CN102783486A

CN102783486A - 一种植物源杀菌剂在植物病害防治中的应用方法

Info

Publication number: CN102783486A
Application number: CN2011101261236A
Authority: CN
Inventors: 黎起秦; 袁高庆; 林纬; 秦健
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2011-05-17
Filing date: 2011-05-17
Publication date: 2012-11-21

Abstract

本发明涉及一种植物天然化合物在植物病害防治中的应用方法，具体是木蜡树叶片中的3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯在植物细菌性病害和卵菌病害防治中的应用方法。3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯可以人工合成，也可以从多种植物中分离纯化。本发明中，用乙醚提取木蜡树叶片干粉中的抑菌物质，采用硅胶柱层析法分离纯化3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯，生产成本低，生产工艺简单。3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯的抑菌谱广泛，可以采用施用木蜡树植物残渣或3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯药剂的方式防治植物病害。本发明为新农药的创制和仿生农药的研制开发提供了新的资源，并使木蜡树这一植物资源得到了充分开发利用。

Description

一种植物源杀菌剂在植物病害防治中的应用方法

技术领域

本发明涉及一种植物天然化合物在植物病害防治中的应用方法，具体是3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯在植物细菌性病害和卵菌病害防治中的应用方法。属于植物病害的生物防治领域。

背景技术

有机合成化学农药的问世，对控制农作物有害生物，保证农业增产增收发挥着重要的作用。但是，在大面积使用化学农药产生巨大社会效益和经济效益的同时，也带来了残留(Residue)、抗性(Resistance)和病虫害再猖撅(Resurgence)等3“R”问题。为了提高人类的生存环境和食品质量，世界各国都在进行减少化学农药使用量的研究，农药的发展方向从高毒、高残留、长持久性的合成化学农药转向安全、低残留、无公害、高生物活性、高选择性的生物农药。植物源农药顺应了这一发展趋势，成为新农药研究与开发的热点。

据统计，全世界有近50万种植物，目前在化学性质方面进行研究的约仅占10％。已报道具有抑菌活性的植物有208科915属1600多种，其产生的次生代谢物质超过40万种，有效成分主要有生物碱、甾体类、萜类、黄酮类、醌类、苯丙素类、单宁、甙类等。这些成分对研究现代农药具有巨大的启发价值和影响作用。由于植物资源丰富，其代谢产物种类繁多，被认为是化学合成杀菌剂替代品最好的开发资源。

目前，国内外对于植物源杀菌剂的开发应用主要有两个途径：(1)直接利用抑菌植物，即提取抑菌植物活性部位的有效成分，然后按照农药的标准，直接将提取物加工成可利用的制剂来控制病害。这种利用方式的主要优点是能够发挥提取物中各种成分的协同作用，投资少，见效快。(2)间接利用抑菌植物，即研究植物中抑菌活性物质的结构、作用机制及结构与活性间的关系，优化先导化合物结构，修饰模拟合成新型高效的生物合理性农药。由于植物内有效成分含量一般很低，直接加工利用需要大量的植物材料，不仅原材料的供应困难，在工厂化加工中也存在原料运输、储存、废渣处理和生产操作上的体积庞大臃肿等问题。从国际上的发展趋势看，有抑菌活性的植物天然产物作为合成的先导化合物要比直接作为商品更有前途。

近些年，我国植物源农药的商品化进程发展较快，目前全国生产植物源农药的厂家有100多家。从2003年到2010年，中国农业信息网中登记注册的植物源农药种类超过40种，品种超过140种，其中有植物源杀菌剂品种近40种。但是，登记防治对象为植物卵菌病害的只有乙蒜素、苦参碱和小檗碱等3种，登记防治对象为植物细菌性病害的只有乙蒜素1种。针对这类病害，尚需要大力加强抑菌植物及其抑菌活性成分研究开发的力度。

木蜡树[Toxicodendron sylvestre(Sieb.et Zucc.)O.Kuntze]是漆树科(Anacardiaceae)漆树属(Toxicodendron)植物，生于海拔140-800(-2300)米的林中，中国长江以南各省区、朝鲜和日本有分布。木蜡树属于我国民间传统药用植物，其根、叶、树皮、果实等有活血止痛、祛瘀消肿、治疗疥疮等功效，也有将其根捣碎水煎后加水或煤油用于防治水稻害虫的记载，然而国内外对木蜡树化学成分抑制病原菌的研究至今仍是空白，尚未见有关于3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯防治植物细菌性病害和卵菌病害的报道。本发明是在对木蜡树叶片抑菌活性成分分离纯化的基础上，利用其抑菌化合物开发植物源杀菌剂，国内外尚属首例。

发明内容

发明目的针对目前植物细菌性病害和卵菌病害防治中，有效的生物农药种类缺乏、防治效果不够稳定的现状，提供了利用木蜡树叶片中的抑菌物质-3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯对植物病害进行防治的方法，同时充分开发利用木蜡树这一植物资源。

技术方案本发明中，木蜡树叶片的抑菌物质一3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯通过以下方法获得：(1)将木蜡树叶片阴干后烘干粉碎，用甲醇回流提取；(2)甲醇提取物用乙醚萃取，浓缩得到乙醚提取物，植物残渣晒干备用；(3)采用常规硅胶柱层析法，以不同有机溶剂配比的洗脱体系对植物提取物的成分进行反复分离，最后经重结晶法纯化获得抑菌化合物。

本发明中，植物源杀菌剂防治番茄青枯病可以通过2种途径实现：第一种途径：将植物残渣完全挥发完溶剂，与土壤以1∶3的比例混匀后配制成植物残渣土播种番茄。第二种途径：用甲醇、乳化剂和水将3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯配制成5％的水乳剂，在作物移栽后，将水乳剂与水以1∶100或1∶50的体积比混合后灌根。

有益效果本发明所提供的木蜡树叶片开发的植物源杀菌剂与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

(1)以常见植物木蜡树为原料，原料来源广，生产成本低，生产工艺简单，适合规模生产。

(2)3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯对多种植物病原细菌和植物病原卵菌抑菌效果强，本发明为新农药的创制和仿生农药的研制开发提供了新的资源。

(3)提取抑菌活性物质后的木蜡树残渣有减轻病害和肥效的作用，这使木蜡树这一植物资源得到了充分开发利用。

具体实施方式

实施例1：木蜡树叶片抑菌物质的提取

将收集的木蜡树叶片阴干后于50℃下烘24～48h，用40目筛的粉碎机粉碎，以甲醇回流提取3次，每次回流3h。合并提取液用旋转蒸发仪在50℃水浴中减压浓缩，获得木蜡树叶片的甲醇提取物，另将过滤后的植物残渣晒干备用。将甲醇提取物用乙醚萃取后浓缩萃取液，得到乙醚提取物。

实施例2：木蜡树叶片乙醚提取物中3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯的分离纯化

木蜡树叶片乙醚提取物以试剂型硅胶(100-200目)拌样，采用硅胶(100-200目)柱层析，以石油醚(60-90℃)/丙酮(5∶1和1∶1)为洗脱剂梯度洗脱，将石油醚/丙酮(1∶1)的组分合并，以硅胶(100-200目)拌样，采用硅胶(100-200目)柱层析，以氯仿/甲醇(10∶1)为洗脱剂洗脱，将所得组分再以硅胶(100-200目)拌样，采用硅胶(200-300目)柱层析，以氯仿/甲醇(20∶1)为洗脱剂洗脱，最后将所得组分以硅胶(200-300目)拌样，采用硅胶(200-300目)柱层析，以石油醚(60-90℃)/乙酸乙酯(10∶1和2∶1)为洗脱剂梯度洗脱，将石油醚/乙酸乙酯(2∶1)的组分以乙醚为溶剂进行重结晶，获得白色结晶-3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯。

实施例3：3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯对茄青枯拉尔氏菌的毒力

供试细菌菌种茄青枯拉尔氏菌(Ralstonia solanacearum)由广西大学植物病理学研究室提供，属于小种1生化型III，于灭菌水中20℃下保存。供试菌先在NA固体培养基(Nutrientagar，配方：酵母粉3g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、琼脂17g、水1000mL，pH 7.0～7.2)上划线活化培养24～48h，然后转入NA培养液中进行悬浮培养(28℃，120rpm)24h。以平板稀释法测定3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯对茄青枯拉尔氏菌的毒力。用10％二甲基亚砜溶解3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯，将不同浓度的药液加入NA培养基中，制备系列浓度的含药液平板。将细菌悬浮液稀释成10³CFU/mL，取100μL涂于平板上，以含相同浓度的二甲基亚砜平板作对照，置于28℃的培养箱中培养。以培养48h完全没有菌落生长的浓度作为该化合物的最低抑菌浓度(MIC)，以培养96h仍然没有菌落生长的浓度作为该化合物的最低杀菌浓度(MBC)，按照下式计算抑菌率。以农用硫酸链霉素为对照药剂。

抑菌率(％)＝100×(对照平板的菌落数-药液平板的菌落数)/对照平板的菌落数。采用MicrosoftExcel 2003和DPS v8.01数据处理系统进行数据统计分析。药剂浓度取对数(x值)，抑菌率换算成生物统计几率值(y值)，计算抑制中浓度(IC₅₀)。

试验结果见表1。3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯以及农用硫酸链霉素对茄青枯拉尔氏菌的MIC相同，均是20μg/mL；MBC也相同，均为30μg/mL，IC₅₀分别为8.31和9.62μg/mL，两者差异不显著。这表明，3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯和农用硫酸链霉素对茄青枯拉尔氏菌生长的抑制作用基本一致。

表13，4，5-三羟基苯甲酸甲酯对茄青枯拉尔氏菌的毒力

杀菌剂	MIC(μg/mL)	MBC(μg/mL)	IC₅₀(μg/mL)
				3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯	20.00	30.00	8.31a
农用硫酸链霉素	20.00	30.00	9.62a

(注：表格各列中小写字母代表数据在5％水平上的差异显著性)

实施例4：3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯的抑菌谱

采取抑菌圈法测定3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯对细菌的抑菌活性。3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯用10％的二甲基亚砜配制成浓度为5mg/mL的药液。将WA(Water agar，琼脂含量为3％)15mL倒入培养皿中，凝固后，再加入45℃含有10⁷CFU/mL供试细菌的NA培养基25mL，用灭菌的5mm打孔器打孔，孔深不穿过水琼脂层，每孔加入供试植物提取物药液50μL，同时以浓度10％二甲基亚砜作溶剂对照，置于28℃的培养箱中恒温培养48h。每个处理3次重复，十字交叉法测量抑菌圈的直径，取平均值。

试验结果见表2。3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯对8种植物病原细菌和2种常见细菌均表现出抑制作用，其中对茄青枯拉尔氏菌和稻生黄单胞杆菌稻细条斑致病变种的抑制作用最强，与其它细菌的抑菌活性相比，达到了显著差异水平；对丁香假单胞菌黄瓜致病变种、金黄色葡萄球菌、油菜黄单胞杆菌、杧果致病变种、柑橘黄单胞菌柑橘致病变种和辣椒斑点黄单胞杆菌也有较强的抑菌活性；对木薯黄单胞菌、胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜软腐致病变种和大肠杆菌的抑制作用相对较弱。对枯草芽孢杆菌的生长没有抑制作用。

3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯对4种卵菌的活性测定采用菌丝生长速率法。具体操作步骤是：将供试卵菌在OMA(Oatmeal agar：燕麦30g、琼脂17g、水1000mL)平板上活化培养，待菌落长满大半培养皿时备用。用二甲基亚砜配溶解3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯，与OMA培养基混匀，倒入直径为9cm的培养皿，制成厚薄均匀的含药带毒平板培养基，二甲基亚砜的最终浓度为0.1％，3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯的终浓度为0.5mg/mL，以含0.1％二甲基亚砜的培养基作为对照。用直径为5mm的打孔器切取供试菌菌落边缘菌饼，反向接入含药带毒平板中央，置于28℃的恒温培养箱中培养，当对照菌落刚好长满培养皿时，用十字交叉法测量菌落直径(mm)，以下列公式计算3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯对植物病原卵菌的抑菌率。每处理均3次重复。

抑菌率(％)＝100×(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-5)

试验结果见表3。0.5mg/mL的3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯对4种卵菌菌丝的生长均表现出较强的抑制作用，抑菌率均大于70％，其中对瓜果腐霉的抑菌率最高，达到96.47％。

表23，4，5-三羟基苯甲酸甲酯对11种细菌的抑菌活性

表33，4，5-三羟基苯甲酸甲酯对植物病原卵菌的抑菌活性

植物病原卵菌种类	菌落直径(mm)	抑菌率(％)
			瓜果腐霉Pythium aphanidermatum	8.00	96.47a
荔枝霜疫霉Peronophythora litchii	15.4	87.76b
			刺腐霉P.spinosum	16.00	87.06b
烟草疫霉Phytophthora nicotianae	30.00	70.59c

实施例5：木蜡树叶片提取残渣对番茄青枯病的盆栽防治作用

将溶剂浸泡过滤后剩余的植物残渣阴干，完全挥发完溶剂，在花盆中以残渣土(植物残渣与新植土的比例为1∶3)播种番茄，设全土种植作对照，按照常规管理番茄苗。播种45d后，用淋根接种法按5mL/株的量将浓度为10⁷CFU/mL的茄科青枯拉尔氏菌液淋到植株根部。每重复8～11株，每处理4次重复，药液处理植株后，每天观察番茄生长的影响，接种20d后，测量残渣试验中的番茄株高和茎粗。同时调查植株发病情况，以整株萎蔫数占总株数的百分率为发病率，按下式计算防治效果：

防治效果(％)＝100×(对照的发病率-处理的发病率)/对照的发病率

试验结果表明，残渣土种植的番茄，病害发病率为24.12％，对照病害发病率为48.83％，防治效果为50.60％。残渣还可促进植株生长，处理的番茄苗叶色更浓绿，长势更健壮，残渣土种植20d的番茄平均株高28.30cm，茎粗0.396cm，比在全土(对照)种植20d的番茄平均株高增加39.41％，茎增粗12.50％。

实施例6：3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯对番茄青枯病的田间防治效果

分别于2010年5月中旬至8月上旬和8月上旬至11月底，在广西大学农科实习基地番茄青枯病发病严重的重茬田块开展了2次田间防治试验。3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯以10％甲醇溶解，加入5％的Tween 20和5％的农乳500#作为乳化剂，配制成5％3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯水乳剂，使用时分别加水稀释250倍、100倍和50倍，使3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯的浓度分别为0.2、0.5和1.0mg/mL。对照药剂农用硫酸链霉素和噻菌铜分别用水稀释至所需浓度。将温室中生长35d的番茄苗移栽到田间垄上，每小区30株番茄，每处理设3个小区，随机排列。垄间距70～80cm，株间距30～35cm，小区间距100cm。除第二次试验中的处理1外，其他处理和药剂对照均是在番茄苗移栽到大田7d后开始施第1次药，每株番茄以淋根方式淋药液250mL，以后每隔10～11d施药1次，连施3次。

第一次田间试验设3个处理，3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯的浓度分别为0.2、0.5和1mg/mL，以浓度为0.5mg/mL的农用硫酸链霉素为药剂对照，施清水作为空白对照。第二次田间试验设4个处理，处理1在番茄苗移栽时用0.5mg/mL的3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯药液淋根，之后以同样浓度按照其它药剂处理方式淋根，其余3个处理中，3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯的浓度分别为0.2、0.5和1mg/mL，以浓度为0.5mg/mL的农用硫酸链霉素和0.33mg/mL的噻菌铜为药剂对照，施清水作为空白对照。

两次田间试验在番茄移栽18、29、41d各进行1次病情调查，第二次试验中，移栽60d再调查1次，以整株萎蔫株数占总株数的百分率作为发病率，以下式计算防治效果：

防治效果(％)＝100×(对照发病率-处理发病率)/对照发病率

试验结果见表4。2次田间试验证实，3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯可以降低番茄青枯病的发病率，其防治效果随浓度的增加而增加，并且3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯对番茄的生长没有影响。第一次田间试验中，3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯浓度为0.2mg/mL时，防治效果是27.86％，低于农用硫酸链霉素，但两者差异未达显著水平；当浓度同为0.5mg/mL时，3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯的防治效果一直明显高于农用硫酸链霉素，最后一次调查时它们的防治效果分别为50.30％和33.93％；1mg/mL的3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯处理的最终防治效果达到59.50％。第二次田间试验增加了3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯的预防处理和对照药剂噻菌铜处理。移栽时开始淋根处理将明显提高3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯的防治效果，最终达到52.63％，显著高于农用硫酸链霉素的防治效果(20.3％)。番茄植株经1mg/mL的3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯和对照药剂噻菌铜处理后，田间番茄青枯病的病株在第2次施药后不再继续增加，移栽60d的防治效果分别为62.47％和60.4％，两者差异不显著。

表43，4，5-三羟基苯甲酸甲酯对番茄青枯病的田间防治效果

Claims

1.一种植物源杀菌剂，其特征是：该杀菌剂为3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯，分子式为C₈H₈O₅，结构式如下：

2.根据权利要求1所述的植物源杀菌剂，其特征是：3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯通过木蜡树叶片有机溶剂提取物中分离纯化获得，或通过人工合成获得。

3.根据权利要求2所述的植物源杀菌剂，其特征是：提取木蜡树叶片抑菌活性成分的最佳有机溶剂是乙醚。

4.根据权利要求1或2或3所述的植物源杀菌剂在植物病害防治中的应用，其特征是：所述的植物病害是指拉尔氏菌属病原细菌，或黄单胞菌属病原细菌，或假单胞菌属病原细菌，或腐霉属病原卵菌，或疫霉属病原卵菌引起的植物细菌性病害或卵菌病害。

5.根据权利要求4所述的植物源杀菌剂在植物病害防治中的应用，其特征是：将木蜡树植物提取残渣与土壤混匀后栽培植物，实现对植物病害的防治。

6.根据权利要求4所述的植物源杀菌剂在植物病害防治中的应用，其特征是：将3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯水乳剂用水稀释50～100倍灌根，实现对植物病害的防治。