CN105037575A - 一种桑葚多糖的提取方法及其产品 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种桑葚多糖的提取方法，包括以下步骤：1)除杂：将桑葚原料进行水洗，干燥，粉碎，备用；2)脱脂、脱色：将步骤1)所得原料置于容器中，先后加入乙醇、乙醚进行回流，回流完毕后，晾干，备用；3)将步骤2)所得产物置于容器中，加入水，调节pH值，保温，加入酶进行酶解；4)将步骤3)中酶解产物进行超声处理，得提取液；5)将提取液趁热过滤，得滤液，将滤液浓缩，醇沉两次，离心，收集沉淀物，沉淀物用无水乙醇反复洗涤，干燥，得到提取物。本发明的提取方法采用生物酶酶解与超声相结合，提取效率是单独超声提取的1.61倍，得率达到16.16％左右，是一种安全、环保、高效的提取方法，所得提取物活性高。
Description
技术领域
本发明涉及一种桑葚多糖的提取方法及其产品，属于中药提取技术领域。
背景技术
桑葚(FructusMori)又名桑枣、桑果、葚子、乌葚等，是桑科桑属多年生落叶乔木桑树的成熟果穗的统称，原产于中国中部约有四千年的栽培史，品种较多栽培范围广泛，资源较为丰富。新鲜桑葚不但有甘美的滋味，并且含有大量的维生素、氨基酸、矿物元素、微量元素、无机盐类、果胶、黄酮、生物碱、酚类及糖类等多种营养成分，又具有食用和医疗保健的作用，因而被广大人群所喜爱。桑葚是被国家卫生部列为首批“既是食品又是药品”的农产品之一。我国许多中医名著如《本草纲目》、《中药大辞典》等，认为桑葚性寒，具有滋阴养血、镇静安神、补肝益肾、养颜益智、乌发明目、生津止渴、延年祛斑、降压消渴和解酒的功效，还可以用于治疗肝肾阳虚、心悸失眠、肠燥便秘、须发早白等症。随着现代医学对桑葚进行药理、药效毒理测试的研究，发现桑葚具有促进造血细胞的生长，提高动物体内酶的活性，抗诱变，抗菌，抗病毒，抗辐射，抑制肿瘤及有害物质的生成，增强免疫力、抗寒功能及耐劳能力，抗氧化，延缓细胞衰老，防止血管硬化，调节血糖和血脂，护肝等功效。
桑葚多糖是由多个相同或不同的单糖以糖苷键连接而成的高聚合物，具有较为广泛的生物活性。主要包括参与机体代谢、调节机体免疫力、延缓细胞衰老、防止血管硬化、防衰老、调节血糖、抗菌、抗病毒、抗辐射、抑制肿瘤、抗氧化等生物活性。
《桑葚多糖提取、纯化分离及其降糖作用的研究》(赵喜兰，《食品工业科技》，2011年第2期)公开了一种用回流提取并经树脂纯化得到桑葚多糖的方法。《桑葚多糖提取方法的比较》(刘胜利等，《安徽农业科学》，2012年第5期)中对不同的桑葚多糖提取方法进行了比较。
传统的桑葚多糖提取方法主要有回流提取法、超声波辅助提取法、热水提取法、碱提取法或酸提取法，总体上呈现提取效率低、提取得率低、工艺复杂、污染环境等诸多缺陷，不适合工业化大生产。因此提供一种高效、安全环保、工艺简单的提取方法，显得尤为必要。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种桑葚多糖的提取方法，采用生物酶酶解与超声相结合，具有提取效率高、提取物得率高、安全环保，适合工业化大生产的特点。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种桑葚多糖的提取方法，包括以下步骤：
(1)除杂：将桑葚原料进行水洗，干燥，粉碎，备用；
(2)脱脂、脱色：将步骤(1)所得原料置于容器中，先后加入乙醇、乙醚进行回流，回流完毕后，晾干，备用；
(3)将步骤(2)所得产物置于容器中，加入水，调节pH值，保温，加入葡萄糖氧化酶进行酶解；
(4)将步骤(3)中酶解产物进行超声处理，得提取液；
(5)将提取液趁热过滤，得滤液，将滤液浓缩，醇沉两次，离心，收集沉淀物，沉淀物用无水乙醇反复洗涤，干燥，得到桑葚多糖提取物。
进一步地，前述提取方法，包括以下步骤：
(1)除杂：将桑葚原料进行水洗，干燥，粉碎，备用；
(2)脱脂、脱色：将步骤(1)所得原料置于容器中，先加入75％～100％乙醇回流两次，再加入90％～100％乙醚回流两次，每次回流60～150分钟，回流完毕后，晾干，备用；
(3)将步骤(2)所得产物置于容器中，加入步骤(2)所得产物重量6～25倍的水，调节pH值为3～7，保持温度在25℃～75℃，加入步骤(2)所得产物重量0.001～0.006倍的葡萄糖氧化酶进行酶解，酶解时间为15～120分钟；
(4)将步骤(3)中酶解产物进行超声处理，超声频率为20～100KHz，时间为10～40分钟，得提取液；
(5)将提取液趁热过滤，得滤液，将滤液浓缩至原体积的1/5～1/3，乙醇沉淀两次，两次均加入4～6倍体积、浓度为90％～100％的乙醇，均放置于3℃～5℃下保持12h～48h；醇沉后离心，收集沉淀物，沉淀物用无水乙醇反复洗涤，干燥，得到桑葚多糖提取物。
更优选的提取方法，包括以下步骤：
(1)除杂：将桑葚原料进行水洗，干燥，粉碎，备用；
(2)脱脂、脱色：将步骤(1)所得原料置于容器中，先加入无水乙醇回流两次，再加入无水乙醚回流两次，每次回流105分钟，回流完毕后，晾干，备用；
(3)将步骤(2)所得产物置于容器中，加入步骤(2)所得产物重量11倍的水，调节pH值为5，保持温度在58℃，加入步骤(2)所得产物重量0.003倍的葡萄糖氧化酶进行酶解，酶解时间为38分钟；
(4)将步骤(3)中酶解产物进行超声处理，超声频率为80KHz，时间为20分钟，得提取液；
(5)将提取液趁热过滤，得滤液，将滤液浓缩至原体积的1/4，乙醇沉淀两次，两次均加入5倍体积、浓度为95％的乙醇，均放置于4℃下保持30h；醇沉后离心，收集沉淀物，沉淀物用无水乙醇反复洗涤，干燥，得到桑葚多糖提取物。
前述提取方法中，所述的葡萄糖氧化酶为0.2wt％～0.4wt％葡萄糖氧化酶水溶液。
以上所述桑葚多糖的提取方法提取得到的桑葚多糖提取物。
前述的桑葚多糖提取物中含有多糖、糖醛酸、蛋白质和硫酸酯，其中多糖的重量百分含量大于55％，糖醛酸的重量百分含量大于12％。
前述桑葚多糖提取物，按照重量百分数计，其中含有多糖65％～70％、糖醛酸16％～21％、蛋白质1％～2％和硫酸酯5％～7％。
进一步地，按照重量百分数计，前述桑葚多糖提取物中含有多糖67.9％、糖醛酸18.5％、蛋白质1.6％和硫酸酯6.2％。
前述桑葚多糖提取物中，所述多糖由质量比为1.8～2.4∶0.3～1∶1.9～2.5∶60～61∶2.8～3.4∶18～18.8∶12.2～13的鼠李糖残基、岩藻糖残基、木糖残基、甘露糖残基、半乳糖残基、半乳糖醛酸残基和葡萄糖残基组成。
进一步地，前述桑葚多糖提取物中，所述多糖由质量比为2.1∶0.6∶2.2∶60.5∶3.1∶18.4∶12.5的鼠李糖残基、岩藻糖残基、木糖残基、甘露糖残基、半乳糖残基、半乳糖醛酸残基和葡萄糖残基组成。
为了确保本发明的桑葚多糖的提取方法科学、合理，发明人进行了相应的实验研究和筛选，才得以确定本发明的技术方案。具体实验内容如下：
1.仪器与试药
1.1仪器
三角瓶、具塞试管、移液管、量筒、烧杯、试剂瓶、容量瓶、离心管、电子天平、台秤、旋转蒸发仪、电热恒温鼓风干燥箱、水浴锅、高速万能粉碎机、紫外可见分光光度计、PHS-3C+酸度计(pH精确0.01)、温度计、冰柜、恒温培养箱、酶标仪等。
1.2试药
如表1所示。
表1
2.方法与结果
2.1桑葚多糖提取工艺
2.1.1工艺流程
原材料→除杂→脱脂、脱色→加适量水→调节适当pH、温度→酶解→超声→过滤、浓缩→醇沉→桑葚多糖提取物
2.1.2操作过程
A.桑葚预处理过程：
1)用清水将原料进行水洗，去除桑葚原料中的杂质，干燥，粉碎，备用；
2)将1)中粉碎的桑葚置于容器中，加入75％～100％的乙醇，回流两次，每次回流60～150分钟；
3)加入90％～100％的乙醚，回流两次，每次回流60～150分钟，晾干，备用。
B.酶解过程：将A项中所得产物置于容器中，加入水，水的用量为A项中所得产物重量6～25倍，调节pH值为3～7，保持温度在25℃～75℃，加入葡萄糖氧化酶，酶的用量为A项中所得产物重量的0.001～0.006倍，进行酶解，酶解时间为15～120分钟。
C.超声过程：将B项中酶解产物进行超声处理，超声频率为20～100KHz，时间为10～40分钟，得提取液。
D.醇沉过程：将提取液趁热过滤，得滤液，浓缩滤液至原来体积的1/5～1/3，醇沉两次，两次均加入4～6倍体积、浓度为90％～100％的乙醇，均放于温度3℃～5℃的环境下并且保持12～48小时进行醇沉，醇沉后离心，收集沉淀。沉淀用无水乙醇反复洗涤，干燥，得桑葚多糖提取物。
2.1.3酶溶液的配制
葡萄糖氧化酶(0.2wt％～0.4wt％水溶液)：取葡萄糖氧化酶2～4重量份，精密称定，先用少量的水溶解，然后加入适量的水，两次加水共计1000重量份，混匀，即得。
2.2用苯酚-硫酸法测定多糖含量
2.2.1操作流程
取桑葚多糖粗提物→配制成适当浓度的溶液→取一定体积的桑葚多糖粗提物溶液于具塞试管中→加1mL的苯酚溶液→充分震荡→迅速加入浓硫酸5mL→沸水浴5分钟→冷却至室温→用紫外分光光度计测490nm波长处的吸光度→计算多糖含量。
2.2.2桑葚多糖提取率的计算
桑葚多糖提取率(％)＝粗多糖质量/桑葚质量×100％
2.3提取工艺的单因素考察
2.3.1酶解温度的考察
取预处理过的桑葚置于容器中，加入水，水的用量为12倍预处理后的桑葚重量，调节pH为5，放入恒温恒湿箱分别保持温度在25℃、35℃、45℃、55℃、65℃、75℃和85℃，加入葡萄糖氧化酶的量为桑葚重量的0.3％，酶解120分钟后超声，过滤，浓缩，醇沉两次，得桑葚多糖提取物，再用硫酸-苯酚法显色，用紫外分光光度计测定吸光度，酶解温度对桑葚多糖提取效果的影响见图1。
由图1知，酶解温度在55℃左右时，桑葚多糖提取效果较好。
2.3.2酶的用量的考察
取预处理过的桑葚于容器中，加入水，水的用量为12倍预处理后的桑葚重量，调节pH为5，保持温度在55℃，加入葡萄糖氧化酶的量分别为桑葚重量的0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％和0.6％，酶解120分钟后超声，过滤，浓缩，醇沉两次，得桑葚多糖提取物，再用硫酸-苯酚法显色，用紫外分光光度计测定吸光度，酶的用量对桑葚多糖提取效果的影响见图2。
由图2知，酶的用量在预处理后的桑葚重量的0.3％左右时，桑葚多糖提取效果较好。
2.3.3水的用量的考察
取预处理过的桑葚于容器中，加入水，水的用量分别为预处理后的桑葚重量的6、8、10、12、14、16和18倍，调节pH为5，保持温度在55℃，加入葡萄糖氧化酶的量为预处理后的桑葚重量的0.3％，酶解120分钟后超声，过滤，浓缩，醇沉两次，得桑葚多糖提取物，再用硫酸-苯酚法显色，用紫外分光光度计测定吸光度，水的用量对桑葚多糖提取效果的影响见图3。
由图3知，水的用量为预处理后的桑葚重量的14倍左右时，桑葚多糖提取效果较好。
2.3.4酶解时间的考察
取预处理过的桑葚于容器中，加入水，水的用量为12倍预处理后的桑葚重量，调节pH为5，保持温度在55℃，加入葡萄糖氧化酶的量为桑葚重量的0.3％，分别酶解15、30、45、60、75、90、105和120分钟后超声，过滤，浓缩，醇沉两次，得桑葚多糖提取物，再用硫酸-苯酚法显色，用紫外分光光度计测定吸光度，酶解时间对桑葚多糖提取效果的影响见图4。
由图4知，酶解时间在60分钟左右时，桑葚多糖提取效果较好。
2.4桑葚多糖提取工艺的响应面设计实验
2.4.1因素与水平
影响桑葚多糖提取工艺的主要因素有葡萄糖氧化酶的酶解时间(X1，min)、酶的用量(X2，％)、水的用量(X3，倍)、酶解温度(X4，℃)4个因素，本实验采用四因素三水平的BBD响应曲面设计法(见表2)，以吸光度(A)为指标，对其工艺的水平参数进行优选，所选因素水平及响应曲面设计试验结果见表3和表4。
表2响应面实验因素水平设计表
2.4.2实验方法
按响应面设计1～29号条件进行实验，用紫外分光光度计测其吸光度。
2.4.3响应面设计试验结果分析
表3响应面试验设计表
表4桑葚多糖含量的方差分析
模拟回归方程：
通过响应面设计、方差分析、图5～图16可知，这四个影响因素均对桑葚多糖提取率有较为明显的影响。最佳提取条件为：酶解时间为38分钟、酶的用量为0.3％、水的用量为11倍、酶解温度为58℃。
2.5桑葚多糖提取物对化学性肝损伤抑制作用试验：
(1)急性酒精性肝损伤模型实验
急性酒精性肝损伤模型实验造模方法：昆明种小鼠(SPS级，许可证号SCXK(湘)2009-0012)，体重20±2g，在温度为22±0.5℃，光照周期为12h:12h环境中饲养10天后实验，实验前24h禁食，任意饮水。随机将每10只小鼠分为一组，共6组，分别为：病理模型组、常规对照组、阳性对照组和桑葚多糖提取物组(低剂量组、中剂量组和高剂量组)。桑葚多糖提取物组：分别灌胃给药50mg/kg/天(低剂量组)，100mg/kg/天(中剂量组)，150mg/kg/天(高剂量组)，阳性对照组：灌胃给药150mg/kg/天，病理模型组与常规对照组灌胃给予同体积的蒸馏水，连续灌胃30天，末次给药后4小时后除对照组外其余各组均按14mL/kg的量给予50％的酒精，末次灌胃禁食不禁水16小时后，摘眼球取血分离血清，按ALTElisa试剂盒、ASTElisa试剂盒(均购自Elisa试剂盒公司)的说明书分别测定丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)的水平。取血后断颈处死小鼠立即取出肝脏，按1:10加入冰生理盐水，冰浴下匀浆，4000r/min离心5min，取上清液按SODElisa试剂盒、GSH-PxElisa试剂盒、GSHElisa试剂盒和MDAElisa试剂盒的说明书分别测超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性及谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的含量。结果见表5、图17和图18。
表5桑葚多糖提取物对小鼠急性酒精性肝损伤SOD和GSH-Px活性及GSH和MAD含量的影响
(2)亚急性酒精性肝损伤模型实验
亚急性酒精性肝损伤模型实验造模方法：昆明种小鼠(SPS级，许可证号SCXK(湘)2009-0012)，体重20±2g，在温度为22±0.5℃、光照周期为12h:12h环境中饲养10天后实验，实验前24h禁食，任意饮水。随机将每10只小鼠分为一组，共6组，分别为：病理模型组、常规对照组、阳性对照组和桑葚多糖提取物组(低剂量组、中剂量组和高剂量组)。桑葚多糖提取物组：分别灌胃给药50mg/kg/天(低剂量组)，100mg/kg/天(中剂量组)，150mg/kg/天(高剂量组)，阳性对照组：灌胃给药150mg/kg/天，病理模型组与常规对照组灌胃给予同体积的蒸馏水，连续灌胃20天，从第21天起，除对照组外其余各组每天给药4小时后，均按14mL/kg的量给予38％的酒精，末次灌胃禁食不禁水16小时后，摘眼球取血分离血清，按ALTElisa试剂盒、ASTElisa试剂盒的说明书分别测定丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的水平。取血后断颈处死小鼠立即取出肝脏，按1:10加入冰生理盐水，冰浴下匀浆，4000r/min离心5min，取上清液按SODElisa试剂盒、GSH-PxElisa试剂盒、GSHElisa试剂盒和MDAElisa试剂盒的说明书分别测超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性及谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的含量。结果见表6、图19和图20。
表6桑葚多糖提取物对小鼠急性酒精性肝损伤SOD和GSH-Px活性及GSH和MAD含量的影响
由表5、表6、图17～图20可知，本发明提取的桑葚多糖提取物能明显降低血清中丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的水平，有效提高肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性，明显降低肝脏中谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的含量，且具有明显的剂量依赖性。
本发明的有益之处在于：本发明结合传统桑葚多糖的提取方法，通过响应曲面方法，综合考虑提取时水的用量、酶的用量、酶解温度、酶解时间等多个因素对桑葚多糖提取的影响，并对之进行优化，提供了一种新的用酶辅助超声萃取桑葚多糖的方法，科学合理、操作简单、成本低廉，易于工业化大生产，所得产物多糖含量较高；所采用的溶剂安全无毒，避免了传统方法中采用氯仿、甲醇、酸或碱等溶剂对环境的污染，同时节省了成本；采用生物酶酶解与超声相结合的方法，不但提高了提取效率，提取效率是单独超声提取的1.61倍，更使得桑葚多糖得率达到16.16％左右。因而本发明提取方法是一种安全、环保、高效的桑葚多糖提取方法。本发明提取的桑葚多糖提取物活性高，能明显降低血清中丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的水平，有效提高肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性，明显降低肝脏中谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的含量。
附图说明
图1是本发明的提取过程中桑葚多糖提取率随酶解温度的变化曲线图；
图2是提取过程中桑葚多糖提取率随酶的用量的变化曲线图；
图3是提取过程中桑葚多糖提取率随水的用量的变化曲线图；
图4是提取过程中桑葚多糖提取率随酶解时间的变化曲线图；
图5是酶的用量和酶解时间对桑葚多糖提取率交互影响的响应面图；
图6是酶解时间和水的用量对桑葚多糖提取率交互影响的响应面图；
图7是酶解时间和酶解温度对桑葚多糖提取率交互影响的响应面图；
图8是酶的用量和水的用量对桑葚多糖提取率交互影响的响应面图；
图9是酶的用量和酶解温度对桑葚多糖提取率交互影响的响应面图；
图10是酶解温度和水的用量对桑葚多糖提取率交互影响的响应面图；
图11是酶的用量和酶解时间对桑葚多糖提取率交互影响的等高线图；
图12是水的用量和酶解时间对桑葚多糖提取率交互影响的等高线图；
图13是酶解温度和酶解时间对桑葚多糖提取率交互影响的等高线图；
图14是水的用量和酶的用量对桑葚多糖提取率交互影响的等高线图；
图15是酶解温度和酶的用量对桑葚多糖提取率交互影响的等高线图；
图16是酶解温度和水的用量对桑葚多糖提取率交互影响的等高线图；
图17是急性酒精性肝损伤模型的AST指标图；
图18是急性酒精性肝损伤模型的ALT指标图；
图19是亚急性酒精性肝损伤模型的AST指标图；
图20是亚急性酒精性肝损伤模型的ALT指标图；
图17～图20中附图标记的含义：1常规对照组，2病理模型对照组，3阳性对照组，4桑葚多糖提取物高剂量组，5桑葚多糖提取物中剂量组，6桑葚多糖提取物低剂量组。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的介绍。
实施例1一种桑葚多糖的提取方法，包括以下步骤：
(1)除杂：将100g桑葚原料进行水洗，干燥，粉碎，备用；
(2)脱脂、脱色：将步骤(1)所得原料置于容器中，先加入200mL75％乙醇回流两次，再加入200mL90％乙醚回流两次，每次回流60分钟，回流完毕后，晾干，备用；
(3)将步骤(2)所得产物置于容器中，加入步骤(2)所得产物重量25倍的水，调节pH值为7，保持温度在75℃，加入步骤(2)所得产物重量0.006倍的葡萄糖氧化酶进行酶解，酶解时间为120分钟；
(4)将步骤(3)中酶解产物进行超声处理，超声频率为20KHz，时间为10分钟，得提取液；
(5)将提取液趁热过滤，得滤液，将滤液浓缩至原体积的1/5，乙醇沉淀两次，两次均加入4倍体积、浓度为90％的乙醇，均放置于3℃下保持12h，醇沉后离心，收集沉淀物，沉淀物用无水乙醇反复洗涤，干燥，得到桑葚多糖提取物。
所用酶为0.2wt％葡萄糖氧化酶水溶液：取葡萄糖氧化酶2g，精密称定，先用少量的水溶解，然后加入适量的水，两次加水共计1000g，混匀，即得。
经检测，提取得到的桑葚多糖提取物中含有多糖65wt％(苯酚-硫酸法)、糖醛酸16wt％(间羟基联苯比色法)、蛋白质2wt％(Bradford法)和硫酸酯7wt％(氯化钡-明胶法)。其中多糖由质量比为1.8∶0.3∶1.9∶60∶2.8∶18∶12.2的鼠李糖残基、岩藻糖残基、木糖残基、甘露糖残基、半乳糖残基、半乳糖醛酸残基和葡萄糖残基组成。
实施例2一种桑葚多糖的提取方法，包括以下步骤：
(1)除杂：将200g桑葚原料进行水洗，干燥，粉碎，备用；
(2)脱脂、脱色：将步骤(1)所得原料置于容器中，先加入400mL无水乙醇回流两次，再加入400mL无水乙醚回流两次，每次回流105分钟，回流完毕后，晾干，备用；
(3)将步骤(2)所得产物置于容器中，加入步骤(2)所得产物重量11倍的水，调节pH值为5，保持温度在58℃，加入步骤(2)所得产物重量0.003倍的葡萄糖氧化酶进行酶解，酶解时间为38分钟；
(4)将步骤(3)中酶解产物进行超声处理，超声频率为80KHz，时间为20分钟，得提取液；
(5)将提取液趁热过滤，得滤液，将滤液浓缩至原体积的1/4，乙醇沉淀两次，两次均加入5倍体积、浓度为95％的乙醇，均放置于4℃下保持30h，醇沉后离心，收集沉淀物，沉淀物用无水乙醇反复洗涤，干燥，得到桑葚多糖提取物。
所用酶为0.4wt％葡萄糖氧化酶水溶液：取葡萄糖氧化酶4g，精密称定，先用少量的水溶解，然后加入适量的水，两次加水共计1000g，混匀，即得。
经检测，提取得到的桑葚多糖提取物中含有多糖67.9wt％(苯酚-硫酸法)、糖醛酸18.5wt％(间羟基联苯比色法)、蛋白质1.6wt％(Bradford法)和硫酸酯6.2wt％(氯化钡-明胶法)。其中多糖由质量比为2.1∶0.6∶2.2∶60.5∶3.1∶18.4∶12.5的鼠李糖残基、岩藻糖残基、木糖残基、甘露糖残基、半乳糖残基、半乳糖醛酸残基和葡萄糖残基组成。
实施例3一种桑葚多糖的提取方法，包括以下步骤：
(1)除杂：将150g桑葚原料进行水洗，干燥，粉碎，备用；
(2)脱脂、脱色：将步骤(1)所得原料置于容器中，先加入200mL无水乙醇回流两次，再加入200mL无水乙醚回流两次，每次回流150分钟，回流完毕后，晾干，备用；
(3)将步骤(2)所得产物置于容器中，加入步骤(2)所得产物重量6倍的水，调节pH值为3，保持温度在25℃，加入步骤(2)所得产物重量0.001倍的葡萄糖氧化酶进行酶解，酶解时间为15分钟；
(4)将步骤(3)中酶解产物进行超声处理，超声频率为100KHz，时间为40分钟，得提取液；
(5)将提取液趁热过滤，得滤液，将滤液浓缩至原体积的1/3，乙醇沉淀两次，两次均加入6倍体积的无水乙醇，均放置于5℃下保持48h，醇沉后离心，收集沉淀物，沉淀物用无水乙醇反复洗涤，干燥，得到桑葚多糖提取物。
所用酶为0.3wt％葡萄糖氧化酶水溶液：取葡萄糖氧化酶3g，精密称定，先用少量的水溶解，然后加入适量的水，两次加水共计1000g，混匀，即得。
经检测，提取得到的桑葚多糖提取物中含有多糖67wt％(苯酚-硫酸法)、糖醛酸20wt％(间羟基联苯比色法)、蛋白质1.5wt％(Bradford法)和硫酸酯6wt％(氯化钡-明胶法)。其中多糖由质量比为2∶1∶2∶61∶3∶18∶13的鼠李糖残基、岩藻糖残基、木糖残基、甘露糖残基、半乳糖残基、半乳糖醛酸残基和葡萄糖残基组成。
实施例4一种桑葚多糖的提取方法，包括以下步骤：
(1)除杂：将200g桑葚原料进行水洗，干燥，粉碎，备用；
(2)脱脂、脱色：将步骤(1)所得原料置于容器中，先加入300mL90％乙醇回流两次，再加入300mL95％乙醚回流两次，每次回流135分钟，回流完毕后，晾干，备用；
(3)将步骤(2)所得产物置于容器中，加入步骤(2)所得产物重量17倍的水，调节pH值为4，保持温度在45℃，加入步骤(2)所得产物重量0.005倍的葡萄糖氧化酶进行酶解，酶解时间为60分钟；
(4)将步骤(3)中酶解产物进行超声处理，超声频率为50KHz，时间为25分钟，得提取液；
(5)将提取液趁热过滤，得滤液，将滤液浓缩至原体积的1/5，乙醇沉淀两次，两次均加入5倍体积、浓度为95％的乙醇，均放置于4℃下保持36h，醇沉后离心，收集沉淀物，沉淀物用无水乙醇反复洗涤，干燥，得到桑葚多糖提取物。
所用酶为0.3wt％葡萄糖氧化酶水溶液：取葡萄糖氧化酶3g，精密称定，先用少量的水溶解，然后加入适量的水，两次加水共计1000g，混匀，即得。
经检测，提取得到的桑葚多糖提取物中含有多糖70wt％(苯酚-硫酸法)、糖醛酸21wt％(间羟基联苯比色法)、蛋白质1wt％(Bradford法)和硫酸酯5wt％(氯化钡-明胶法)。其中多糖由质量比为2.4∶1∶2.5∶61∶3.4∶18.8∶13的鼠李糖残基、岩藻糖残基、木糖残基、甘露糖残基、半乳糖残基、半乳糖醛酸残基和葡萄糖残基组成。
实施例5一种桑葚多糖的提取方法，包括以下步骤：
(1)除杂：将100g桑葚原料进行水洗，干燥，粉碎，备用；
(2)脱脂、脱色：将步骤(1)所得原料置于容器中，先加入300mL95％乙醇回流两次，再加入300mL90％乙醚回流两次，每次回流120分钟，回流完毕后，晾干，备用；
(3)将步骤(2)所得产物置于容器中，加入步骤(2)所得产物重量20倍的水，调节pH值为6，保持温度在60℃，加入步骤(2)所得产物重量0.004倍的葡萄糖氧化酶进行酶解，酶解时间为90分钟；
(4)将步骤(3)中酶解产物进行超声处理，超声频率为90KHz，时间为30分钟，得提取液；
(5)将提取液趁热过滤，得滤液，将滤液浓缩至原体积的1/3，乙醇沉淀两次，两次均加入4倍体积、浓度为95％的乙醇，均放置于3℃下保持40h，醇沉后离心，收集沉淀物，沉淀物用无水乙醇反复洗涤，干燥，得到桑葚多糖提取物。
所用酶为0.25wt％葡萄糖氧化酶水溶液：取葡萄糖氧化酶2.5g，精密称定，先用少量的水溶解，然后加入适量的水，两次加水共计1000g，混匀，即得。
经检测，提取得到的桑葚多糖提取物中含有多糖、糖醛酸、蛋白质和硫酸酯，其中多糖的含量为60wt％(苯酚-硫酸法)，糖醛酸的含量为15wt％(间羟基联苯比色法)。所述多糖由质量比为2.2∶0.8∶2.4∶60∶3.3∶18.6∶12.7的鼠李糖残基、岩藻糖残基、木糖残基、甘露糖残基、半乳糖残基、半乳糖醛酸残基和葡萄糖残基组成。
实施例6一种桑葚多糖的提取方法，包括以下步骤：
(1)除杂：将200g桑葚原料进行水洗，干燥，粉碎，备用；
(2)脱脂、脱色：将步骤(1)所得原料置于容器中，先加入300mL85％乙醇回流两次，再加入200mL无水乙醚回流两次，每次回流90分钟，回流完毕后，晾干，备用；
(3)将步骤(2)所得产物置于容器中，加入步骤(2)所得产物重量21倍的水，调节pH值为7，保持温度在50℃，加入步骤(2)所得产物重量0.005倍的葡萄糖氧化酶进行酶解，酶解时间为45分钟；
(4)将步骤(3)中酶解产物进行超声处理，超声频率为60KHz，时间为15分钟，得提取液；
(5)将提取液趁热过滤，得滤液，将滤液浓缩至原体积的1/4，乙醇沉淀两次，两次均加入6倍体积、浓度为90％的乙醇，均放置于5℃下保持20h，醇沉后离心，收集沉淀物，沉淀物用无水乙醇反复洗涤，干燥，得到桑葚多糖提取物。
经检测，提取得到的桑葚多糖提取物中含有多糖、糖醛酸、蛋白质和硫酸酯，其中多糖的含量为64wt％(苯酚-硫酸法)，糖醛酸的含量为22wt％(间羟基联苯比色法)。
Claims (10)
1.一种桑葚多糖的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)除杂：将桑葚原料进行水洗，干燥，粉碎，备用；
(2)脱脂、脱色：将步骤(1)所得原料置于容器中，先后加入乙醇、乙醚进行回流，回流完毕后，晾干，备用；
(3)将步骤(2)所得产物置于容器中，加入水，调节pH值，保温，加入葡萄糖氧化酶进行酶解；
(4)将步骤(3)中酶解产物进行超声处理，得提取液；
(5)将提取液趁热过滤，得滤液，将滤液浓缩，醇沉两次，离心，收集沉淀物，沉淀物用无水乙醇反复洗涤，干燥，得到桑葚多糖提取物。
2.根据权利要求1所述的桑葚多糖的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)除杂：将桑葚原料进行水洗，干燥，粉碎，备用；
(2)脱脂、脱色：将步骤(1)所得原料置于容器中，先加入75％～100％乙醇回流两次，再加入90％～100％乙醚回流两次，每次回流60～150分钟，回流完毕后，晾干，备用；
(3)将步骤(2)所得产物置于容器中，加入步骤(2)所得产物重量6～25倍的水，调节pH值为3～7，保持温度在25℃～75℃，加入步骤(2)所得产物重量0.001～0.006倍的葡萄糖氧化酶进行酶解，酶解时间为15～120分钟；
(4)将步骤(3)中酶解产物进行超声处理，超声频率为20～100KHz，时间为10～40分钟，得提取液；
(5)将提取液趁热过滤，得滤液，将滤液浓缩至原体积的1/5～1/3，乙醇沉淀两次，两次均加入4～6倍体积、浓度为90％～100％的乙醇，均放置于3℃～5℃下保持12h～48h；醇沉后离心，收集沉淀物，沉淀物用无水乙醇反复洗涤，干燥，得到桑葚多糖提取物。
3.根据权利要求2所述的桑葚多糖的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)除杂：将桑葚原料进行水洗，干燥，粉碎，备用；
(2)脱脂、脱色：将步骤(1)所得原料置于容器中，先加入无水乙醇回流两次，再加入无水乙醚回流两次，每次回流105分钟，回流完毕后，晾干，备用；
(3)将步骤(2)所得产物置于容器中，加入步骤(2)所得产物重量11倍的水，调节pH值为5，保持温度在58℃，加入步骤(2)所得产物重量0.003倍的葡萄糖氧化酶进行酶解，酶解时间为38分钟；
(4)将步骤(3)中酶解产物进行超声处理，超声频率为80KHz，时间为20分钟，得提取液；
(5)将提取液趁热过滤，得滤液，将滤液浓缩至原体积的1/4，乙醇沉淀两次，两次均加入5倍体积、浓度为95％的乙醇，均放置于4℃下保持30h；醇沉后离心，收集沉淀物，沉淀物用无水乙醇反复洗涤，干燥，得到桑葚多糖提取物。
4.根据权利要求1～3任一项所述的桑葚多糖的提取方法，其特征在于：所述葡萄糖氧化酶为0.2wt％～0.4wt％葡萄糖氧化酶水溶液。
5.如权利要求1～4任一项所述的桑葚多糖的提取方法提取得到的桑葚多糖提取物。
6.根据权利要求5所述的桑葚多糖提取物，其特征在于：所述提取物中含有多糖、糖醛酸、蛋白质和硫酸酯，其中多糖的重量百分含量大于55％，糖醛酸的重量百分含量大于12％。
7.根据权利要求6所述的桑葚多糖提取物，其特征在于：按照重量百分数计，所述提取物中含有多糖65％～70％、糖醛酸16％～21％、蛋白质1％～2％和硫酸酯5％～7％。
8.根据权利要求7所述的桑葚多糖提取物，其特征在于：按照重量百分数计，所述提取物中含有多糖67.9％、糖醛酸18.5％、蛋白质1.6％和硫酸酯6.2％。
9.根据权利要求6、7或8所述的桑葚多糖提取物，其特征在于：所述多糖由质量比为1.8～2.4∶0.3～1∶1.9～2.5∶60～61∶2.8～3.4∶18～18.8∶12.2～13的鼠李糖残基、岩藻糖残基、木糖残基、甘露糖残基、半乳糖残基、半乳糖醛酸残基和葡萄糖残基组成。
10.根据权利要求9所述的桑葚多糖提取物，其特征在于：所述多糖由质量比为2.1∶0.6∶2.2∶60.5∶3.1∶18.4∶12.5的鼠李糖残基、岩藻糖残基、木糖残基、甘露糖残基、半乳糖残基、半乳糖醛酸残基和葡萄糖残基组成。
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