CN106946999A - 一种龙胆草多糖的脱色方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种龙胆草多糖的脱色方法，其工艺流程为：龙胆草粉碎→过筛→石油醚脱脂→80℃水浴提取→浓缩提取液→醇沉24h→过滤→乙醇﹑丙酮洗涤→干燥→称重→龙胆粗多糖→溶解→上样→收集流出液→浓缩→冷冻干燥→脱色后的多糖。最佳工艺条件为；上样量为5BV,上样流速为3BV/h,上样浓度为5 mg/mL。在此优化条件下进行验证试验，龙胆草多糖的脱色率为80.40%，多糖保留率为80.60%。本脱色方法条件温和，能有效除去粗多糖中的色素，且树脂还可以重复利用，在使用5次后，对龙胆草粗多糖的脱色效果还是较好，所以该柱层析脱色法便于实现工业化生产。

Description

一种龙胆草多糖的脱色方法

技术领域

本发明涉及中药化学领域，特别是涉及龙胆多糖的提取和采用D941阴离子交换树脂对龙胆草多糖溶液的一种脱色方法。

背景技术

龙胆草(Gentiana scabra Bge),又名地胆草﹑龙胆﹑草龙胆，药用部分为龙胆科龙胆属植物龙胆干燥的根和茎，是一种常用的中草药。龙胆草在我国的产地分布较广，主要分布在贵州﹑云南﹑四川﹑湖南﹑陕西等地。

龙胆草具有清热燥湿﹑清肝泻胆的药用功效，有着广泛的用途，如中成药“龙胆泻肝丸”就是用龙胆草为主要原料制成的。研究发现龙胆汤对病毒性脑炎,肝胆湿热型带状疱疹,突发性耳聋,湿热型带下病,单纯疱疹性角膜炎的系统评价,面瘫，宫颈炎合并Hpv感染等疾病均有一定的疗效。

龙胆草中有很多有效成份，如黄酮类﹑口山酮类﹑生物碱类﹑多糖等。其中龙胆多糖为龙胆草中非常重要的有效活性成分内之一,实验显示龙胆多糖有明显的生理活性,具有抗肿瘤﹑抗氧化﹑抗凝血﹑保肝﹑降血脂﹑调节免疫力等作用。目前植物多糖的生理活性及功能越来越受到人们的重视，也成为当今保健品和新药开发的重要研究方向之一，目前对龙胆多糖的研究相对较少，主要是集中在对龙胆粗品的研究。

龙胆粗多糖中含有很多的杂质，其中色素为其中主要的杂质之一，由于色素会影响到后续的分离纯化和结构鉴定等方面，所以脱色是非常重要的步骤。目前多糖的脱色方法很多，主要有过氧化法﹑吸附法(DEAE纤维素﹑活性炭﹑硅藻土﹑树脂法等)﹑金属络合法﹑离子交换树脂法等。其中过氧化氢氧化法和金属络合法容易造成多糖的部分降解，并且氧化色素后的杂质会留在多糖溶液中，需要通过透析去除；活性炭法易造成多糖的损失，脱色时间较久，处理后的活性炭再生困难；DEAE纤维素的价格较贵，成本较高；其中离子交换树脂法用于多糖的脱色方法在欧美国家已经比较普遍，色素大多带阴离子，所以可以用阴离子交换树脂将其去除。本发明通过单因素试验和响应面法研究D941阴离子交换树脂对龙胆多糖色素的去除工艺，并确定最佳纯化的工艺条件，并对树脂的再生实验，以考察树脂的重复利用性，以期为工业化生产和进一步的开发利用提供参考。

发明内容

本发明提供了一种D941阴离子交换树脂对龙胆草多糖的脱色工艺。

本发明的目的在于：提供一种龙胆草多糖的脱色方法，脱色方法方便，无污染，成本低，且D941阴离子交换树脂可以重复利用，脱色效果较好，且多糖的损失较少，适合工业化生产。

本发明的技术解决方案是通过以下技术方案实现的：

首先将龙胆草粉碎并过筛，然后以其干粉为材料按以下工艺流程进行，

一﹑龙胆草粗多糖的提取

(1)脱脂：取龙胆草粉末以料液比1：20加入石油醚，在80℃水浴回流2～4h,减压过滤，将龙胆草粉末放入通风橱中待石油醚挥发完全后，再放入35℃烘箱中烘干，得到脱脂龙胆草粉末。

(2)提取：称取一定量的龙胆草粉末，按料液比1：25(g/mL)的料液比加入去离子水，80℃水浴提取2h，过滤。

(3)浓缩：将提取液在旋转蒸发仪上浓缩至原体积的1/5。

(4)醇沉：取浓缩液，加入4倍体积的无水乙醇，醇沉24h,过滤。

(5)干燥：用无水乙醇﹑丙酮依次洗涤沉淀，自然干燥。

(6)复溶：称取一定量干燥的龙胆草粗多糖，用去离子水在超声波清洗器中超声助溶，使龙胆草多糖的浓度为2mg/mL～6mg/mL。

二﹑龙胆草多糖的脱色

(1)称取一定量的龙胆草粗多糖，加入去离子水在超声波清洗仪中超声震荡溶解，使多糖溶液的浓度在2mg/mL～6mg/mL。

(2)选用规格为20×400的层析柱，加入30cm³的处理好的D941离子交换树脂，并先加入3～4倍体积的去离子水进行平衡，将配制好的多糖溶液从柱端上样，收集流出液，减压浓缩，冷冻干燥后得到脱色后的龙胆多糖。

控制上样浓度为2mg/mL～6mg/mL，上样流速为0.5BV/h～4BV/h，上样量为1BV～9BV；。

本发明中，D941树脂的处理方法如下：

(1)新买的D941树脂的预处理

将新的D941树脂湿法装柱，打开活塞，倒入适量清水洗去杂质，再关闭活塞，加入2倍树脂体积量的饱和食盐水，浸泡树脂12h,然后将食盐水放出，再用适量清水冲洗干净。关闭活塞，加入3倍树脂体积量的4％的NaOH,浸泡4h，再将放尽后用去离子水清洗至流出液为中性；用同样的方法再加入3倍树脂体积量的4％的HCl,浸泡4h，然后用去离子水清洗至中性,最后用去离子水浸泡以备用。

(2)D941树脂的再生处理

将用过的树脂用水冲洗洗至流出液为无色，关闭活塞，用4倍树脂体积的4％的NaOH浸泡24h，再用去离子水冲洗至排出的水为中性，再加入3倍树脂体积量的4％的HCl,浸泡24h，然后用去离子水清洗至中性即可重新使用。

按照本发明方法得到最佳脱色条件为多糖上样量为5BV,上样流速为3BV/h,上样多糖浓度为5mg/mL。，龙胆多糖的脱色率为80.40％％，多糖保留率为80.60％。脱色前的龙胆粗多糖颜色为深棕色，脱色后的龙胆粗多糖为浅黄色，脱色效果明显。

附图说明

图1单因素实验确定不同上样量对D941树脂脱色效果的影响；

图2单因素实验确定不同上样流速对D941树脂脱色效果的影响；

图3单因素实验确定不同上样浓度对D941树脂脱色效果的影响；

图4上样流速和上样浓度交互作用对龙胆多糖脱色工艺影响的响应面图；

图5上样量和上样浓度交互作用对龙胆多糖脱色工艺影响的响应面图；

图6上样量和上样流速交互作用对龙胆多糖脱色工艺影响的响应面图；

图7 D941树脂使用次数与脱色率和多糖保留率的关系。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员能较好地理解本发明的方案，下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明。

本发明提供了一种D941离子交换树脂法脱除龙胆多糖色素的方法，其工艺流程如下：

龙胆草粉碎→过筛→石油醚脱脂→80℃水浴提取→浓缩提取液→醇沉24h→过滤→乙醇﹑丙酮洗涤→干燥→称重→龙胆粗多糖→溶解→上样→收集流出液→浓缩→冷冻干燥→脱色后的多糖。

具体技术方案如下：

1)龙胆草粗多糖的制备

用植物粉碎机将龙胆草粉碎，过60目药筛，称干燥的龙胆草粉末以料液比为1:20(g/mL)加入石油醚，在80℃水浴回流2～4h,抽滤，待沉淀挥发完溶剂后，放入35℃烘箱中烘干。将脱脂后的龙胆草粉末以1：25(g/mL)的料液比加入去离子水，80℃水浴提取2h,先用药筛过滤一次，再抽滤一次，浓缩过滤液，加入4倍体积的乙醇后，放于冰箱中过夜醇沉。然后再减压过滤，并用无水乙醇和丙酮依次清洗沉淀后，放在干燥器中自然干燥，得到龙胆草粗多糖。

2)龙胆草多糖色素吸光度的测定

对龙胆草粗多糖进行全波扫描，结果表明该溶液在可见光区无最大吸收波长。由于该溶液呈现橙黄色，根据互补色原理可知，溶液主要吸收的是蓝色波段的可见光。所以选择了处于该波段中央的450nm为检测波长。

3)最优脱色条件的单因素试验

称取一定质量的龙胆草粗多糖并加入一定量的水，放入超声波清洗器中超声复溶，备用。选用的层析柱，填好30cm³已处理好的D941树脂，并加入3～4倍体积的去离子水进行平衡后备用。上样，收集流出液。以脱色率和多糖保留率为评价指标，从上样量﹑上样流速﹑上样浓度3个方面确定最佳的脱色条件。

①最佳上样量的确定

在上样浓度均为5mg/mL,上样流速为3BV/h的条件下，以不同的多糖溶液上样量(1BV﹑2BV﹑3BV﹑4BV﹑5BV﹑6BV﹑7BV﹑8BV﹑9BV)进行上样。

由图1可知，随着上样量的增大，多糖保留率缓慢升高而脱色率逐渐降低，当上样量大于5BV时，脱色率急剧下降，综合考虑多糖的损失和脱色效果，单因素实验选5BV为最佳上样量。

②最佳上样流速

在上样浓度均为5mg/mL,上样量为5BV的条件下，以不同的上样流速(0.5BV/h﹑1BV/h﹑2BV/h﹑3BV/h﹑4BV/h)进行上样。

由图2所示。随着上样流速的提高，脱色率降低，当流速大于3BV/h时，脱色率急剧下降，这可能是由于流速太大而导致树脂与多糖溶液中的色素接触时间缩短而降低了树脂的吸附能力。而随着上样流速的提高，多糖保留率升高，当流速大于3BV/h时，多糖保留率升高的幅度放缓。综合考虑多糖的损失和脱色效果，单因素实验选择3BV/h为最佳上样流速。

③最佳上样浓度

在样量均为5BV，流速为3BV/h，以不同浓度(2mg/mL﹑3mg/mL﹑4mg/mL﹑5mg/mL﹑6mg/mL)进行上样。

由图3可知，随着上样浓度的增大，多糖保留率缓慢升高，同时脱色率呈降低趋势，当上样浓度大于5mg/mL时，脱色率降低的趋势显著增大，综合考虑多糖的损失和脱色效果，单因素实验选择5mg/mL为最佳上样浓度。

3)响应面法优化最佳脱色条件

在单因素实验的基础上，本发明选取上样浓度(X₁)，上样流速(X₂)，上样量(X₃)为响应因素，以龙胆多糖脱色率(Y₁)和多糖保留率(Y₂)综合得出的值(OD)为响应值。OD＝0.5Y₁+0.5Y₂。采用Box-Behnken实验和响应面分析法，通过Design expert 8.0.6软件，设计3因素3水平的响应面实验，筛选出最佳脱色条件。实验的因素水平表见表1。

表1 响应面分析法的因素水平编码表

表2 响应面法的实验设计及结果

表3 回归模型方差分析

由表3可以看出，该回归模型极显著，说明该模型成立。该模型的R²＝0.9656，R_(Adj) ²＝0.9213，CV％＝2.99，说明实验的可信度与精确度高,拟合程度较好，实验操作可行，可以用此模型来预测龙胆草多糖最佳脱色工艺。

通过模型得到的响应面图见图4～6，通过对响应面图的分析，可知该回归模型中的一次项X₂﹑二次项X₁X₂﹑X₁X₃和X₃ ²对OD值的影响显著，二次项X₁ ²﹑X₂ ²对OD值的影响极显著。说明上样流速对龙胆草多糖脱色工艺影响显著，上样流速和上样体积对龙胆草多糖脱色工艺的影响不显著。各因素对龙胆草多糖脱色工艺的影响大小顺序为：上样量(X₃)＞上样流速(X₂)＞上样浓度(X₁)。

由回归模型预测的最佳脱色工艺条件为上样浓度为4.98mg/mL,上样流速为2.86BV/h,上样浓度为4.68，在该条件下取得最大OD值为0.7679。

验证试验

考虑到实际操作的可行性，将工艺条件改为上样量为5BV,上样流速为3BV/h,上样浓度为5mg/mL。在此优化条件下进行验证试验，测得龙胆草多糖的脱色率(Y₁)为80.40％，多糖保留率(Y₂)为80.60％，算出其OD值为0.805。理论预测值和实测值相比，其相对误差为4.83％，说明本试验建立的二次多项回归模型可以很好地预测因素和效应面之间的变化关系。

树脂的重复利用实验

将使用过的树脂按照上述的再生方法重新处理，再重新使用，按最佳上样条件上样。

由图7所示，D941树脂在使用5次后，脱色率降低的幅度较缓慢，而多糖保留率略有升高，说明该树脂的再生性能较好，可以重复使用，降低成本。

Claims (9)

1.一种龙胆草多糖的脱色方法，其特征在于：首先将龙胆草粉碎并过筛，然后以其干粉为材料按以下工艺流程进行，

一﹑粗多糖的提取

（1）脱脂：取龙胆草粉末以料液比1：20加入石油醚，在80℃水浴回流2～4h,减压过滤，将龙胆草粉末放入通风橱中待石油醚挥发完全后，再放入35℃烘箱中烘干，得到脱脂龙胆草粉末；

（2）提取：称取一定量的龙胆草粉末，按料液比1：25（g/mL）的料液比加入去离子水，80℃水浴提取2h，过滤；

（3）浓缩：将提取液在旋转蒸发仪上浓缩至原体积的1/5；

（4）醇沉：取浓缩液，加入4倍体积的无水乙醇，醇沉24h,过滤；

（5）干燥：用无水乙醇﹑丙酮依次洗涤沉淀，自然干燥；

（6）复溶：称取一定量干燥的龙胆草粗多糖，用去离子水在超声波清洗器中超声助溶，使龙胆草多糖的浓度为2mg/mL～6mg/mL；

二﹑粗多糖的脱色

（1）选用的层析柱，湿法装柱，填入处理好的D941树脂，将配好的龙胆草粗多糖溶液上柱；

（2）收集流出液，将流出液在旋转蒸发仪上浓缩，冷冻干燥，得到脱色后的龙胆草多糖。

2.根据权利要求1所述的龙胆草多糖的脱色方法，其特征在于：控制上样浓度为2mg/mL～6mg/mL，上样流速为0.5BV/h ～4BV/h，上样量为1BV ～9BV。

3.根据权利要求1所述的龙胆草多糖的脱色方法，其特征在于：龙胆多糖溶液的最佳上样浓度为5 mg/mL。

4.根据权利要求1所述的龙胆草多糖的脱色方法，其特征在于：龙胆多糖溶液的最佳上样流速为3BV/h。

5.根据权利要求1所述的龙胆草多糖的脱色方法，其特征在于：龙胆多糖溶液的最佳上样量为5BV。

6.根据权利要求1-5任一项所述的龙胆草多糖的脱色方法，其特征在于：D941树脂的处理方法如下：

（1)新买的D941树脂的预处理

将新的D941树脂湿法装柱，打开活塞，倒入适量清水洗去杂质，再关闭活塞，加入2倍树脂体积量的饱和食盐水，浸泡树脂12h,然后将食盐水放出，再用适量清水冲洗干净；关闭活塞，加入3倍树脂体积量的4%的NaOH,浸泡4h，再将放尽后用去离子水清洗至流出液为中性；用同样的方法再加入3倍树脂体积量的4%的HCl,浸泡4h，然后用去离子水清洗至中性,最后用去离子水浸泡以备用；

（2）D941树脂的再生处理

将用过的树脂用水冲洗洗至流出液为无色，关闭活塞，用4倍树脂体积的4%的NaOH浸泡24h，再用去离子水冲洗至排出的水为中性，再加入3倍树脂体积量的4%的HCl,浸泡24h，然后用去离子水清洗至中性即可重新使用。

7.根据权利要求1所述的龙胆草多糖的脱色方法，其特征在于：样品色素含量的测定方法为，在450nm处测定脱色前后的多糖溶液的吸光度，然后计算出脱色率。

8.根据权利要求1所述的龙胆草多糖的脱色方法，其特征在于：样品多糖含量的测定方法为，取1mL样品，加入5%的苯酚2.00ml，混合均匀后迅速加入浓硫酸7.00ml，摇匀后静置10min，放入沸水浴中20min，冷至室温，在490nm下测吸光度，然后计算出多糖浓度。

9.根据权利要求1所述的龙胆草多糖的脱色方法，其特征在于：在提取粗多糖的脱脂步骤中，使用后的石油醚蒸馏后可以再次利用。