对比图(40×)。
具体实施方式
实施例1：桑葚多糖MFP-90-2的制备：
将桑葚粉碎，依次用索氏提取法进行脱脂，用热水浸提法提取桑葚多糖，用Sevag法脱蛋白，再以低浓度乙醇分级沉淀法分离得不同组分桑葚粗多糖，然后采用DEAE-52纤维素柱层析对乙醇分级沉淀时乙醇浓度为90％的桑葚粗多糖MFP-90进行纯化并除掉其中色素，其中用0.05mol·L-1NaCl洗脱得到的即桑葚多糖MFP-90-2。MFP-90-2的单糖组成为甘露糖5.8％、鼠李糖15.4％、葡糖醛酸2.9％、半乳糖醛酸3.0％、葡萄糖36.5％、木糖21.2％和阿拉伯糖15.2％。
实施例2：桑葚多糖MFP-90-2的制备，具体包括以下步骤：
(1)桑葚粉碎、脱脂：称取桑葚样品，粉碎成粉末，按料液比1∶2加入石油醚，用索氏提取法对其进行脱脂处理，每次2h，脱脂3次，脱脂后滤掉废液，得脱脂桑葚；
(2)桑葚多糖的提取：采用热水浸提法，将脱脂桑葚置于洁净容器中，按料液比1∶3加入蒸馏水，于90℃恒温条件下进行热水浸提，2h后用纱布过滤，保存滤液，滤渣继续在相同条件下进行热水浸提，反复3次并合并滤液，将滤液离心(3500r·min-1,10min)去除小颗粒杂质，收集上清液，在60℃条件下用旋转蒸发仪对其进行浓缩，即得桑葚多糖提取物，备用；
(3)桑葚多糖提取物脱蛋白：采用Sevag法，将桑葚多糖提取物置于分液漏斗中，按体积比1∶2加入V三氯甲烷∶V正丁醇＝4∶1的Sevag试剂，充分摇匀，静置，直至分液漏斗中的液体分层完毕后除去底层有机溶剂及中间层蛋白质，收集上层液，反复操作，直至分液漏斗中的溶液无明显絮状物沉淀析出为止，将收集的上层液离心(3500r·min-1,10min)除去蛋白质，收集上清液，备用；
(4)桑葚粗多糖的制备：采用低浓度乙醇分级沉淀的方法，向步骤(3)所得上清液中加入无水乙醇至乙醇浓度为90％，将其静置于4℃环境中24h，然后离心(3500r·min-1,10min)，收集上清液并获取沉淀，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤沉淀3次，真空冷冻干燥，即得桑葚粗多糖MFP-90；
(5)桑葚多糖的纯化：采用DEAE-52纤维素柱层析对MFP-90进行纯化并除掉其中色素，具体为：准确称取MFP-90，加入蒸馏水搅拌溶解，配制浓度为6mg·mL-1的MFP-90溶液，将20mL6mg·mL-1的MFP-90溶液依次用300mL蒸馏水和300mL 0.05mol·L-1NaCl经DEAE-52纤维素柱(3×50cm)进行分段洗脱(流速2.5mL·min-1)，每段每管各收集10mL洗脱液，收集30管，采用苯酚-硫酸法对每段洗脱液进行紫外跟踪测定，直至无多糖为止，按照吸收峰情况合并每组分，浓缩，透析，真空冷冻干燥，得桑葚多糖，其中用0.05mol·L-1NaCl洗脱得到的即桑葚多糖MFP-90-2；MFP-90-2的单糖组成为甘露糖5.6％、鼠李糖15.5％、葡糖醛酸2.8％、半乳糖醛酸2.9％、葡萄糖37.2％、木糖21.1％和阿拉伯糖14.9％。
实验例：
主要缩写符号说明
Figure GDA0003794119610000041
Figure GDA0003794119610000051
一、桑葚多糖MFP-90-2抑制OVCAR-3细胞增殖活性的研究
1.1试验材料与仪器
1.1.1试验材料与试剂
桑葚多糖经分离纯化、化学修饰得到：MPF-30-1、S-MPF-50、MPF-70-1、MPF-90-1和MPF-90-2。研究中所使用的桑葚多糖MFP-90-2的具体信息见表1-1：
表1-1桑葚多糖MFP-90-2信息
Figure GDA0003794119610000052
DMEM basic(1X)，RPMI 1640(1X)，MEM basic(1X)，Ham’sF-12K(1X)细胞培养基，胰蛋白酶-EDTA，赛默飞(中国)世尔科技有限公司；
3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(MTT)、dimethyl sulfoxide(DMSO，细胞培养级)，索莱宝生物科技有限公司；
胎牛血清，PBS，100U·mL-1链霉素和青霉素(细胞培养级)，生物科技有限公司。
1.1.2试验主要仪器设备
分析天平，二氧化碳培养箱，细胞计数仪，酶标仪，离心机，超净工作台，液氮罐等。
1.1.3试验中使用的细胞
人卵巢癌NCI：OVCAR-3细胞，普诺赛生命科技有限公司。
1.2实验方法
1.2.1细胞复苏
将无菌室中的恒温水浴锅事先预热至37℃，将细胞从液氮罐中迅速取出，尽快放入水浴锅中，使冻存管内的液体在3min内全部溶解，消毒后进入超净工作台，将冻存管中溶解后的细胞悬液复悬后加入放有5mL相对应细胞培养基的10mL离心管中，复悬后放入离心机中，1000r·min-1离心5min。吸弃上清液，加入1mL培养基后复悬，将得到的细胞悬液放入T25培养瓶中，再向其中加入2mL培养基振荡瓶身，使细胞悬液均匀覆盖底部后，放入37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。培养24h、细胞贴壁后，将培养基吸弃，加入2mL PBS溶液，轻轻振荡，吸弃PBS溶液，重复两次后加入3mL完全培养基，放入37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。培养至细胞密度为80-90％后，可以进行传代(防止因细胞密度过高而引起的营养不足或生存空间过小，进而引发细胞凋亡)。
1.2.2细胞传代与冻存
细胞密度长至80-90％时，可以进行细胞传代或冻存。将细胞培养瓶从细胞培养箱中取出，吸弃旧细胞培养基，加入2mL PBS溶液，轻轻振荡，吸弃PBS溶液，重复两次后加入1mL胰蛋白酶，放入37℃，5％CO2细胞培养箱中进行孵育，不同细胞孵育时间如表1-2所示。孵育结束后，迅速向其中加入2mL细胞完全培养基以终止消化，并轻柔吹打细胞培养瓶底部，将底部的细胞完全吹打下来后，将得到细胞悬液吸至10mL离心管中，1000r·min-1离心5min。
(1)传代
将上清液吸弃，加入2mL细胞完全培养基，复悬后，将得到的细胞悬液放入T25培养瓶中，再向其中加入2mL细胞完全培养基振荡瓶身，使细胞悬液均匀覆盖底部后，放入37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。
表1-2 OVCAR-3细胞加入胰蛋白酶后的孵化时间
Figure GDA0003794119610000061
(2)冻存
将上清液吸弃，加入1mL细胞冻存液(90％胎牛血清+10％DMSO)，复悬后加入2mL细胞冻存管中，写上冻存的细胞种类、冻存日期后，进行梯度程序降温(4℃放置30min；-20℃放置30min，-80℃放置30min后，放入-160℃液氮罐)即可。
1.2.3细胞培养
OVCAR-3细胞在培养过程中的换液频率、完全培养基配制方法如表1-3所示。细胞均放于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。细胞中处于对数生长期的将用于进一步的实验。
表1-3肿瘤细胞换液频率、完全培养基配制方法
Figure GDA0003794119610000062
1.2.4桑葚多糖MFP-90-2抗肿瘤活性初筛
通过MTT法对桑葚多糖及衍生物的抗肿瘤活性进行初步筛选，具体步骤如下。选择在对数生长期的肿瘤细胞，参考表1-2用1mL0.25％胰蛋白酶对各细胞进行消化，消化对应时长后，加入2mL含有10％胎牛血清的细胞培养基以终止消化，并轻柔吹打细胞培养瓶底部，将底部的细胞完全吹打下来后，将得到细胞悬液吸至10mL离心管中，1000r·min-1离心5min。吸弃细胞上清液，加入上述细胞培养基复悬后测定细胞浓度，并将细胞浓度调整至1×105个·mL-1。96孔板四周加入100μL PBS溶液，选取五个孔为对照组，仅含细胞培养基；将100μL细胞悬浮液接种至96孔板剩余孔中，放入培养箱中孵育24h。24h后，吸弃细胞上清液，将贴壁后的细胞分为以下几组：①对照组：加入无血清培养基；②实验组：加入若干桑葚多糖及其衍生物溶液(2.0mg·mL-1)处理。24h后，将5mg·mL-1 20μL MTT溶液添加到每个孔中，再孵育4h。将形成的紫色的甲瓒晶体溶解在150μL的DMSO中，振荡10min后，在490nm处，使用酶标仪读取各孔的吸光度值，并通过使用以下公式计算抑制百分比。
Figure GDA0003794119610000071
上述Aexperiment代表的是实验组的吸光度值；Ablank代表的是对照组的吸光度值；Acontrol代表的是对照组的吸光度值。
选择抑制率大于60％的桑葚多糖及其衍生物进行进一步的研究。
1.2.5桑葚多糖MFP-90-2抗肿瘤活性的量效关系研究
通过MTT法研究初筛后的桑葚多糖MFP-90-2抗肿瘤活性的量效关系，具体步骤如下：选择在对数生长期的肿瘤细胞进行实验，参照1.2.4进行细胞铺板，将贴壁后的细胞分为以下2组：①对照组：加入无血清培养基；②实验组：加入有活性的桑葚多糖MFP-90-2溶液(15.625，31.25，62.5，125，250，500，1000，2000μg·mL-1)处理。24h后，将5mg·mL-120μLMTT溶液添加到每个孔中，再孵育4h。将形成的紫色的甲瓒晶体溶解在150μL的DMSO中，振荡10min后，在490nm处，使用酶标仪读取各孔的吸光度值，使用公式(1)计算抑制百分比，并通过不同浓度桑葚多糖MFP-90-2溶液的抑制率计算MFP-90-2对于相应肿瘤细胞的IC50值。
1.2.6桑葚多糖MFP-90-2抗肿瘤活性的时效关系研究
通过MTT法研究初筛后的桑葚多糖MFP-90-2抗肿瘤活性的时效关系，根据桑葚多糖MFP-90-2作用时间长度不同，测定对应时间点下的抑制率，从而得到对肿瘤细胞的时效关系，具体步骤如下：选择在对数生长期的肿瘤细胞进行实验，参照1.2.4进行细胞铺板，贴壁24h后，将贴壁后的细胞分为以下2组：①对照组：加入无血清培养基；②实验组：加入如表1-4对应浓度的桑葚多糖MFP-90-2溶液进行处理。于12、24及48h后，分别将5mg·mL-1 20μLMTT溶液添加到每个孔中，再孵育4h。将形成的紫色的甲瓒晶体溶解在150μL的DMSO中，振荡10min后，在490nm处，使用酶标仪读取各孔的吸光度值，通过公式(1)计算抑制百分比，对比不同时间点桑葚多糖MFP-90-2对于肿瘤细胞的抑制率，得到MFP-90-2抗肿瘤活性的时效关系。
表1-4对肿瘤细胞具有抑制作用的桑葚多糖MFP-90-2及浓度信息(μg·mL-1)
Figure GDA0003794119610000081
1.3数据统计分析
使用软件Office 2016、SPSS statistics 21对实验结果进行数据处理，并通过Origin Pro 8.0软件以
Figure GDA0003794119610000082
表示实验结果，使用Student t检验分析了两组之间的差异，P<0.05即为具有统计学意义。
二、桑葚多糖MFP-90-2抑制肿瘤细胞迁移能力的研究
OVCAR-3细胞具有较强的迁移活性，而肿瘤细胞不断迁移会影响机体正常组织的生理活动，对机体健康产生严重后果，因此研究桑葚多糖对于肿瘤细胞迁移作用的影响具有十分重要的意义。为了探索桑葚多糖MFP-90-2对肿瘤细胞迁移能力的影响，发明人设计了细胞划痕实验。使用Image J软件对不同时间点细胞划痕中的划痕面积大小进行测量，并计算不同时间点的迁移率，从而得到桑葚多糖MFP-90-2对于肿瘤细胞迁移的抑制作用，直观地显示其对细胞迁移的影响。
2.1试验材料与仪器
2.1.1试验材料与试剂
实验材料为对肿瘤细胞具有较强抑制活性的桑葚多糖MFP-90-2，选取与IC50值最为接近的浓度作为实验浓度，见表1-4。
实验试剂：MTT，75°酒精，84消毒液，MEM、RPMI 1640、Ham 12-K细胞培养基，胎牛血清，PBS缓冲盐，双抗，胰酶。
2.1.2试验主要仪器设备
冷冻干燥机，十万分之一天平，离心机，恒温数显水浴锅，超声清洗器，摇床，酶标仪，二氧化碳培养箱(赛默飞，ESCO)，移液枪，冰箱，液氮罐，细胞计数仪，显微镜，超净工作台。
2.2实验方法
2.2.1细胞复苏
方法同1.2.1进行。
2.2.2细胞传代和冻存
方法同1.2.2进行。
2.2.3细胞培养
方法同1.2.3进行。
2.2.4桑葚多糖MFP-90-2抗肿瘤细胞迁移的能力研究
将对数生长期的肿瘤细胞(400μL中每孔6×105个细胞)接种到24孔板中。当细胞融合度达到约90％时，在每孔中用10μL移液器吸头以直线刮擦。通过用PBS洗涤每个孔两次来除去细胞碎片，向对照组的每个孔中添加400μL无FBS的培养基，将400μL MFP-90-2溶液添加至实验组。将其在37℃下培养12、24和48小时。使用明美MShot倒置荧光显微镜在0、12、24和48h观察划痕，并捕获相应的图像。通过比较从0h到48h的图像，测量每个划痕闭合的面积，并使用以下公式计算细胞运动性。
Figure GDA0003794119610000091
上述Areaexperiment代表的是实验时间点处划痕面积，Area0h代表的是0h时划痕面积。通过Image J Plus对每个样品采集的图像进行定量分析。
2.3数据统计分析
使用软件Office 2016、SPSS statistics 21对实验结果进行数据处理，并通过Origin Pro 8.0软件以
Figure GDA0003794119610000092
表示实验结果，使用Student t检验分析了两组之间的差异，P<0.05即为具有统计学意义。
三、结果与分析
实验采用MTT法对桑葚多糖MFP-90-2的体外抗肿瘤活性进行初筛。
3.1桑葚多糖MFP-90-2对OVCAR-3细胞的抑制活性
OVCAR-3细胞是一种贴壁细胞，是妇科癌症中致人死亡率最高的一种癌症。
3.1.1桑葚多糖MFP-90-2抑制OVCAR-3细胞增殖的活性
桑葚多糖MFP-90-2体外抑制OVCAR-3细胞增殖活性如图1所示，实验结果显示，浓度为2mg·mL-1的桑葚多糖MFP-90-2对OVCAR-3细胞的抑制率为73.91±0.80％(P<0.01)，其对OVCAR-3细胞显示出了良好的抑制细胞增殖的能力，而多糖MFP-90-1反而显示出促进OVCAR-3细胞增殖的作用。
3.1.2桑葚多糖MFP-90-2抑制OVCAR-3细胞增殖作用的量效关系
桑葚多糖MFP-90-2体外对OVCAR-3细胞增殖抑制作用的量效关系如图2所示，随着桑葚多糖MFP-90-2的浓度不断上升，对OVCAR-3细胞的抑制效果越加明显。
根据不同浓度桑葚多糖MFP-90-2对OVCAR-3细胞的增殖抑制率曲线，可以计算得出MFP-90-2抑制OVCAR-3细胞的IC50值为256.09μg·mL-1，见表3-1。
表3-1桑葚多糖MFP-90-2对于OVCAR-3细胞的细胞毒性
Figure GDA0003794119610000101
上述结果表明，桑葚多糖MFP-90-2具有较好的抑制OVCAR-3细胞增殖的作用，且其作用效果呈现出显著的量效关系。
3.1.3桑葚多糖MFP-90-2抑制OVCAR-3细胞增殖作用的时效关系
时效关系实验结果表明，桑葚多糖MFP-90-2对OVCAR-3细胞抑制作用有显著的时间依赖性，随着作用时间不断延长，对细胞的抑制作用有显著的提升，结果如表3-2所示。
表3-2桑葚多糖MFP-90-2对OVCAR-3细胞抑制率的时间效应(mean±S.D.(％)，n＝5)
Figure GDA0003794119610000102
注：*：各组之间P<0.01。
综上所述，桑葚多糖MFP-90-2对于OVCAR-3细胞具有较好的抑制作用，且抑制作用呈现显著的时效关系。
根据国内外相关研究结果，部分植物多糖对OVCAR-3细胞具有较好的抑制细胞增殖作用。国外研究者提取分离出清半夏中的两种多糖TPN-II、TPA-II，其对OVCAR-3细胞并无明显的体外抑制活性。Zhang等研究了Polygalatenuifolia多糖(PTP)48h对多种癌细胞的体外抑制活性，结果显示，PTP对于OVCAR-3细胞具有较好的抑制其增殖作用，在PTP浓度为2mg·mL-1时的抑制率为76.11％，与桑葚多糖MFP-90-2的抑制活性相当，但其作用时间较长。国内有学者发现，四组分黄秋葵多糖(粗多糖、E1、E2、E3)中的粗多糖以及E1组分对于OVCAR-3细胞具有一定的抑制作用，其中粗多糖、E1组分可以分别降低OVCAR-3细胞的活性至72.30％和52.31％。与上述研究结果对比，桑葚多糖MFP-90-2对于OVCAR-3细胞的抑制活性较好或者作用时间更短。
3.1.4桑葚多糖MFP-90-2抑制OVCAR-3细胞迁移能力的时效关系
细胞划痕实验结果如表3-3所示，MFP-90-2具有较强的抑制OVCAR-3细胞迁移能力的作用，当处理OVCAR-3细胞时长延长至48h时，对于OVCAR-3细胞的迁移率增长至23.20±0.57％，对比空白组(31.65±0.75％)下降了26.70％，相应的细胞迁移图像如图3所示。
表3-3桑葚多糖MFP-90-2对OVCAR-3细胞迁移速率的时间效应(mean±S.D.(％)，n＝5)
Figure GDA0003794119610000111
注：*：在相同的桑葚多糖处理下，两个不同时间点的迁移率具有统计学意义(P<0.05)。
本发明提供了桑葚多糖MFP-90-2在制备抗卵巢癌及胰腺癌药物中的应用。通过MTT法和细胞划痕实验对MFP-90-2抑制OVCAR-3细胞活性进行了研究，实验结果显示MFP-90-2对OVCAR-3细胞表现出了较好的抑制作用，不仅呈现出量效关系和时间依赖性，而且还有抑制OVCAR-3细胞迁移的作用，为以桑葚多糖为原料制备抗癌药物的应用提供了重要的科学依据，也为桑葚作为抗肿瘤药物的新应用及其深度开发与利用提供了数据支撑和理论依据。

Claims (3)

1.桑葚多糖MFP-90-2在制备抗卵巢癌药物中的应用；所述桑葚多糖MFP-90-2的单糖组成为甘露糖5.51％-6.09％、鼠李糖14.63％-16.17％、葡糖醛酸2.76％-3.05％、半乳糖醛酸2.85％-3.15％、葡萄糖34.68％-38.33％、木糖20.14％-22.26％和阿拉伯糖14.44％-15.96％；所述桑葚多糖MFP-90-2的制备方法如下：将桑葚粉碎，依次用索氏提取法进行脱脂，用热水浸提法提取桑葚多糖，用Sevag法脱蛋白，再以低浓度乙醇分级沉淀法分离得不同组分桑葚粗多糖，然后采用DEAE-52纤维素柱层析对乙醇分级沉淀时乙醇浓度为90％的桑葚粗多糖MFP-90进行纯化并除掉其中色素，其中用0.05mol·L-1NaCl洗脱得到的即桑葚多糖MFP-90-2。
2.根据权利要求1所述桑葚多糖MFP-90-2的应用，其特征在于，所述桑葚多糖MFP-90-2的制备方法具体包括以下步骤：
(1)桑葚粉碎、脱脂：称取桑葚样品，粉碎成粉末，按料液比1∶2加入石油醚，用索氏提取法对其进行脱脂处理，每次2h，脱脂3次，脱脂后滤掉废液，得脱脂桑葚；
(2)桑葚多糖的提取：采用热水浸提法，将脱脂桑葚置于洁净容器中，按料液比1∶3加入蒸馏水，于90℃恒温条件下进行热水浸提，2h后用纱布过滤，保存滤液，滤渣继续在相同条件下进行热水浸提，反复3次并合并滤液，将滤液离心去除小颗粒杂质，收集上清液，在60℃条件下用旋转蒸发仪对其进行浓缩，即得桑葚多糖提取物，备用；
(3)桑葚多糖提取物脱蛋白：采用Sevag法，将桑葚多糖提取物置于分液漏斗中，按体积比1∶2加入V三氯甲烷∶V正丁醇＝4∶1的Sevag试剂，充分摇匀，静置，直至分液漏斗中的液体分层完毕后除去底层有机溶剂及中间层蛋白质，收集上层液，反复操作，直至分液漏斗中的溶液无明显絮状物沉淀析出为止，将收集的上层液离心除去蛋白质，收集上清液，备用；
(4)桑葚粗多糖的制备：采用低浓度乙醇分级沉淀的方法，向步骤(3)所得上清液中加入无水乙醇至乙醇浓度为90％，将其静置于4℃环境中24h，然后离心，收集上清液并获取沉淀，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤沉淀3次，真空冷冻干燥，即得桑葚粗多糖MFP-90；
(5)桑葚多糖的纯化：采用DEAE-52纤维素柱层析对MFP-90进行纯化并除掉其中色素，具体为：准确称取MFP-90，加入蒸馏水搅拌溶解，配制浓度为6mg·mL-1的MFP-90溶液，将20mL6mg·mL-1的MFP-90溶液依次用300mL蒸馏水和300mL 0.05mol·L-1NaCl经DEAE-52纤维素柱进行分段洗脱，每段每管各收集10mL洗脱液，收集30管，采用苯酚-硫酸法对每段洗脱液进行紫外跟踪测定，直至无多糖为止，按照吸收峰情况合并每组分，浓缩，透析，真空冷冻干燥，得桑葚多糖，其中用0.05mol·L-1NaCl洗脱得到的即桑葚多糖MFP-90-2。
3.根据权利要求1所述桑葚多糖MFP-90-2的应用，其特征在于：所述卵巢癌为OVCAR-3细胞相关的卵巢癌。
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