CN114235974B - 检测牛舌草或其提取物中芦丁、异槲皮苷和迷迭香酸含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了检测牛舌草或其提取物中芦丁、异槲皮苷和迷迭香酸含量的方法，所述方法包括：将牛舌草提取物或者牛舌草经提取处理所得提取物进行液相色谱检测，基于检测结果确定芦丁、异槲皮苷和迷迭香酸含量；其中，所述液相色谱检测中采用的流动相为乙腈和磷酸溶液。利用本发明的方法可以准确地确定牛舌草或其提取物中芦丁、异槲皮苷和迷迭香酸含量，具有专属性强、准确度高、重现性好、灵敏度高、耐用性好、明显改善色谱峰形和拖尾现象等优点。该方法可用于牛舌草或其提取物的质量控制，促进对牛舌草药用价值的开发和研究。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域。具体地，本发明涉及检测牛舌草或其提取物中芦丁、异槲皮苷和迷迭香酸含量的方法。
背景技术
维药牛舌草为紫草科植物意大利牛舌草Anchusa italica Retz.的干燥全草，仅收载于卫生部药品标准-维吾尔药分册，未收载于中国药典。牛舌草具有生湿生热、异常黑胆质、爽身悦志、增强支配器官及感觉器官的功能、强化自然力、通便的作用。牛舌草中的化学成分主要为芦丁、异槲皮苷、黄花苷等16种总黄酮类成分以及迷迭香酸等5种酚酸类成分。现代药理学表明，芦丁具有抗炎、抗氧化、抗过敏、抗病毒等功效；异槲皮苷具有抗炎、降血压、杀虫、降酶等功效；迷迭香酸具有抗炎活性，同时还具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤活性等多方面药理。
目前，牛舌草药材现行质量标准中主要有性状和显微鉴别等检测项目，现行质量标准仍不全面和完善，虽然研究人员已对牛舌草展开了一系列研究，但牛舌草的含量测定指标主要以芦丁为主，无法对牛舌草中其他有效成分进行定量分析，因此，关于牛舌草检测的相关研究仍有待深入进行。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了检测牛舌草或其提取物中芦丁、异槲皮苷和迷迭香酸含量的方法，利用该方法可以准确地确定牛舌草或其提取物中芦丁、异槲皮苷和迷迭香酸含量，具有专属性强、准确度高、重现性好、灵敏度高、耐用性好、明显改善色谱峰形和拖尾现象等优点。该方法可用于牛舌草或其提取物的质量控制，促进对牛舌草药用价值的开发和研究。
在本发明的一个方面，本发明提出了一种检测牛舌草或其提取物中芦丁、异槲皮苷和迷迭香酸含量的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将牛舌草提取物或者牛舌草经提取处理所得提取物进行液相色谱检测，基于检测结果确定芦丁、异槲皮苷和迷迭香酸含量；其中，所述液相色谱检测中采用的流动相为乙腈和磷酸溶液。
研究发现，牛舌草的组成成分多达20多种，较为复杂，各物质之间的特性存在差异，如何从众多组分中有效地分离出芦丁、异槲皮苷和迷迭香酸并获知其含量是很困难的。为此，本发明的发明人经过大量实验发现，采用液相色谱进行检测时，流动相的种类会显著影响芦丁、异槲皮苷和迷迭香酸的分离效果，尤其是难于分离的芦丁和异槲皮苷，不当的流动相容易出现不出峰、出峰时间不当、与其他组分的分离度低等问题，进而导致这三个组分的含量测定不准确。进而，发明人经过大量实验筛选出最佳的流动相—乙腈和磷酸溶液，由此，可以准确地确定牛舌草或其提取物中芦丁、异槲皮苷和迷迭香酸含量，具有专属性强、准确度高、重现性好、灵敏度高、耐用性好、明显改善色谱峰形和拖尾现象等优点，检测限可低至0.5μg/ml～2μg/ml。该方法可用于牛舌草或其提取物的质量控制，促进对牛舌草药用价值的开发和研究。
根据本发明的实施例，上述检测牛舌草或其提取物中芦丁、异槲皮苷和迷迭香酸含量的方法还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，所述磷酸溶液的浓度为0.1～0.3体积％。由此，可以提高各组分之间的分离度，各组分的峰型好，出峰时间适宜，从而进一步提高检测结果的准确性。
根据本发明的实施例，所述流动相中，所述乙腈与磷酸溶液的体积比为(20～60)：(40～80)。发明人经过大量实验得到上述配比，由此，可以提高各组分之间的分离度，各组分的峰型好，出峰时间适宜，从而进一步提高检测结果的准确性。
根据本发明的实施例，所述液相色谱检测中采用等度洗脱方式进行。相比于采用梯度洗脱方式，采用等度洗脱方式可以使得各组分的峰型好，出峰时间适宜，分离度高，并且操作简便，成本低。
根据本发明的实施例，所述液相色谱检测中采用的流速为0.8～1.2mL。发明人经过大量实验得到上述流速，由此，可以提高各组分之间的分离度，尤其是有利于芦丁和异槲皮苷分离，各组分的峰型好，出峰时间适宜，从而进一步提高检测结果的准确性。
根据本发明的实施例，所述液相色谱检测中采用的检测波长为250～400nm。发明人经过大量实验得到上述检测波长，由此，吸收强度较大，检测灵敏度较高，效果较佳。
根据本发明的实施例，所述液相色谱检测中采用的柱温为25～35℃。发明人综合考虑了固定相、流动相、检测效果各方面因素，最终选择上述柱温，在该温度范围内，分离度、峰型如半峰宽、峰高等均较佳。
根据本发明的实施例，所述液相色谱检测中采用的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。发明人经过大量实验得到上述色谱柱，由此，可以进一步提高检测结果的准确性和分离度，各组分的峰型好，出峰时间适宜。
根据本发明的实施例，所述提取处理包括：将所述牛舌草与甲醇水溶液进行混合，将所得混合液进行热回流提取或者超声提取10～30分钟，冷却，定容，过滤，收集滤液，得到所述提取液。由此，可以有效地提取出芦丁、异槲皮苷和迷迭香酸。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种牛舌草或其提取物的质控方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：采用前面所述检测牛舌草或其提取物中芦丁、异槲皮苷和迷迭香酸含量的方法对牛舌草或其提取物进行检测，得到芦丁、异槲皮苷和迷迭香酸含量；分别将所述芦丁、异槲皮苷和迷迭香酸含量与各自相应的阈值进行比对分析，确定所述牛舌草或其提取物的质量是否达标。如前所述，利用根据本发明实施例的方法可以准确地确定牛舌草或其提取物中芦丁、异槲皮苷和迷迭香酸含量，将测定结果与各自对应的阈值进行比对分析，从而可以实现牛舌草或提取物的质控。
需要说明的是，本发明所描述的“阈值”也即“质控线”，即达到要求所需要满足的条件值，例如芦丁、异槲皮苷和迷迭香酸各自的含量均不低于90％、95％、99％、99.5％、99.9％等，具体参数可以根据实际生产需要灵活选择，本发明不做严格限定。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明实施例1中HPLC法测定空白溶液中芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸含量的谱图；
图2显示了根据本发明实施例1中HPLC法测定对照品溶液中芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸含量的谱图；
图3显示了根据本发明实施例1中HPLC法测定供试品溶液中芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸含量的谱图；
图4显示了根据本发明实施例2中HPLC法测定空白溶液中芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸含量的谱图；
图5显示了根据本发明实施例2中HPLC法测定对照品溶液中芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸含量的谱图；
图6显示了根据本发明实施例2中HPLC法测定供试品溶液中芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸含量的谱图；
图7显示了根据本发明对比例1中HPLC法测定空白溶液中芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸含量的谱图；
图8显示了根据本发明对比例1中HPLC法测定对照品溶液中芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸含量的谱图；
图9显示了根据本发明对比例1中HPLC法测定供试品溶液中芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸含量的谱图。
图10显示了根据本发明对比例2中HPLC法测定空白溶液中芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸含量的谱图；
图11显示了根据本发明对比例2中HPLC法测定对照品溶液中芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸含量的谱图；
图12显示了根据本发明对比例2中HPLC法测定供试品溶液中芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸含量的谱图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明提出了一种检测牛舌草或其提取物中芦丁、异槲皮苷和迷迭香酸含量的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：
(1)供试品溶液的制备：取牛舌草粉末0.1～0.5g，置250ml锥形瓶中，加入溶剂50～90体积％甲醇水溶液50ml，热回流提取、超声提取10～30min，冷却至室温，加对应溶剂补重至刻度，摇匀，滤膜过滤，取续滤液即得所述供试品溶液。
对照品溶液的制备：取芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸适量，加50体积％甲醇水溶液溶解，制成每1ml含芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸各10～50μg的混合对照品溶液；
(2)分别取所述供试品溶液和对照品溶液各5～50μl，按照下述色谱条件，注入配备紫外检测器的高效液相色谱仪，记录色谱图。基于对照品溶液中芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸的浓度及获得的色谱图中这三种物质的响应值，绘制这三种物质的标准曲线，将供试品溶液的色谱图中的响应值代入标准曲线中，计算确定牛舌草中芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸含量。
色谱条件：采用Waters Xselect CSH C18，4.6×250mm，5μm或与其等效的色谱柱，以体积比为20～70:30～80的甲醇-0.1体积％～0.3体积％磷酸水溶液为流动相，检测波长为250～400nm，流速为0.8～1.2ml/min，柱温为25～40摄氏度，梯度洗脱。
采用根据本发明实施例的检测方法可以准确地确定牛舌草或其提取物中芦丁、异槲皮苷和迷迭香酸含量，具有专属性强、准确度高、重现性好、灵敏度高、耐用性好、明显改善色谱峰形和拖尾现象等优点，检测限可低至0.5μg/ml～1.5μg/ml。该方法可用于牛舌草或其提取物的质量控制，促进对牛舌草药用价值的开发和研究。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
在该实施例中，以HPLC法对维药牛舌草中芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸含量进行定量分析，具体如下：
a)色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters Xselect CSHC18，4.6×250mm,5μm)；以乙腈-0.1体积％磷酸水溶液(体积比为50:50)为流动相，等度洗脱；检测波长为380nm；柱温为25℃；流速为1.2ml/min。
b)供试品溶液制备：取牛舌草粉末0.1g，置250ml锥形瓶中，加入溶剂70体积％甲醇水溶液50ml，热回流提取10min，冷却至室温，加70体积％甲醇水溶液补重至刻度，摇匀，有机系0.45μm滤膜过滤，摇匀，滤过，取滤液即得。
c)对照品溶液制备：取芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸适量，加50体积％甲醇溶解，制成每1ml含芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸各30μg的混合对照品溶液。
d)分别精密吸取空白溶液、对照品溶液、供试品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，进行测定，即得。
HPLC法测定空白溶液(70体积％甲醇)中芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸含量的谱图见图1，HPLC法测定对照品溶液中芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸含量的谱图见图2，HPLC法测定供试品溶液中芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸含量的谱图见图3。
由图1至图3可以看出，空白溶液对芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸的测定无干扰；芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸的色谱峰达到完全分离，且具有较大的分离度(大于1.5)，芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸的理论塔板数和灵敏度也较高；芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸的峰形较对称，拖尾因子小于1.5，均能满足定量检测要求。
实施例2
在该实施例中，以HPLC法对维药牛舌草中芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸含量进行定量分析，具体如下：
a)色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters Xselect CSHC18，4.6×250mm,5μm或等效色谱柱)；以乙腈-0.3体积％磷酸水溶液(30:70)为流动相，等度洗脱；检测波长为280nm；柱温为35℃；流速为0.8ml/min。
b)供试品溶液制备：取牛舌草粉末0.2g，置250ml锥形瓶中，加入溶剂50体积％甲醇水溶液40ml，热回流提取30min，冷却至室温，加50体积％甲醇水溶液补重至刻度，摇匀，有机系0.45μm滤膜过滤，摇匀，滤过，取续滤液即得。
c)对照品溶液制备：取芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸适量，加50体积％甲醇溶解，制成每1ml含芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸各20μg的混合对照品溶液。
d)分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，进行测定，即得。
HPLC法测定空白溶液(50体积％甲醇)中芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸含量的谱图见图4，HPLC法测定对照品溶液中芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸含量的谱图见图5，HPLC法测定供试品溶液中芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸含量的谱图见图6。
由图4至图6可以看出，空白溶液对芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸的测定无干扰；芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸的色谱峰达到完全分离，且具有较大的分离度，芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸的理论塔板数和灵敏度也较高；芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸的峰形较对称，拖尾因子小于1.5，均能满足定量检测要求。
对比例1
按照实施例1的方法检测牛舌草中芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸含量，区别在于，将流动相中的乙腈换为甲醇进行，具体步骤如下：
a)色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters Xselect CSHC18，4.6×250mm,5μm)；以甲醇-0.1体积％磷酸水溶液(体积比为50:50)为流动相，等度洗脱；检测波长为360nm；柱温为35℃；流速为1.2ml/min。
b)供试品溶液制备：取牛舌草粉末0.1g，置250ml锥形瓶中，加入溶剂70体积％甲醇水溶液50ml，热回流提取10min，冷却至室温，加70体积％甲醇水溶液补重至刻度，摇匀，有机系0.45μm滤膜过滤，摇匀，滤过，取滤液即得。
c)对照品溶液制备：取芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸适量，加50体积％甲醇溶解，制成每1ml含芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸各30μg的混合对照品溶液。
d)分别精密吸取空白溶液、对照品溶液、供试品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，进行测定，即得。
HPLC法测定空白溶液(70体积％甲醇)中芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸含量的谱图见图7，HPLC法测定对照品溶液中芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸含量的谱图见图8，HPLC法测定供试品溶液中芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸含量的谱图见图9。
由图7至图9可以看出，空白溶液对芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸的测定无干扰；芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸的色谱峰达到完全分离，且具有较大的分离度，芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸的理论塔板数和灵敏度也较高；但迷迭香酸的峰形处基线不平，峰形不是完全对称，拖尾因子较大，重现性较差，本方法用乙腈作为溶剂，迷迭香酸的峰形处基线平整，峰形完全对称，拖尾因子符合要求，重现性好，即本方法更佳。
对比例2
按照实施例1的方法检测牛舌草中芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸含量，区别在于，洗脱方式不同，具体步骤如下：
a)色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters Xselect CSHC18，4.6×250mm,5μm或等效色谱柱)；流动相A：0.05体积％磷酸水溶液；流动相B：乙腈；梯度洗脱，详见表1；检测波长为380nm；柱温为25℃；流速为1.2ml/min。
表1梯度洗脱条件
b)供试品溶液制备：取牛舌草粉末0.1g，置250ml锥形瓶中，加入溶剂70体积％甲醇水溶液50ml，热回流提取10min，冷却至室温，加70体积％甲醇水溶液补重至刻度，摇匀，有机系0.45μm滤膜过滤，摇匀，滤过，取续滤液即得。
c)对照品溶液制备：取芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸适量，加50体积％甲醇溶解，制成每1ml含芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸各30μg的混合对照品溶液。
d)分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，进行测定，即得。
HPLC法测定空白溶液(70体积％甲醇)中芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸含量的谱图见图10，HPLC法测定对照品溶液中芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸含量的谱图见图11，HPLC法测定供试品溶液中芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸含量的谱图见图12。
由图10至图12可以看出，空白溶液对芦丁、异槲皮苷、迷迭香酸的测定无干扰；芦丁、迷迭香酸的色谱峰达到完全分离，但异槲皮苷未达到完全分离、分离度未达到1.5，即本方法等度洗脱，可以使三种成分达到完全分离，本方法条件更佳。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (3)
1.一种检测牛舌草或其提取物中芦丁、异槲皮苷和迷迭香酸含量的方法，其特征在于，包括：
将牛舌草提取物或者牛舌草经提取处理所得提取物进行液相色谱检测，基于检测结果确定芦丁、异槲皮苷和迷迭香酸含量；
其中，所述液相色谱检测中，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为50:50的乙腈-0.1体积％磷酸水溶液为流动相，等度洗脱；检测波长为380nm；柱温为25℃；流速为1.2ml/min；或者
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为30:70的乙腈-0.3体积％磷酸水溶液为流动相，等度洗脱；检测波长为280nm；柱温为35℃；流速为0.8ml/min；
所述提取处理包括：
将所述牛舌草与甲醇水溶液进行混合，将所得混合液进行热回流提取或者超声提取，冷却，定容，过滤，收集滤液，得到所述提取物；
所述牛舌草提取物是通过所述提取处理得到的。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取处理包括：
将所述牛舌草与甲醇水溶液进行混合，将所得混合液进行热回流提取或者超声提取10~30分钟，冷却，定容，过滤，收集滤液，得到所述提取物。
3.一种牛舌草或其提取物的质控方法，其特征在于，包括：
采用权利要求1或2所述检测牛舌草或其提取物中芦丁、异槲皮苷和迷迭香酸含量的方法对牛舌草或其提取物进行检测，得到芦丁、异槲皮苷和迷迭香酸含量；
分别将所述芦丁、异槲皮苷和迷迭香酸含量与各自相应的阈值进行比对分析，确定所述牛舌草或其提取物的质量是否达标。
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