CN101584752A

CN101584752A - 一种牛舌草总黄酮提取纯化工艺

Info

Publication number: CN101584752A
Application number: CNA2009100169998A
Authority: CN
Inventors: 秦大伟; 孟霞; 王世潇; 段洪东
Original assignee: Shandong Institute of Light Industry
Current assignee: Shandong Institute of Light Industry
Priority date: 2009-07-09
Filing date: 2009-07-09
Publication date: 2009-11-25
Anticipated expiration: 2029-07-09
Also published as: CN101584752B

Abstract

本发明涉及一种牛舌草总黄酮成分的提取纯化工艺，提取步骤为：1)取粉碎的牛舌草，以60％乙醇为溶剂，浸泡12小时，以药材质量10～20倍量的30％～50％乙醇为提取剂，用功率为500～1200W的电磁炉加热，减压至小于20Pa回流提取1～3小时，收集提取液，减压回收乙醇，得浓缩液；2)将步骤1得到的提取浓缩液用大孔树脂进行纯化，乙醇溶液洗脱；3)收集步骤2的乙醇洗脱液，浓缩，真空冷冻干燥，得产品。本发明用电磁波加热，减压回流提取，冷冻干燥，对活性成分损害少，节约提取剂。同时，用本发明方法提取的牛舌草提取物产品中总黄酮质量含量可达55％以上，其总黄酮转移率可达90％以上，且重现性好，树脂可重复使用。

Description

一种牛舌草总黄酮提取纯化工艺

技术领域：

本发明涉及一种维吾尔药的提取方法，具体涉及牛舌草总黄酮的提取、纯化和干燥方法。

背景技术：

牛舌草为紫草科植物意大利牛舌草Anchusa italice Retz.或琉璃苣Borage officinales L.的地上部分。夏季花盛期，一般割取地上部分晒干。气微芳香，味淡，具粘性，是维吾尔医治心脑血管疾病的常用药材之一，具有生湿生热、调节异常黑胆质、生湿补脑、祛寒补心、双薪悦智、润燥消炎、止咳平喘等功效。牛舌草的这些作用与其黄酮类成分有密切关系。研究表明黄酮类化合物具有抗菌、抗癌、抗氧化、抗病毒、消炎、降压和清热解毒等作用。由于黄酮类化合物的这些生物活性使得对它的研究进入了一个新的阶段，因此，牛舌草总黄酮的研究开发具有重要的经济效益和社会意义。

另外，牛舌草总提取物成分复杂，因含有较多的糖类而具有吸湿性，容易凝结，颗粒粗、黑，难以选择剂型。因此对牛舌草总黄酮进行纯化，使纯化后的产品符合中药新剂型的需要具有重要的意义。

传统的总黄酮提取方法有热水提取法、醇提法、其它有机溶剂萃取法。其中热水提取法收率很低，并且由于其极性大，易把蛋白质、糖类、无机盐等易溶于水的成分提取出来，因此易霉变，一般提取液存放10天左右就会有发霉、变质现象，提取液过滤、浓缩等操作困难且又费时，黄酮含量低。醇提是提取总黄酮最常用的方法。包括冷浸法、渗流法和回流法。冷浸法虽不需加热，但提取时间长、效率低。渗流法提取效率高、浸液杂质少，但费时长，溶剂用量大，操作麻烦。回流法效率最高，但受热易破坏药材的成分，不宜用此法。其它有机溶剂萃取法，这种方法设备简单，产品得率高，但产品中杂质含量较高，有机溶剂成本也较高。

本研究采用30％～50％乙醇为提取剂，电磁波加热，减压回流提取，提取物冷冻干燥，可减少提取物活性成分的损失，提高提取效率和收率，节约溶剂。利用大孔树脂纯化提取物，可以提高黄酮活性成分纯度和保存期限，使纯化后的产品符合中药新剂型的需要，并在临床和医药行业中得到应用。

发明内容：

本发明的一个目的是提供了一种牛舌草总黄酮的提取、纯化和黄酮类提取物的干燥方法。

本发明提供了一种牛舌草总黄酮的提取方法，由以下具体步骤组成：

1)取粉碎的牛舌草，以60％乙醇为溶剂，浸泡12小时，以药材质量10～20倍量的30％～50％乙醇为提取剂，加热至回流提取，收集提取液，减压回收乙醇，得浓缩液；

2)将步骤1得到的提取液浓缩到每毫升含提取物22.5mg，过滤，滤液用HPD-100或HPD-400或HPD-600或AB-8或D101大孔树脂进行纯化，工艺条件为：上样吸附时间为0～2.0h小时，水洗体积为1BV～3BV，水洗流速为1BV/h～4BV/h，洗脱剂为乙醇，洗脱用乙醇浓度为50％～90％，乙醇洗脱量为1.5BV～4BV，乙醇洗脱速度为1BV/h～4BV/h。

3)收集步骤2的乙醇洗脱液，真空冷冻干燥，收集干燥提取产物，封口，称重，置于干燥处。

本发明提供的牛舌草总黄酮提取方法步骤1中的加热方式选取电磁炉加热，功率为500W～1200W，优选800W。

本发明提供的牛舌草总黄酮提取方法步骤1中的回流方式为减压回流，压力条件＜20Pa，提取时间为1～3小时，优选提取时间为2小时。

本发明提供的牛舌草总黄酮提取方法步骤1中优选条件：以60％乙醇为溶剂，浸泡12小时，以药材质量15倍量的40％乙醇为提取剂，用功率为800W的电磁炉加热，减压至20Pa回流提取2小时。

本发明提供的牛舌草总黄酮提取方法步骤2中优选D101大孔树脂对滤液进行纯化，优选工艺条件为：上样吸附时间为1.0小时，水洗体积为2BV，水洗流速为2BV/h，洗脱剂为乙醇，洗脱用乙醇浓度为70％，乙醇洗脱量为3BV，乙醇洗脱速度为2BV/h。

本发明提供的牛舌草总黄酮提取方法步骤3中冷冻干燥机的真空度小于20Pa，冷凝温度为-40～-60℃，优选-50℃。

本发明提供的牛舌草总黄酮提取方法，获得牛舌草提取物的总黄酮质量含量＞55％，总黄酮转移率＞90％。

本发明具有以下优点：

1.减少提取物活性成分的损失。牛舌草有效活性成分对热不稳定，本发明以合适浓度乙醇为溶剂，采用电磁波加热，且减压回流，提取温度低，从而减少了因过热而引起的提取物活性损失。同时，本发明对提取物采用冷冻干燥，能够很好的保持提取物的有效活性。

2.本发明所采用的提取方法可以提高提取效率和收率，节约溶剂。

3.本发明以乙醇为溶剂和洗脱剂，价廉、无毒。

4.本发明采用D101大孔树脂进行纯化。该树脂价格较低，而且安全性较高，是目前国内药品行业中使用最多的一种大孔树脂。

5.本发明获得牛舌草提取物中的总黄酮质量含量＞55％，总黄酮转移率＞90％。

附图说明：

图1为吸附时间对总黄酮回收率和纯度的影响。

图2为洗脱剂浓度对总黄酮回收率的影响。

图3为70％乙醇对牛舌草总黄酮的洗脱曲线图。

具体实施方式：

本发明将结合具体实施例作进一步说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

实施例1本发明的一种牛舌草总黄酮的提取方法

1)取粉碎的牛舌草100g，以60％乙醇为溶剂，浸泡12小时，以药材质量15倍量的40％乙醇为提取剂，用功率为800W的电磁炉加热，减压至20Pa回流提取2小时，收集提取液，过滤，减压回收乙醇，浓缩至每毫升含提取物22.5mg。

2)将牛舌草浓缩提取液上柱，控制流出液流速为1BV/h，至提取液全部进入树脂床，静置1小时，让其充分吸附。以2BV体积的去离子水冲洗树脂床，控制流出液流速为2BV/h，以除去未被树脂吸附部分，用3BV的70％乙醇洗脱，流速为2BV/h，收集洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，真空度小于20Pa，冷凝温度为-50℃，即得干燥的纯化产物2.64g，总黄酮质量含量为57.8％，总黄酮转移率为92.8％。

实施例2电磁炉工作功率对总黄酮提取的影响

取粉碎的牛舌草三份，每份100g，以60％乙醇为溶剂，浸泡12小时，以药材质量15倍量的40％乙醇为提取剂，分别用功率为500W、800W、1200W的电磁炉加热，减压至20Pa回流提取2小时，收集提取液，过滤，减压回收乙醇，浓缩至每毫升含提取物22.5mg，利用分光光度法，测吸光度计算总黄酮含量，由此得出总黄酮收量分别为2.28g、2.54g、2.56g。电磁炉工作功率为800W和1200W时总黄酮收量分别为2.54g、2.56g，为节约用电，优选800W。

实施例3减压回流提取的时间对总黄酮提取的影响

取粉碎的牛舌草三份，每份100g，以60％乙醇为溶剂，浸泡12小时，以药材质量15倍量的40％乙醇为提取剂，用功率为800W的电磁炉加热，分别减压至20Pa回流提取1小时、2小时、3小时，收集提取液，过滤，减压回收乙醇，浓缩至每毫升含提取物22.5mg，利用分光光度法，测吸光度计算总黄酮含量，由此得出总黄酮收量分别为2.34g、2.54g、2.60g。当提取时间为3小时时总黄酮收率最高，考虑到收率和节约问题，优选提取时间为2小时。

实施例4总黄酮提取工艺正交实验

分别称取9份粉碎牛舌草，每份100g，用60％乙醇浸泡12小时后，按表1的因素水平分别进行正交试验，均提取1次，收集提取液，过滤，减压浓缩，真空冷冻干燥至恒重，并采用分光光度法测量提取物中总黄酮的含量，通过该指标进行比较。结果见表2。

表1牛舌草总黄酮提取工艺因素水平表

表2总黄酮提取工艺正交实验表

由上述正交表中各数据，可以看出，正交实验中四因素对结果的影响大小依次为：提取时间＞乙醇浓度＞乙醇用量＞电磁炉功率，由数据可以得出：提取时间为显著影响因素，其最佳提取条件为：A2B2C1D2。即减压回流提取2小时、40％乙醇、15倍乙醇用量、电磁炉功率800W。

实施例5五种树脂对牛舌草总黄酮的静态吸附与解吸试验

称取1g干树脂，分别装入100ml锥形瓶中，各加入浓度为13.45mg/ml的样品溶液20ml。每隔10min振荡10s，持续2h，静置24h，使其达到饱和吸附，抽滤，取滤液1.0ml，利用分光光度法求得样品的黄酮含量。按下式计算树脂吸附量：

吸附量＝[初始质量浓度-剩余质量浓度]×溶液体积/树脂量

将滤出的树脂另置100ml锥形瓶中，加入70％乙醇20ml，每隔10min振荡10s，持续2h，抽滤，取滤液1.0ml，利用分光光度法求得样品的黄酮含量。按下式计算解吸率(％)：

解吸率＝[解吸液浓度×解吸液体积]/吸附量×100％

表3五种树脂静态饱和吸附量及静态洗脱率测定结果

通过表3可知，HPD-400的吸附量最大，D101其次，两者的差距很小，解吸率也相近，但D101一般用作黄酮类化合物的吸附，故选择D101型吸附树脂。

实施例6冲洗杂质用水体积

称取已处理的D101型树脂3份(每份相当于干树脂8g)，湿法装柱，上柱黄酮提取液50ml(22.5mg/ml)，控制流出液流速为1BV/h，至提取液全部进入树脂床，静置1小时，让其充分吸附，分别用1BV、2BV、3BV蒸馏水以2BV/h的速度冲洗，继续用3BV的70％乙醇洗脱，流速为2BV/h，收集洗脱液，测其吸光度，计算总黄酮含量。结果表明总黄酮回收率分别为89.3％、88.7％、89.4％，总黄酮的纯度分别为45.3％、45.7％、44.3％，数据结果表明洗脱水用量对总黄酮回收率和纯度无明显影响。为减少洗脱用水，缩短洗脱时间且充分冲洗杂质，选择2BV为洗脱杂质用水量。

实施例7洗脱剂流速对纯化的影响

称取已处理的D101型树脂3份(每份相当于干树脂8g)，湿法装柱，上柱黄酮提取液50ml(22.5mg/ml)，控制流出液流速为1BV/h，至提取液全部进入树脂床，静置1小时，让其充分吸附，以2BV蒸馏水，2BV/h速度冲洗后，以3BV的70％的乙醇溶液进行洗脱，流速分别为1BV/h、2BV/h、3BV/h、4BV/h，纯化后总黄酮回收率分别为95.23％，94.47％，92.19％，89.67％。洗脱剂流速1BV/h比2BV/h的回收率高，但相差不大，为了提高效率，洗脱剂流速选择2BV/h。

实施例8D101大孔吸附树脂动态吸附-洗脱实验洗脱用醇的体积

称取已处理的D101型树脂3份(每份相当于干树脂8g)，湿法装柱，上柱黄酮提取液50ml(22.5mg/ml)，控制流出液流速为1BV/h，至提取液全部进入树脂床，静置1小时，让其充分吸附，以2BV蒸馏水，2BV/h速度冲洗后，分别用2BV、3BV、4BV的70％乙醇洗脱，流速为2BV/h，收集洗脱液，测吸光度计算总黄酮含量。结果表明总黄酮的回收率分别为87.6％、93.4％、95.2％。洗脱用量过多会增加洗脱时间，同时造成一定的浪费，故选择3BV的70％乙醇进行洗脱。

实施例9吸附时间对总黄酮回收率的影响

取五根相同规格的玻璃色谱柱，称取已处理的D101型树脂3份(每份相当于干树脂8g)，湿法装柱，上柱黄酮提取液50ml(22.5mg/ml)，控制流出液流速为1BV/h，吸附时间分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0h，以2BV蒸馏水，2BV/h速度冲洗后，用3BV的70％的乙醇溶液进行洗脱，流速为2BV/h。收集洗脱液，测其总黄酮含量，计算总黄酮回收率，结果如图1所示。

由图1可知，吸附时间超过1.0小时时，回收率明显下降，被树脂吸附的部分黄酮化合物难以被洗脱。吸附时间为零时总黄酮的回收率最高，但纯化效果不好，除黄酮以外的其它成分也未充分吸附，导致黄酮的纯度不高，仅有37.5％。当吸附时间为1.0小时时总黄酮的纯度最高，为55.3％，故吸附时间宜为1.0小时。

实施例10洗脱剂浓度对总黄酮回收率的影响

称取已处理的D101型树脂3份(每份相当于干树脂8g)，湿法装柱，上柱黄酮提取液50ml(22.5mg/ml)，控制流出液流速为1BV/h，吸附1h，以2BV蒸馏水，2BV/h速度冲洗后，分别用浓度为10％、30％、50％、70％、90％的3BV乙醇水溶液进行洗脱，流速为2BV/h。收集洗脱液，测定黄酮的吸光度并计算总黄酮的回收率。

随着乙醇浓度的增加，总黄酮的回收率逐步增加，当高于50％时趋于缓和。90％时最高，但耗费太大，且当乙醇浓度为50％、70％、90％时，总黄酮的纯度分别为48.6％，58.3％，54.1％，宜选乙醇溶液浓度为70％。

实施例11乙醇对牛舌草总黄酮的洗脱实验。

Claims

1.一种牛舌草总黄酮提取物的提取方法，其特征是：提取步骤为：

2)将步骤1得到的提取液浓缩到每毫升含提取物22.5mg，过滤，滤液用HPD-100或HPD-400或HPD-600或AB-8或D101大孔树脂进行纯化，工艺条件为：上样吸附时间为0～2.0小时，水洗体积为1BV～3BV，水洗流速为1BV/h～4BV/h，洗脱剂为乙醇，洗脱用乙醇浓度为50％～90％，乙醇洗脱量为1.5BV～4BV，乙醇洗脱速度为1BV/h～4BV/h；

3)收集步骤2的乙醇洗脱液，真空冷冻干燥，得干燥的纯化产品。

2.如权利要求1所述的牛舌草总黄酮提取物的提取方法，其特征是：所述步骤1中的加热方式为电磁炉加热，功率为500W～1200W。

3.如权利要求1所述的牛舌草总黄酮提取物的提取方法，其特征是：所述步骤1中的回流方式为减压回流，压力条件小于20Pa，提取时间为1～3小时。

4.如权利要求1所述的牛舌草总黄酮提取物的提取方法，其特征是：所述步骤3中冷冻干燥机的真空度小于20Pa，冷凝温度为-40～-60℃。

5.如权利要求1所述的牛舌草总黄酮提取物的提取方法，其特征是：获得牛舌草提取物中的总黄酮质量含量＞55％，总黄酮转移率＞90％。