CN112314626A - 一种提高连作丹参种苗活力生物刺激素的制备及应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高连作丹参种苗活力生物刺激素的制备及应用方法，该生物刺激素由成团泛菌（Pantoea agglomerans strain）HX‑1，CGMCC No.17646、芽孢杆菌（Bacillus sp.）MGW9，CGMCC No.18690、2,4‑表油菜素内酯和载体葡萄糖组成。本发明提供的生物刺激素可以缓解丹参连作障碍，提高丹参连作障碍抗性，并具有植株促生、提高/保证根部主要药用活性成分含量、修复连作土壤等功效，特别是成本低廉，操作简单，易于产业化实施。

Description

一种提高连作丹参种苗活力生物刺激素的制备及应用方法
技术领域
本发明涉及一种提高连作丹参种苗活力生物刺激素的制备及应用方法，可以缓解丹参连作障碍，提高丹参连作障碍抗性，并具有植株促生、提高/保证根部主要药用活性成分含量、修复连作土壤等功效，特别是成本低廉，操作简单，易于产业化实施。
背景技术
中药材连作是指在同一块地里连续种植同种(或同科)药用植物。中药材连作障碍是指同种(或同科)药用植物连作以后, 即使在正常管理情况下, 也会产生产量下降、品质变劣、生育状况变差的现象。约70%以根或根茎作为传统药物的药用植物连作时都易出现连作障碍，包括人参、地黄和三七等，这严重影响药用植物的可持续发展，已成为当前药用植物产业亟待解决的重大问题。
丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）为唇形科鼠尾草属多年生草本植物，以干燥根及根茎入药，属于大宗药材之一，它具有活血化癖，通经止痛，清心除烦等功效，已成为我国治疗心脑血管疾病的骨干药材。丹参中主要有效成分包括丹酚酸B和丹参酮等，其含量是评价丹参质量的重要标准。近年来，国内外市场对丹参药材的需求量日益增加，但丹参的野生资源在减少，适宜人工栽培丹参的道地产区有限，导致其重茬连作现象普遍。由于丹参忌连作，常常因连作栽培而出现连作障碍，使植株生长发育异常、土传根病加重、产量与品质下降，致使丹参根部主要药用活性成分含量降低，严重阻碍了丹参产业的可持续发展。
丹参连作障碍发生原因主要集中在土传病害加重、土壤理化性质恶变、残体腐解物和根系分泌物化感作用等方面。近年来，化感自毒作用引起了许多研究者的兴趣，特别是丹参根系分泌物逐年积累产生自毒作用，已成为丹参连作障碍发生的重要原因之一。丹参根际向土壤中分泌次生代谢物质，这些物质的产生与释放，会引起土壤微生物多样性的变化，尤其是易导致土壤中的有益微生物减少，致病菌增加，使丹参易受病原菌侵害，而造成重茬丹参的生长障碍。
连作障碍的调控技术主要有合理轮作与间作、清园与消毒、改土与施肥、施用有机物料、嫁接、施用有益菌、选育抗性品种和施用植物源农药等。目前对丹参连作障碍的防治以化学防治为主，并有较好防效，但一些化学药剂毒性大，过多使用会影响丹参产品的安全性，同时也会对土壤造成污染。因此做好连作丹参防控工作，研发一套安全有效的防控技术及产品以缓解丹参连作障碍，提高丹参产量和品质一直备受人们关注，并已成为现代丹参产业健康发展亟待解决的重大课题。
近年来，生物刺激素已成为全球农资市场上一个极其时尚的名词。按照国际组织定义，生物刺激素是一种包含某些成分和微生物的物质，这些成分和微生物在施用于植物或其根际时，对植物的自然进程起到刺激促生作用，包括加强/有益于营养吸收、营养功效、非生物胁迫耐抗能力及作物品质等，而与营养成分无关。在欧洲，生物刺激素的使用已涉及果树(柑橘、橄榄、葡萄等)、蔬菜和水果(西兰花、辣椒、黄瓜、草莓、西红柿、甜瓜等)、粮食作物(土豆、小麦、玉米、油菜等)和花卉、苗圃等，并取得了良好的效果。
目前我国利用生物刺激素产品提高丹参连作种苗活力的报道甚少。针对丹参连作障碍问题，研发目标生物刺激素产品已成为一种丹参高效生产策略，能够实现提质增效、绿色生产，这对加快我国新旧动能转换、保障我国丹参产业可持续性发展具有重要作用。
基于有益微生物的分离鉴定，结合其他有效物质成分，研发生物刺激素新产品，加以科学应用，以改善丹参植株根际环境、增强丹参连作障碍抗性、保证/提高根部药用活性成分含量、修复连作土壤等，这具有巨大的市场空间和发展潜力，非常值得我们去研发。
发明内容
本发明的目的在于满足生物刺激素市场的需求和克服现有技术不足，提供一种提高丹参连作障碍抗性生物刺激素的制备及应用方法，该生物刺激素的制备及应用具有改善丹参植株根际环境、增强丹参连作障碍抗性、保证/提高丹参根部药用活性成分含量、修复连作土壤等功效，以满足我国丹参产业可持续发展需要。
为了实现上述目的，本发明基于生物刺激素对植物的自然进程起到刺激促生作用，特别是提高植物生长对非生物胁迫的耐抗能力。围绕“提高丹参连作障碍抗性”这一目标，广泛收集目标有益微生物的可能来源样本，并通过分离、鉴定、功能分析等一系列作业，获得目标菌株，结合其他组分（如：化学药剂等）探索目标生物刺激素制备的最适配方。本发明采用以下技术方案来实现一种提高丹参连作障碍抗性生物刺激素的制备及应用方法，主要包括以下作业：（1）丹参连作障碍（自毒）抗性评价体系构建；（2）有益菌株和化学药剂组分的筛选和利用；（3）生物刺激素的制备；（4）生物刺激素应用实效检测。
所述作业（1）中，基于前期大量试验结果，丹参连作障碍（自毒）抗性评价指标主要包括幼苗生长指标、叶片生理指标、根系生理指标、根部主要药用活性成分含量指标、根际土壤酶活性指标、根际土壤矿质氮指标、土壤酚酸类物质含量指标等。
所述作业（2）中，根据研发目标，筛选菌源，开展菌株分离筛选、纯化、鉴定等系列工作。本发明菌源为两个：一个是青岛崂山（120.47E，36.10N）收集到的新鲜藿香植株组织（样品经原青岛农业大学现广西中医药大学谭勇教授鉴定为藿香植株）；另一个是甘肃省山丹县明长城(Ming Great Wall)附近（100.88E，38.84N）收集到的极度干旱的土壤样品；基于大量试验筛选鉴定及功能分析，分别获得的两个有益菌株：成团泛菌（Pantoea agglomerans strain）HX-1和菌株芽孢杆菌（Bacillus sp.）MGW9。菌株以25％甘油作冷冻保护剂，-80℃超低温冰箱保存，保存地点为：青岛农业大学农学院种子科学与工程实验室，并在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所）进行了备份保存。
菌株HX-1在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保存登记入册编号（CGMCC No.）为17646；经保藏中心于2019年04月29日检测结果为存活；建议的分类命名为：Pantoea agglomerans strain。
菌株MGW9在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保存登记入册编号（CGMCC No.）为18690；经保藏中心于2019年10月16日检测结果为存活；建议的分类命名为：Bacillus sp.。
化学药剂组分筛选：围绕安全有效基本原则，本发明化学药剂组分选用2,4-表油菜素内酯。
油菜素内酯(Brassinosteroids, BRs)是一种甾醇类新型植物激素，广泛存在于植物体内，能够与其他信号分子和其他植物激素相互联系、相互作用，共同调控植物的生长发育，被称为第六大类植物激素。它能够通过调控植物体内抗氧化系统活性、膜脂过氧化程度、渗透平衡和离子稳态平衡，进而提高植物的抗逆性。
所述作业（3）中，生物刺激素制备：主要包括微生物菌剂组分、化学药剂组分和载体组分的选配制备。
所述作业（4）中，对目标生物刺激素进行连作障碍胁迫下丹参生产应用实效验证及使用方法研究。
本发明的有益效果是：基于生物刺激素可对植物的自然进程起到刺激促生作用，特别是具有提高对非生物胁迫的耐抗能力等功效。为提高丹参连作障碍抗性，保障丹参产量和品质，本发明通过（1）丹参连作障碍（自毒）抗性评价体系构建；（2）有益菌株和化学药剂等组分的筛选和利用；（3）生物刺激素的制备；（4）生物刺激素应用实效检测等作业获得目标生物刺激素及其使用方法。目标生物刺激素制备方法简单易行，成本低廉，易于产业化实施；合理使用可缓解丹参连作障碍，提高丹参连作障碍抗性，并具有植株促生、保证/提高根部药用活性成分含量、修复连作土壤等功效。
附图说明
图1为本发明的作业流程图。
图2为本发明的生物刺激素对连作丹参植株生长（株高、冠幅、地上部分鲜重、地上部分干重）的影响。
图3为本发明的生物刺激素对连作丹参植株叶绿素含量的影响。
图4为本发明的生物刺激素对连作丹参植株生长（主根长、根鲜重、根干重）的影响。
图5为本发明的生物刺激素对连作丹参根系活力和根系MDA含量的影响。
图6为本发明的生物刺激素对连作丹参根部主要药用活性成分含量的影响。
图7为本发明的生物刺激素对连作丹参根际土壤酶活性的影响。
图8为本发明的生物刺激素对连作丹参根际土壤矿质氮的影响。
图9为本发明的生物刺激素对连作丹参根际土壤酚酸类物质含量的影响。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行详细的描述。
如图1所示，本发明基于生物刺激素可对植物的自然进程起到刺激促生作用，微生物有益菌等物质作为生物刺激素重要组成，对其开发利用将有利于提高丹参连作障碍抗性，并可持续影响丹参植株后期的产量，保证/提高根部主要药用活性成分含量。本发明涉及的一种提高丹参连作障碍抗性生物刺激素的制备及应用方法，包括丹参连作障碍（自毒）抗性评价体系构建、有益菌株和化学药剂组分的筛选和利用、生物刺激素的制备、生物刺激素应用实效检测等作业。
本发明涉及一种提高丹参连作障碍抗性生物刺激素的制备及应用方法，其具体实施方式如下。
（1）丹参连作障碍（自毒）抗性评价体系构建：基于发明人及团队成员前期在连作丹参酚酸自毒方面开展了大量研究工作，完成了丹参连作障碍（自毒）抗性评价指标的筛选。其中幼苗生长指标有株高、冠幅、地上部分鲜重、地上部分干重、主根长、根鲜重和根干重，叶片生理指标有叶绿素a含量和叶绿素b含量，根系生理指标有根系活力和根系MDA含量，根部主要药用活性成分含量指标有迷迭香酸、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA，根际土壤酶活性指标有脲酶、多酚氧化酶和蔗糖酶，根际土壤矿质氮指标、土壤酚酸类物质含量指标有对羟基苯甲酸、阿魏酸、苯甲酸、香草酸和香草醛。
（2）有益菌株和化学药剂等组分的筛选和利用：选取从青岛崂山（120.47E，36.10N）收集到的新鲜藿香植株组织中分离获得成团泛菌HX-1，CGMCC No. 17646和甘肃省山丹县明长城附近（100.88E，38.84N）极度干旱土壤中分离获得的芽孢杆菌MGW9，CGMCCNo.18690两种有益菌；选取2,4-表油菜素内酯作为目标生物刺激素的化学药剂组分。
成团泛菌HX-1具有耐盐、产生吲哚乙酸、溶磷等能力。
菌株芽孢杆菌MGW9具有耐盐、固氮、产生吲哚乙酸、溶磷等能力。
2,4-表油菜素内酯能够参与植物的生长发育，调控植物的生理生化代谢过程，还能够缓解植物的逆境胁迫。
（3）生物刺激素的制备：目标生物刺激素主要包括微生物菌剂组分、化学药剂组分和载体组分。
所述微生物菌剂组分由优良目标菌株成团泛菌HX-1和菌株芽孢杆菌MGW9组成；所述化学药剂组分为2,4-表油菜素内酯，购买于Sigma公司；所述载体组分为葡萄糖。
本发明涉及的目标生物刺激素制备主要步骤为：首先根据需求量选择相应规格的发酵罐，使用前对罐体进行高压蒸汽灭菌，121℃，45min，然后进行菌液培养；其次将所述成团泛菌HX-1和芽孢杆菌MGW9分别接种到不同罐内牛肉膏蛋白胨液体培养基中，搅拌转速120r/min-150r/min，培养温度28℃，通气量为1.5L/min，培养48-60h，并调整HX-1菌数为1.5×108-2.0×108cfu/ml，MGW9菌数为3.0×108-4.0×108cfu/mL；再次将成团泛菌HX-1菌液和芽孢杆菌MGW9菌液进行1:1体积混合（活菌数比例为1:2），得到复合菌液；然后在复合菌液中加入葡萄糖0.2-0.3kg/L，加入2,4-表油菜素内酯0.5mg/L，混合均匀；最后调整PH值为7.0-8.0，即得所述目标生物刺激素。
（4）生物刺激素应用实效检测：将目标生物刺激素于丹参缓苗期和盛花期各喷施植株（叶片）及连作障碍土壤表层一次，表层土浅耕混匀，喷水使土壤湿润，即可。
实施例:以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
试验材料：土壤采自莒县库山乡连作3年地块，将土壤过筛，剔除大的石块（经酚酸成分检测存在丹参生长自毒效应）。供试丹参品种为山东红丹参。
试验于2018年5月至2019年10月在莒县库山乡丹参种苗繁育基地、青岛农业大学种子科学与工程实验室和中国医学科学院/北京协和医学院药用植物研究所进行。
试验采用盆栽（聚乙烯盆，φ23cm×21.5cm），每盆装土5kg，每盆1株丹参。
选取长势一致的丹参幼苗60株定植，其中对照（Control，C），30盆；处理（Treatment，T）为在丹参缓苗期和盛花期各施一次目标生物刺激素，30盆，生物刺激素每盆每次用量为350mL。在生育期内根据盆内土壤湿度适当浇水。
样品采集：对3个生育阶段丹参植株相关指标检测时，处理和对照分别随机选取3株丹参进行指标测定，以平均值代表指标值。
各项指标测定方法如下。
于缓苗期、盛花期和采收始期对连作丹参植株进行株高、冠幅、地上部分鲜重、地上部分干重、叶绿素含量、主根长、根鲜重、根干重、根系活力、根系丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量等指标进行测定（待测根系用自来水和去离子水清洗干净并用吸水纸吸干浮水后备用）。
叶绿素含量测定：称取0.1g鲜叶备用；采取丙酮提取法进行。
根部药用活性成分指标测定：于缓苗期、盛花期和采收期将连作丹参根部取出，除去地上部分、清除根系附土、单株编号、测鲜重，60℃下恒温干燥后，测干重。将干燥后的样品采取四分法取样，粉碎，过40目筛后置干燥器中备用。
根部主要药用活性成分含量指标测定：参考赵志刚等方法（赵志刚,郜舒蕊,谢景,等.不同生长时期丹参生物量积累及活性成分的变化规律.中国现代中药,2015,17(11):1171-1176.）进行迷迭香酸、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA等指标含量测定，略有改动，测定方法如下。
仪器设备主要包括高效液相色谱仪(Agilent 1120，美国安捷伦公司)；采用岛津GL Inertsil C18色谱柱（5µm,250mm×4.6mm）；万分之一电子天平（Sartorius，德国赛多利斯）等。
标品购自上海融禾医药科技发展有限公司；甲醇、磷酸（色谱纯，美国Fisher公司）；水为娃哈哈纯净水。
脂溶性成分色谱条件：流动相为甲醇-0.01%磷酸水等度洗脱，流速：0.8mL/min；柱温30℃；检测波长270nm；进样体积10µL。
水溶性成分色谱条件：流动相为乙腈-0.01%磷酸水等度洗脱，流速：0.8mL/min；柱温30℃；检测波长286nm；进样体积10µL。
基于标品浓度及标品出峰面积绘制标准曲线，并完成精密度实验、稳定性实验、重复性实验和加样回收率实验等，计算迷迭香酸、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的含量。
根际土壤样品准备：鲜土取样后剔除根茬等残体后，一部分室内自然风干后过1mm筛4℃密封冷藏供测根际土壤酶活性；另一部分用于测土壤矿质氮和酚酸类物质含量。
根际土壤酶活性指标测定：包括脲酶活性测定、多酚氧化酶活性测定和蔗糖酶活性测定。
土壤脲酶、多酚氧化酶和蔗糖酶的活性测定分别采用靛酚蓝比色法（mg NH3-N•kg-1•24h-1，37℃）、3, 5-二硝基水杨酸比色法（mg glucose g-1•24h-1，37℃）和邻苯三酚比色法（mg gallic acid g-1•2h-1，30℃），具体操作步骤见《土壤酶及其研究法》（关松荫，1986）。
根际土壤矿质氮指标测定：取10cm深度鲜土过2mm筛，准确称取12.00g置于三角瓶中，加入100mL 0.01mol/ L CaCl2溶液浸提，25℃振荡1h后，过滤，滤液保存于-20℃冰柜里，上机前解冻，采用连续流动分析仪（TRAACS2000，Germany）测定土壤矿质氮浓度。
土壤酚酸类物质含量指标测定：包括羟基苯甲酸、阿魏酸、苯甲酸、香草酸和香草醛含量测定。
滤液用Agilent 1100 LC/MSD Trap VL液-质联用仪进行分析。Symmetry®C18色谱柱（2.1mm×10cm×3.5µm），检测波长λ=254nm，柱温设定25℃，进样量为10µL，流动相组分为甲醇-水，1.0mL/min，电喷雾离子化，负离子检测模式，全离子扫描范围（m/z）:15-300；结果按照烘干土重换算。
数据分析：采取Excel 2007、SPSS 17.0和SAS 9.0对数据进行处理和统计分析。
各项指标测定结果分析。
目标生物刺激素对连作丹参植株生长（株高、冠幅、地上部分鲜重、地上部分干重）的影响。
由图2可知，与对照相比，目标生物刺激素处理能够提高缓苗期、盛花期和采收始期3个生育时期连作丹参植株的株高、冠幅、地上部分鲜重、地上部分干重，且差异显著。
图2中C代表对照（Control），T代表处理（Treatment）。同一生育期同指标对照和处理不同小写字母表示差异显著（p＜0.05）。
目标生物刺激素对连作丹参植株叶绿素含量的影响。
由图3可知，随生长发育时间的推移，处理的丹参叶片叶绿素a和叶绿素b含量均呈先升高后降低，叶绿素含量在盛花期达最高值。与对照相比，目标生物刺激素处理能够提高缓苗期、盛花期和采收始期3个生育时期丹参植株的叶绿素a和叶绿素b含量，且差异显著。
图3中C代表对照（Control），T代表处理（Treatment）。同一生育期同指标对照和处理不同小写字母表示差异显著（p＜0.05）。
目标生物刺激素对连作丹参植株生长（主根长、根鲜重、根干重）的影响。
由图4可知，与对照相比，目标生物刺激素处理能够提高缓苗期、盛花期和采收始期3个生育时期丹参植株的主根长、根鲜重、根干重，且差异显著。
图4中C代表对照（Control），T代表处理（Treatment）。同一生育期同指标对照和处理不同小写字母表示差异显著（p＜0.05）。
目标生物刺激素对连作丹参根系活力和MDA含量的影响。
由图5可知，与对照相比，目标生物刺激素处理能够提高缓苗期、盛花期和采收始期3个生育时期丹参植株的根系活力和MDA含量，且差异显著。
图5中C代表对照（Control），T代表处理（Treatment）。同一生育期同指标对照和处理不同小写字母表示差异显著（p＜0.05）。
目标生物刺激素对连作丹参根部主要药用活性成分含量的影响。
由图6可知，与对照相比，目标生物刺激素处理能够提高采收期丹参植株根部迷迭香酸、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的含量，且差异显著。
图6中C代表对照（Control），T代表处理（Treatment）。同指标对照和处理不同小写字母表示差异显著（p＜0.05）。
目标生物刺激素对连作丹参根际土壤酶活性的影响。
由图7可知，与对照相比，目标生物刺激素处理能够提高缓苗期、盛花期和采收始期3个生育时期丹参根际土壤酶（脲酶、多酚氧化酶和蔗糖酶）活性，且差异显著。
图7中C代表对照（Control），T代表处理（Treatment）。同一生育期同指标对照和处理不同小写字母表示差异显著（p＜0.05）。
目标生物刺激素对连作丹参根际土壤矿质氮的影响。
由图8可知，与对照相比，目标生物刺激素处理能够提高缓苗期、盛花期和采收始期3个生育时期丹参根际土壤矿质氮的含量，且差异显著。
图8中C代表对照（Control），T代表处理（Treatment）。同一生育期同指标对照和处理不同小写字母表示差异显著（p＜0.05）。
目标生物刺激素对连作丹参根际土壤酚酸类物质含量的影响。
由图9可知，土壤5种酚酸类物质中对羟基苯甲酸的含量最高，香草醛次之，苯甲酸最少。与对照相比，目标生物刺激素处理能够降低丹参根际土壤酚酸类物质（对羟基肉桂酸、阿魏酸、苯甲酸、香草酸和香草醛）含量，且差异显著。
图9中C代表对照（Control），T代表处理（Treatment）。同指标对照和处理不同小写字母表示差异显著（p＜0.05）。
综合分析上述各项指标，结果表明目标生物刺激素处理促进了连作障碍胁迫下丹参植株的生长，并在一定程度上能够修复连作土壤等。
结论与讨论。
目标生物刺激素应用方法为：缓苗期和盛花期各施目标生物刺激素一次，用量为350 mL每5kg土壤。
目标生物刺激素的应用能够促进连作丹参植株的生长（包括株高、冠幅、地上部分鲜重、地上部分干重、主根长、根鲜重和根干重）。
目标生物刺激素的应用能够提高连作丹参叶片叶绿素含量（包括叶绿素a和叶绿素b），增强丹参植株光合作用。
目标生物刺激素的应用能够提高连作丹参根系活力和主要药用活性成分含量（包括迷迭香酸、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA），降低根系MDA含量。
目标生物刺激素的应用提高连作丹参土壤酶活性（包括脲酶、多酚氧化酶和蔗糖酶）和根际土壤矿质氮含量，降低根际土壤酚酸类物质含量（包括对羟基肉桂酸、阿魏酸、苯甲酸、香草酸和香草醛）。
目标生物刺激素具有改善连作丹参植株根际环境、提高丹参连作障碍抗性，并具有植株促生、提高/保证根部主要药用活性成分含量、修复连作土壤等功效。这与目标生物刺激素组分成团泛菌HX-1具有产吲哚乙酸、溶磷等功效和芽孢杆菌MGW9具有固氮、溶磷等功效有关，它们不仅为丹参植株提供了营养，而且使丹参根际土壤中各种酶的活性升高，促进了有机质的降解，释放出了更多的营养元素，提高了土壤自我调节能力，促进了丹参植株的生长，影响了丹参根系分泌物的成分和含量来改变土壤酚酸类物质的含量。此外，组分2,4-表油菜素内酯在调节丹参植株的生长发育、提高植株生长抗逆能力，增加叶片叶绿素含量等方面可能也发挥重要作用。本发明可以广泛的应用于连作丹参生产中。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明实施的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的设计精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (4)

1.一种提高连作丹参种苗活力生物刺激素的制备及应用方法，其特征在于包括（1）丹参连作障碍（自毒）抗性评价体系构建；（2）有益菌株和化学药剂组分的筛选和利用；（3）生物刺激素的制备；（4）生物刺激素应用实效检测。
2.所述作业（1）中，丹参连作障碍（自毒）抗性评价指标主要包括幼苗生长指标、叶片生理指标、根系生理指标、根部主要药用活性成分含量指标、根际土壤酶活性指标、根际土壤矿质氮指标、土壤酚酸类物质含量指标等系统构成；所述作业（2）中，目标有益菌株组分分别为青岛崂山（120.47E，36.10N）收集到的新鲜藿香植株组织中分离获得的成团泛菌（Pantoea agglomerans strain）HX-1，CGMCC No. 17646和甘肃省山丹县明长城附近（100.88E，38.84N）极度干旱土壤中分离获得的芽孢杆菌（Bacillus sp.）MGW9，CGMCCNo.18690，目标化学药剂组分选取2,4-表油菜素内酯；所述作业（3）中，该生物刺激素的制备主要包括微生物菌剂组分（成团泛菌HX-1和芽孢杆菌MGW9）、化学药剂组分（2,4-表油菜素内酯）和载体组分（葡萄糖）；所述作业（4）中，目标生物刺激素于连作丹参缓苗期和盛花期各喷施植株叶片及连作障碍土壤表层土一次，表层土浅耕混匀，喷水使土壤湿润，即可。
3.权利要求1所述的一种提高连作丹参种苗活力生物刺激素的制备及应用方法，本发明评价体系包括的幼苗生长指标有株高、冠幅、地上部分鲜重、地上部分干重、主根长、根鲜重和根干重，叶片生理指标有叶绿素a含量和叶绿素b含量，根系生理指标有根系活力和根系MDA含量，根部主要药用活性成分含量指标有迷迭香酸、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA，根际土壤酶活性指标有脲酶、多酚氧化酶和蔗糖酶，根际土壤矿质氮指标，土壤酚酸类物质含量指标有羟基苯甲酸、阿魏酸、苯甲酸、香草酸和香草醛。
4.权利要求1所述的一种提高连作丹参种苗活力生物刺激素的制备及应用方法，其特征在于：首先根据需求量选择相应规格的发酵罐，使用前对罐体进行高压蒸汽灭菌，121℃，45min，然后进行菌液培养；其次将所述成团泛菌HX-1和芽孢杆菌MGW9分别接种到不同罐内牛肉膏蛋白胨液体培养基中，搅拌转速120 r/min-150r/min，培养温度28℃，通气量为1.5L/min，培养48-60h，并调整HX-1菌数为1.5×108-2.0×108cfu/ml，MGW9菌数为3.0×108-4.0×108cfu/mL；再次将成团泛菌HX-1菌液和芽孢杆菌MGW9菌液进行1:1体积混合（活菌数比例为1:2），得到复合菌液；然后在复合菌液中加入葡萄糖0.2-0.3kg/L，加入2,4-表油菜素内酯0.5mg/L，混合均匀；最后调整PH值为7.0-8.0，即得所述目标生物刺激素。
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