CN101518266A - 一种旋覆花提取物及其组合物的制备方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属一种制备旋覆花植物提取物的方法及用途。将旋覆花(包括Inula japonica和Inula britannica)植物材料(根、茎、叶、花序、全草)粉碎，用包括95％乙醇在内的溶剂提取；浓缩提取液至与旋覆花粉碎物等重，得旋覆花浸膏，它对黄瓜灰霉病菌、番茄早疫病菌、番茄叶霉病菌、黄瓜炭疽病菌、黄瓜白粉病菌、黄瓜霜霉病菌、马铃薯晚疫病菌、番茄晚疫病菌和小麦纹枯病菌均有明显的抑制作用，其中花序提取物的抑菌活性较强。用乙醇提取的旋覆花浸膏和适宜的溶剂及农药助剂可配成植物源杀菌剂大花旋覆花内酯乳油及大花旋覆花内酯微乳剂，对黄瓜霜霉病、黄瓜白粉病、番茄灰霉病及番茄叶霉病具有明显的防效，特别适用于蔬菜等经济作物上真菌病害的防治，是一种无公害的植物源杀菌剂。

Description

一种旋覆花提取物及其组合物的制备方法及其用途

技术领域：

本发明属含有植物材料提取物及其组合物的制备方法及用途。特别涉及用溶剂提取旋覆花(包括Inula japonica和Inula britannica)植物材料得到的乙醇提取物、其制备方法、含有这种乙醇提取物的组合物的制备方法以及乙醇提取物和组合物用于防治植物真菌病害的用途。

背景技术：

旋覆花(包括Inula japonica和Inula britannica)属菊科植物。具有消痰、下气、软坚和行水之功效。文献报道旋覆花地上部分含旋覆花内酯、天人菊内酯、槲皮素、槲皮黄甙、咖啡酸、绿原酸等多种成分(黄泰康，常用中药成分与药理手册，p1608，1994)。关于旋覆花提取物的抗菌活性研究，目前仅停留在抑制培养皿中真菌菌丝生长的水平上，例如，丁海新等发现95％乙醇提取产于陕西的旋覆花(Inula britannica)的浸膏对小麦赤霉病菌、灰霉病菌、白粉病菌、苹果炭疽病菌和番茄早疫病菌等病原真菌的菌丝生长有一定抑制作用(丁海新，西北农林科技大学硕士学位论文，2004；丁海新等，西北农林大学学报(自然科学版)，2005，33(3)：90-94)，分离鉴别出有抗菌活性的组分大花旋覆花内酯。但目前尚未有人利用旋覆花提取物制备植物源杀菌剂并应用于植物真菌病害的防治。

在申请号为200610089641.4及发明名称为“可治疗糖尿病和高脂血症的旋覆花提取物”专利中，涉及旋覆花水提物的制备工艺及在治疗糖尿病和高脂血症的用途，但未涉及旋覆花乙醇提取物的抗菌活性。

美国发明专利(5853727)‘Preparation and use of Inula extracts as a fungicidefor the control of plant diseases’涉及菊科旋覆花属植物Inula viscosa和Inulagraveolens的提取物制备方法及其制剂在防治马铃薯晚疫病、葡萄霜霉病、向日葵锈病、小麦白粉病等方面的用途。

本发明采用包括95％乙醇在内的溶剂提取旋覆花全草获得提取物。该提取物对植物病原真菌具有抑制作用，防治植物真菌病害。有关利用旋覆花提取物制备有效成分为旋覆花内酯的植物源杀菌剂防治植物真菌病害的研究经检索后，未见相同报道，本研究属首次发现该植物提取物对黄瓜灰霉病菌、黄瓜炭疽病菌、黄瓜白粉病菌、黄瓜霜霉病菌、番茄早疫病菌、番茄叶霉病菌、番茄晚疫病菌、马铃薯晚疫病菌和小麦纹枯病菌等具有颉抗作用，主要抗菌活性成分为大花旋覆花内酯。用旋覆花的乙醇提取物制备的0.49％大花旋覆花内酯乳油及0.49％大花旋覆花内酯微乳剂对番茄灰霉病、番茄叶霉病、黄瓜霜霉病、黄瓜白粉病等黄瓜、番茄作物真菌病害具有防治作用。

发明内容：

本发明的目的在于确定一种制备旋覆花提取物及其组合物的方法及其在抑制植物病原真菌和防治植物真菌病害方面的用途。

本发明体现在以下编号的段落中：

1、一种制备旋覆花的乙醇提取物的方法，包括：获得旋覆花植物材料：全草或任何部分，包括细胞、组织、器官(花、果实、种子、根、茎、叶)，优选是地上部。用含乙醇溶剂提取旋覆花植物材料，获得旋覆花的提取物；

2、段落1的方法，其中溶剂提取旋覆花植物材料包括：(1)在适当条件下用溶剂浸泡旋覆花植物材料；(2)分离液相和固相；(3)任选地，重复步骤(1)和(2)一次或多次(例如重复1～5次)；(4)任选地，合并液相；和(5)任选地，将由步骤(2)或者步骤(4)得到的液相浓缩。

3、段落2的方法，其中步骤(1)中所述适当条件包括：温度为0～100℃，例如0～80℃，优选0～60℃，例如4～50℃，如15～40℃，20～30℃，方便的是室温，也可以是60～100℃；压力为0.1～5个大气压，例如0.5～3个大气压，例如1个大气压，方便的是常压；浸泡时间是1小时，长至例如10天、6小时～5天、12～96小时，例如24、48、72小时，或者其中的任何时间，优选不短于24小时；旋覆花植物材料与含乙醇溶剂的重量体积比为1:1～1:100(千克/升)，例如1:1～1:50、1:2～1:40，优选1:5～1:20，更优选1:5～1:15(千克/升)；优选在浸泡时搅拌。

4、段落2—3任一项的方法，其中步骤(2)中分离通过过滤、离心、自然沉降等来实现。

5、段落2—4任一项的方法，其中步骤(5)的浓缩是减压浓缩，温度可以在0～80℃，优选不超过60℃，例如室温到60℃，例如30～60℃，如55℃；步骤(5)的浓缩可以是冷冻干燥。

6、段落1—5任一项的方法，其中所述旋覆花是Inula japonica和Inula britannica。

7、段落1—6任一项的方法，其中所述旋覆花植物材料是旋覆花植物的地上部分，例如花序。

8、段落1-7任一项的方法，其中所述溶剂是乙醇或者含有乙醇的溶剂；其中溶剂可以是水、甲醇、丙醇、丙酮、正丁醇或它们的组合。

9、段落1～4任一项的方法，其中在用含乙醇溶剂提取旋覆花植物材料之前可用水或其他有机溶剂提取。有机溶剂包括但不限于：石油醚、氯仿、乙酸乙酯、乙醚、甲醇、丙醇、异丙醇、丙酮或正丁醇或它们的任何组合等。

10、用95％乙醇提取旋覆花植物材料获得的旋覆花提取物。

11、段落10的乙醇提取物是通过段落1—9任何一项方法获得的。

12、可通过段落1～9任何一项方法获得的旋覆花的乙醇提取物。

13、一种组合物，其含有段落1～12任何一项的旋覆花乙醇提取物。

14、段落13的组合物，它还含有农药助剂及溶剂。

15、段落13或者14的组合物，它是含主要抗菌活性成分大花旋覆花内酯的植物源杀菌剂。

16、段落10～12任何一项的旋覆花乙醇提取物在制备用于抑制植物病原真菌(黄瓜灰霉病菌、番茄早疫病菌、番茄叶霉病菌、黄瓜炭疽病菌、黄瓜白粉病菌、黄瓜霜霉病菌、马铃薯晚疫病菌、番茄晚疫病菌、小麦纹枯病菌)及防治植物真菌病害(番茄灰霉病、番茄叶霉病、黄瓜霜霉病、黄瓜白粉病)的植物源杀菌剂中的用途。

本发明杀菌乳油的各组分重量百分比为：

旋覆花提取物        10％～40％(相当于大花旋覆花内酯0.245％～0.98％)

溶剂                20％～50％

农药助剂            10％～20％

本发明杀菌微乳剂的各组分重量百分比为：

旋覆花提取物        10％～40％(相当于大花旋覆花内酯0.245％～0.98％)

溶剂                20％～50％

水                  40％～50％

农药助剂            10％～20％

本发明所述的溶剂，可以是甲醇、乙醇、异丙醇、苯、甲苯、二甲苯、乙酸乙酯等中的任一种或几种，以及本领域人员公知的物质。

本发明所述的农药助剂，可以是木质素磺酸钠或钙、烃基萘磺酸盐的甲醛缩合物，二丁基萘磺酸盐、聚羧酸酯钠盐、十二烷基苯磺酸钠、琥珀酸二辛酯磺酸钠、烷基聚氧乙烯醚磺酸盐中的任一种或几种混合物，以及本领域人员公知的物质。

旋覆花源杀菌剂—大花旋覆花内酯微乳剂中的水指的是去离子水或蒸馏水。

本发明的药物组合物制造方法：

旋覆花根、茎、叶、花、全草等部位干粉用95％的乙醇振荡提取2次(50℃、150r/m)，每次3小时，2次提取干粉质量(g)与溶剂体积(mL)比分别为1:10和1:8。合并2次提取液，旋转蒸发仪上(60℃、0.1个大气压)浓缩至不再有溶剂滴出，得到浸膏。

按本发明提供的配方可将该提取物和溶剂、农药助剂可配制成旋覆花源杀菌乳油—大花旋覆花内酯乳油，其制法为：在反应釜中，按杀菌乳油配比量依次加入各成分，搅拌均匀即可得旋覆花源杀菌乳油—大花旋覆花内酯乳油。

按本发明提供的配方可将该提取物和溶剂、农药助剂及水配制成旋覆花源杀菌微乳剂—大花旋覆花内酯微乳剂，其制法为：先将旋覆花提取物、农药助剂溶解于溶剂中，在40～50℃、高速搅拌条件下将所得溶剂滴加入去离子水中，恒温搅拌1小时，即得旋覆花源杀菌微乳剂—大花旋覆花内酯微乳剂。

17、一种抑制植物病原真菌及防治植物真菌病害的方法，包括在培养基中加入旋覆花植物材料或者其提取物(优选乙醇提取物)或者在植物上喷施含有这种提取物的组合物或者其它由旋覆花植物材料加工后的产品。

本发明的这些方面和其它方面将在下文进一步说明，但是它们不应理解为是对本发明范围的限制。

美国发明专利(5853727)‘Preparation and use of Inula extracts as a fungicidefor the control of plant diseases’介绍了菊科旋覆花属植物Inula viscosa和Inulagraveolens的提取物制备方法及其制剂在防治马铃薯晚疫病、葡萄霜霉病、向日葵锈病、小麦白粉病方面的用途。

本发明的优点：(1)采用的植物材料是菊科旋覆花属中旋覆花(Inula japonica或Inulabritannica，在我国广泛分布，原料易得，易于栽培。旋覆花不同于美国发明专利(5853727)‘Preparation and use of Inula extracts as a fungicide for the control of plantdiseases’中所述的菊科旋覆花属植物Inula viscosa和Inula graveolens。(2)本发明确定一种制备旋覆花提取物的方法，即用95％乙醇提取旋覆花抗菌活性物，95％乙醇为一种环保型的溶剂，原料易得，成本低。上述美国发明专利中所采用的提取溶剂为正己烷与丙酮的混合物，成本较高，有一定的毒性。(3)确定了利用95％乙醇提取的旋覆花抗菌活性物制备无公害的制剂(微乳剂及乳油)的工艺。(4)确定了95％乙醇提取旋覆花获得的浸膏中主要抗菌活性组分为大花旋覆花内酯，含量为2.45％，利用旋覆花浸膏制备的0.49％大花旋覆花内酯乳油(浸膏重量百分比浓度为20％)防治番茄灰霉病、番茄叶霉病、黄瓜霜霉病和黄瓜白粉病的效果，这种新用途不同于上述美国发明专利中所述的利用旋覆花属植物Inula viscosa和Inula graveolens的提取物制剂在防治马铃薯晚疫病、葡萄霜霉病、向日葵锈病、小麦白粉病方面的用途，也不同于申请号为200610089641.4的发明专利“可治疗糖尿病和高脂血症的旋覆花提取物”中利用旋覆花水提物治疗糖尿病和高脂血症的用途。

具体实施方式：

本发明一个目的是获得旋覆花植物(Inula japonica和Inula britannica)乙醇提取物，这些提取物可用于防治植物真菌病害的用途。

因此，本发明涉及一种制备旋覆花的乙醇提取物(或者浸出物)的方法，包括：获得旋覆花植物材料；用含乙醇溶剂提取(或者浸出)旋覆花植物材料，获得旋覆花的乙醇提取物。本发明的方法用于从旋覆花植物材料中提取抑制植物病原真菌及防治植物真菌病害的活性成分。

可通过煎煮法、浸渍法、渗漏法、或者水蒸气蒸馏法等提取(或者浸出)旋覆花植物材料。

在一个具体实施方案中，用含乙醇溶剂提取旋覆花植物材料包括(1)在适当条件下用含乙醇溶剂浸泡旋覆花植物材料；(2)分离液相和固相；(3)任选地，重复步骤(1)和(2)一次或多次(例如重复1～5次)；(4)任选地，合并液相；和(5)任选地，将由步骤(2)或者步骤(4)得到的液相浓缩。

在步骤(1)中所述适当条件可通过试验确定。温度通常为0～100℃，例如0—80℃，优选0—60℃，例如4～50℃，如15～40℃、20～30℃，方便的是室温，也可以是60～100℃；压力通常为0.1～5个大气压，例如0.5～3个大气压，例如1个大气压，方便的是常压；浸泡时间是1小时，长至例如10天、6小时～5天、12～96小时，例如24、48、72小时，或者其中的任何时间，优选不短于24小时；旋覆花植物材料与含乙醇溶剂的重量体积比为1:1～1:100(千克/升)，例如1:1～1:50、1:2～1:40，优选1:5～1:20，更优选1:5～1:15(千克/升)；优选在浸泡时搅拌，例如多次搅拌或者连续搅拌。

步骤(2)中的分离可通过本领域已知的任何方法来实现，包括但不限于，过滤、离心、自然沉降等。

步骤(5)的浓缩可通过本领域已知的任何方法来实现。这种浓缩没有特别地限制，前提是不破坏活性成分。例如，该浓缩可以是减压浓缩。温度可以在0～80℃，优选不超过60℃，例如室温～60℃，例如30～60℃，如55℃；步骤(5)的浓缩可以是冷冻干燥。

一种常见的浓缩方法是蒸发，例如常压蒸发、减压蒸发、薄膜蒸发等。

浓缩之后可进行干燥，例如，常压干燥、减压干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等。干燥不是必需的步骤，但在某些实施方案中是优选的。

在有些实施方案中，浓缩步骤也可以省略。例如，可以直接使用浸出液，例如涂布在培养植物病原真菌的基质表面或喷施在植物表面，或者直接作为原料制备含有旋覆花提取物的组合物。

本发明的乙醇提取物(如浸出液或者浓缩物、干燥之后的浸膏)还可以进一步纯化。这可采用本领域已知许多纯化方法中的任何一种或者几种来进行。在纯化过程中，最好监测活性成分的存在。例如通过测试对抑制植物病原真菌菌丝生长、孢子萌发的活性及防治植物真菌病害的效果来监测活性成分。

在本发明方法中，所述旋覆花植物可以是Inula japonica或者Inula britannica或者它们的组合。

在本发明方法中，所述旋覆花植物材料可以是旋覆花植物全草或者任何部分，例如其器官、组织、或细胞，包括花、果实、种子、茎、叶、根，优选是旋覆花植物的地上部分，例如花序。旋覆花植物材料可以是药材，也可以是生药。旋覆花植物材料可以是组织培养物、细胞培养物。旋覆花植物可以是天然的或者转基因的。旋覆花材料可以是干燥的或者新鲜的。

在本发明的提取方法中，所述旋覆花植物可以是经过预先处理的。这些处理包括物理处理、化学处理、生物处理等。例如，旋覆花植物材料可以预先进行简单洗涤、粉碎。

在本发明中，所述“含乙醇溶剂”是任何含乙醇的溶剂，它可以是乙醇或者含有机溶剂的乙醇溶液，或者含乙醇的水溶液；其中有机溶剂可以是甲醇、丙醇、丙酮或正丁醇或它们的任何组合。含乙醇溶剂中乙醇的含量(体积比)可以是例如至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％甚至更高，优选地至少10％，更优选至少20％、50％或者更多。

在一个具体实施方案中，本发明旋覆花植物提取物的制备方法是将旋覆花植物的地上部分在常温常压下，用乙醇或含水或有机溶剂的乙醇溶液浸提获得旋覆花提取浸膏。生药旋覆花浸泡用乙醇或含水或有机溶剂的乙醇溶液的重量体积比推荐为1：5～15(千克/升)。浸泡时间推荐大于24小时，浸泡温度推荐0～60℃。所用有机溶剂包括但不限于甲醇、丙醇、丙酮及正丁醇。浓缩可以是将萃取液减压浓缩，温度推荐等于或低于60℃进行。

另一方面，本发明涉及旋覆花的乙醇提取物(或者乙醇浸出物)。

本发明的旋覆花的乙醇提取物(或者乙醇浸出物)是指通过用含乙醇溶剂(如乙醇或者含有水或有机溶剂的乙醇)从旋覆花植物材料中提取的旋覆花提取物，该旋覆花提取物含有抑制植物病原真菌或者防治植物真菌病害的活性成分。

本发明的乙醇提取物可通过以上定义的本发明方法获得。

本发明涉及可通过任何一种本发明的方法获得的旋覆花的乙醇提取物。例如，可通过煎煮法、浸渍法、渗漏法、或乙醇蒸汽蒸馏法等提取(或者浸出)旋覆花植物材料，得出浸出液。然后，任选地进行浓缩、干燥、或者纯化、或者它们的任何组合。

所得浸出物或者纯化产物可进一步配制成目的组合物，如药物组合。

本发明的提取物中主要含有萜烯内酯类成分，主要抗菌活性成分为大花旋覆花内酯，根、茎、叶、花序、全草中大花旋覆花内酯含量分别为0.08％、0.11％、0.22％、0.25％、0.19％。

本发明的提取物具有抑制植物病原真菌的活性，其可以用于制备防治植物真菌病害的农药。

本发明涉及含有本发明旋覆花乙醇提取物的组合物。优选地，该组合物还含有溶剂及助剂。

在具体实施方案中，所述组合物是药物组合物。

将本发明旋覆花乙醇提取物配制成目的组合物的方法是本领域已知的。根据不同的需要，本发明所属领域技术人员可以选择适当的助剂、配制方法、剂型、单位剂量等。

本发明组合物可以含有适当的助剂、载体或溶剂。可以采用制药领域公知的技术进行制剂。

本发明药物组合物可以采用多种剂型。

本发明药物组合物可通过叶面喷雾施药。剂量范围可以由本领域技术人员通过常规试验确定。

本发明涉及旋覆花乙醇提取物在制备用于防治植物真菌病害的药物中的用途。

本发明涉及旋覆花植物材料或者其提取物(优选乙醇提取物)用于生产可用于抑制植物病原真菌及防治植物真菌病害的药物组合物的用途。

本发明涉及一种防治植物真菌病害的方法，包括在露地或保护地栽培条件下植物发病前或发病初在叶面喷施旋覆花提取物(优选乙醇提取物)或旋覆花提取物组合物。实施例1

2005年8月从河北省承德市郊区采集盛花期的旋覆花根、茎、叶、花、全草(地上部分)，于室温下阴干，粉碎至40目干粉。称取旋覆花(I.japonica)和旋覆花(I.britannica)根、茎、叶、花序、全草干粉各1份，每份50g，按照干粉与溶剂比1:10(g/ml)分别加入95％的乙醇，振荡提取(50℃、150r/m)3小时。抽滤，滤液减压(60℃、0.1个大气压)浓缩得浸膏。实验共进行3次。结果表明两种旋覆花相同提取部位浸膏收率无显著性差异(表1)，花序中浸膏收率最高，根及茎提取浸膏收率最低。

表1、旋覆花不同采收部位以95％乙醇提取浸膏回收率

实施例2

称取旋覆花(Inula japonica)花序6份，每份1kg，加入95％乙醇10升，振荡提取(50℃、150r/m)1、2、3、4、5、24小时。抽滤，滤液减压(60℃、0.1个大气压)浓缩得95％乙醇提取浸膏52.2、66.1、75.4、77.2、77.9、80.9g，收率分别为5.22％、6.61％、7.54％、7.72％、7.79％、8.09％。称取旋覆花(Inula britannica)花序6份，每份1千克，采用同样方法提取得到95％乙醇提取浸膏收率分别为5.30％、6.60％、7.43％、7.69％、7.81％、8.13％。

表2、旋覆花花序提取不同时间的膏体收率

注：试验重复3次，收率为3次重复的平均值。每列数值后带有不同的字母表明数值之间差异显著(p＝0.05)。下同。

结果表明：两种旋覆花以95％乙醇提取相同时间获得的浸膏收率无显著差异。提取3小时后，浸膏收率增长平缓(表2)。从经济角度考虑将3小时定为最佳提取时间。

实施例3

准备旋覆花(Inula japonica)和旋覆花(Inula britannica)花序干粉各4份，每份50g，分别加入95％的乙醇振荡提取1、2、3、4次(50℃、150r/m)，每次3小时。第1次干粉质量(g)与溶剂体积(ml)比为1:10，第2、3、4次干粉质量(g)与溶剂体积(ml)比为1:8。抽滤，合并滤液，滤液减压(60℃、0.1个大气压)浓缩得浸膏。实验重复3次。结果表明：两种旋覆花以95％乙醇提取相同次数获得的浸膏收率无显著差异，提取2—3次获得的浸膏量较高(表3)。

表3、旋覆花花序以95％乙醇提取不同次数的膏体收率

实施例4

准备旋覆花(I.japonica)和旋覆花(I.britannica)花序干粉各5份，每份50g，按照干粉与溶剂比1:10(g/ml)分别加入95％的乙醇，振荡提取(150r/m)3小时，提取温度分别设定为10℃、20℃、30℃、40℃、50℃。抽滤，滤液减压(60℃、0.1个大气压)浓缩得浸膏。表明两种旋覆花在相同温度下提取的浸膏产量无显著差异。在50℃条件下提取获得的浸膏产量较高(表4)。

表4、旋覆花在不同温度下以95％乙醇提取的膏体收率

综合实施例1—4，确定提取工艺：旋覆花根、茎、叶、花、全草等部位干粉均可采用95％的乙醇振荡提取2次(50℃、150r/m)，每次3小时，2次提取干粉质量(g)与溶剂体积(mL)比分别为1:10和1:8。合并2次提取液，旋转蒸发仪上(60℃、0.1个大气压)浓缩至不再有溶剂滴出，得到浸膏。

实施例5

取按实施例1方法提取的两种旋覆花(Inula japonica，Inula britannica)的乙醇提取浸膏少许，溶于乙醇中，进行薄层层析比较。

层析板：GF254硅胶板

展开剂条件：氯仿:乙醚＝4:6(v/v)

显色条件：荧光显色法，λ＝254nm，365nm.

碘熏法(I₂)

层析结果表明：两种旋覆花植物乙醇提取物组成成分基本相同。另取标准旋覆花药材1kg按实施例1方法制成对照药材溶液，分别点在同一硅胶G254薄层板上展开。与对照药材相比，呈相同斑点。

表5、两种旋覆花花序的95％乙醇提取物TLC检测的Rf值

实施例6

表6、对两种旋覆花的95％乙醇提取物定性检验

结果表明：两种旋覆花醇提物均含有生物碱、黄酮甙、多酚和鞣质等化合物。

实施例7

菌丝生长速率法测定旋覆花(I.japonica)和旋覆花(I.britannica)花序的95％乙醇粗提物对黄瓜灰霉病菌菌丝生长的抑制作用。将两种旋覆花粗提物以95％乙醇溶解，稀释成100mg/mL的药液。将PDA培养基倒入直径9cm的培养皿中，待其凝固后在表面加入0.27mLl药液，涂匀，风干。每个平板中心接种一个菌饼，22℃培养5天，测量菌落生长直径，并计算抑制率。

抑制生长百分率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100％

从表7可知，旋覆花(I.japonica)和旋覆花(I.britannica)花序的95％乙醇粗提物对黄瓜灰霉病菌菌丝生长有明显的抑制作用，且差异不明显。提取不同时间获得旋覆花提取物的抑制作用之间无显著差异。

实施例8

以菌丝生长速率法测定旋覆花(I.japonica)花序、根、茎、叶、全草的95％乙醇粗提物对黄瓜灰霉病菌菌丝生长的抑制作用。将两种旋覆花粗提物以95％乙醇溶解，稀释成100、50、25、12.5、6.25、3.125mg/mL的药液，乙醇对照涂95％乙醇，设立空白对照。将PDA培养基倒入直径9cm的培养皿中，待其凝固后在表面加入0.27ml药液，涂匀，风干。每个平板中心接种一个菌饼，22℃培养5天，测量菌落生长直径，并计算抑制率。

表8的数据表明旋覆花(I.japonica)根、茎、叶、花、全草分别以95％乙醇提取的浸膏对黄瓜灰霉病菌菌丝生长均有抑制活性，其中花序提取物的抑制活性较高，根、茎、全草、叶提取物活性较低。

表7、两种旋覆花花序的95％乙醇粗提物100mg/mL对黄瓜灰霉病菌菌丝生长的抑制作用

表8、旋覆花(I.japonica)各部位提取物浸膏对黄瓜灰霉病菌菌丝生长抑制作用

实施例9

琼胶平板表面孢子萌发法测定旋覆花(I.japonica)和旋覆花(I.britannica)花序粗提物对黄瓜灰霉病菌分生孢子萌发的抑制作用。黄瓜灰霉病菌在PDA平板上22℃黑暗条件下培养7～10天后产孢。将分生孢子悬浮液调整至10×10倍显微镜下每视野50～100个分生孢子，4℃保存备用。将两种旋覆花粗提物以乙醇溶解，稀释成100mg/mL的药液。将水琼培养基倒入φ6cm的培养皿中，待其凝固后，在其表面加入0.12mL的药液，涂匀，晾干。每皿加入分生孢子悬浮液0.15mL后手持培养皿迅速转动使分生孢子悬浮液分散开，20℃黑暗培养8～9小时后10×10倍显微镜下镜检，每皿6个视野。芽管长度大于分生孢子直径视为萌发，计算两种旋覆花花序乙醇粗提浸膏对分生孢子萌发的抑制率。从表9可知，旋覆花(Inula japonica)和旋覆花(Inula britannica)花序的95％乙醇粗提物对黄瓜灰霉病菌分生孢子萌发有明显的抑制作用，且差异不明显。提取不同时间获得旋覆花提取物的抑制作用之间无显著差异。

表9、两种旋覆花花序粗提物对黄瓜灰霉病菌分生孢子萌发的抑制作用

实施例10

以琼胶平板表面孢子萌发法测定旋覆花(Inula japonica)花序、根、茎、叶、全草的95％乙醇粗提物对黄瓜灰霉病菌分生孢子萌发的抑制作用。黄瓜灰霉病菌在PDA平板上22℃黑暗条件下培养7～10天后产孢。将分生孢子悬浮液调整至10×10倍显微镜下每视野50～100个分生孢子，4℃保存备用。将两种旋覆花粗提物以乙醇溶解，稀释成100、50、25、12.5、6.25、3.125mg/mL的药液。将水琼培养基倒入直径6cm的培养皿中，待其凝固后，在其表面加入0.12mL的药液，涂匀，晾干。每皿加入分生孢子悬浮液0.15mL后手持培养皿迅速转动使分生孢子悬浮液分散开，20℃黑暗培养8～9小时后10×10倍显微镜下镜检，每皿6个视野。芽管长度大于分生孢子直径视为萌发，计算两种旋覆花花序乙醇粗提浸膏对分生孢子萌发的抑制率。从表10可知，旋覆花(Inula japonica)根、茎、叶、花、全草分别以95％乙醇提取的浸膏对黄瓜灰霉病菌分生孢子萌发均有抑制作用，其中花序提取物抑制活性较高，茎提取物活性最低。旋覆花提取物对分生孢子萌发的抑制作用比对菌丝生长的抑制作用强。

表10、旋覆花(Inula japonica)各部位95％乙醇提取物抑制黄瓜灰霉病菌分生孢子萌发

实施例11

盆栽幼苗法测定旋覆花(Inula japonica)各部位的95％乙醇提取物对黄瓜灰霉病菌的抑制作用。将直径6cm的营养钵装入一定量的蛭石，每盆播入一粒经过催芽的“长春密刺”黄瓜种子，温室内培养约6～8d至两片子叶完全展开，选出长势较好的黄瓜小苗，借助喉头喷雾器，将对照及不同浓度的药剂按清水、95％乙醇、旋覆花根、茎、叶、花序、全草提取物不同浓度的95％乙醇稀释液(100、50、25、12.5、6.25、3.125mg/mL)的顺序分别喷至黄瓜叶片上，每浓度5株黄瓜苗(10片子叶)，每株喷0.6mL，自然晾干后，用打孔器在培养黄瓜灰霉菌的PDA平板上菌落外围打0.5cm菌饼。用接种针把菌饼接于黄瓜子叶上，每片子叶接一个菌饼，菌面朝下，放入湿润的塑料盒中，保鲜膜封口保湿，20～23℃培养3～4天后，观察灰霉病菌在黄瓜子叶上的发病面积，记录病情，并计算病情指数及相对防效(％)。

病级分级标准如下：0级：无病；1级：病斑面积不超过整个叶片的10％；3级：病斑面积达到整个叶片的11％-25％；5级：病斑面积达到整个叶片的26％-50％；7级：病斑面积达到整个叶片的51％-75％；9级：病斑面积占整个叶片面积76％以上。

病情指数＝∑(各级病叶数×对应发病级数)×100/(调查总叶数×最高发病级数)

防治效果＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％

表11、旋覆花(Inula japonica)各部位提取物浸膏对黄瓜幼苗上灰霉病菌抑制作用

从表11可知，旋覆花(Inula japonica)根、茎、叶、花、全草的95％乙醇提取物在活体上均表现出明显的抑菌活性。旋覆花根、茎、叶、花、全草分别以95％乙醇提取的浸膏中，花序提取物在黄瓜子叶上对灰霉病菌抑制活性较高，茎提取物活性最低。

实施例12

旋覆花(Inula japonica)花序的95％乙醇提取浸膏的萃取组分对黄瓜灰霉病菌的抑制作用。95％乙醇粗提物浸膏按1:10加入蒸馏水(w/v)，配成悬浮液，用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水饱和正丁醇顺次萃取，得到石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相，减压浓缩至浸膏状，4℃保存备用。将浸膏用95％乙醇溶解稀释成系列浓度。以菌落生长速率法测定各萃取组分对黄瓜灰霉病菌的菌丝生长的抑制作用。

结果表明：旋覆花花序的95％乙醇提取物分别以正丁醇、乙酸乙酯、氯仿和石油醚萃取的组分明显地抑制黄瓜灰霉病菌菌丝生长。其中氯仿相和石油醚相的组分抑菌活性较高。其次是正丁醇相和乙酸乙酯相的组分。水相的组分抑菌活性最差。

表12、旋覆花(I.japonica)花序各萃取组分对黄瓜灰霉病菌菌丝生长的抑制作用

实施例13

以菌落生长法测定旋覆花(Inula japonica)根、茎、叶、花、全草的95％乙醇提取物对黄瓜炭疽病菌的抑制作用。从表13可知，旋覆花各部位提取物均对黄瓜炭疽病菌菌丝生长具有抑制作用，其中花序的95％乙醇提取物的抑制作用最强，其次是叶的95％乙醇提取物。

表13、旋覆花(I.japonica)各部位的95％乙醇提取物抑制黄瓜炭疽病菌菌丝生长

实施例14

盆栽幼苗法测定旋覆花(Inula japonica)的95％乙醇提取物对黄瓜白粉病菌的抑制作用。将直径6cm的营养钵装入一定量的蛭石，每盆播入一粒催芽的“长春密刺”黄瓜种子，温室内培养6～8天至两片子叶完全展开。从温室里选出长势较好的黄瓜小苗，用POTTER喷雾塔，将对照及不同浓度的药剂按清水、95％乙醇、旋覆花根、茎、叶、花序、全草提取物不同浓度的95％乙醇稀释液(100、50、25、12.5、6.25、3.125mg/mL)的顺序喷至黄瓜叶片上，每浓度5株黄瓜苗(10片子叶)，每株喷2mL。自然晾干后，用喉头喷雾器喷雾接种3mL分生孢子悬浮液(80～100分生孢子/10×10倍视野)，放入塑料盒中用塑料薄膜密封，24℃保湿培养24小时后揭膜，培养8～10天后调查发病。计算病情指数、相对防效。

表14、旋覆花(Inula japonica)各部位的95％乙醇提取物浸膏对黄瓜白粉病菌抑制作用

结果表明：旋覆花花序、根、茎、叶、全草的95％乙醇提取物对黄瓜植株上的白粉病菌具有很强的抑制作用，比在黄瓜子叶上对灰霉病菌的抑制作用强。其中花序的提取物抑制作用最强。

实施例15

盆栽幼苗法测定旋覆花(I.japonica)花序的95％乙醇提取物各萃取组分对黄瓜白粉病菌的抑制作用。95％乙醇粗提浸膏按1:10(浸膏/蒸馏水，w/v)加入蒸馏水，配成悬浮液，用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水饱和正丁醇顺次萃取，得到石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相，减压浓缩至浸膏状。将石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水饱和正丁醇顺次萃取的组分加入95％乙醇溶解，稀释成不同浓度的药液(100、50、25、12.5、6.25、3.125mg/mL)。其他操作步骤同实施例14。结果表明：旋覆花(Inula japonica)花序的95％乙醇提取物经过石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水饱和正丁醇顺次萃取后，氯仿相和石油醚相中的组分对黄瓜白粉病菌具有很强的抑制作用，超过萃取前的粗提物的抑菌活性，其次是乙酸乙酯相中的组分。水相及正丁醇相中的组分抑菌作用较弱。抑菌物主要存在于极性较弱的溶剂萃取相中。

表15、旋覆花(I.japonica)花序各萃取组分对黄瓜幼苗白粉病菌抑制作用

实施例16

脱叶法测定旋覆花(I.japonica)花序、根、茎、叶、全草的95％乙醇提取物对黄瓜霜霉病菌的抑制作用。在温室盆栽黄瓜植株上摘下顶部向下第三、四片叶。按清水、95％乙醇、旋覆花根、茎、叶、花序、全草提取物不同浓度的95％乙醇稀释液(3.125、6.25、12.5、25、50mg/mL)的顺序用POTTER喷雾塔(压力15kp，沉降30s)分别喷雾至黄瓜叶片背面。每浓度3片叶，每片叶喷药1mL。自然晾干后，用喉头喷雾器接种接种孢子囊悬浮液(1×10⁵孢子囊/10×10倍视野)，喷匀即可。置于直径12cm铺有湿滤纸的培养皿中，叶柄用湿脱脂棉包裹，在每天18～22℃、16小时光照/8小时黑暗条件下培养7天。调查发病情况，计算病情指数、相对防效。

表16、旋覆花(Inula japonica)各部位的95％乙醇提取物对黄瓜霜霉病菌的抑制作用

结果表明：旋覆花(I.japonica)花序、根、茎、叶、全草的95％乙醇提取物对黄瓜植株上的霜霉病菌具有很强的抑制作用，比在黄瓜子叶上对霜霉病菌的抑制作用强。其中花序的提取物抑制作用最强，其次是全草的提取物，再次是叶片的提取物。根和茎的提取物抑菌作用较差。

实施例17

脱叶法测定旋覆花(I.japonica)花序的95％乙醇提取物的不同溶剂萃取组分对黄瓜霜霉病菌的抑制作用。95％乙醇粗提浸膏按1:10(浸膏/蒸馏水，w/v)加入蒸馏水，配成悬浮液，用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水饱和正丁醇顺次萃取，得到石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相，减压浓缩至浸膏状。将各萃取组分加入95％乙醇溶解，稀释成不同浓度的药液(20、10、5、2.5、1.25mg/mL)。在温室盆栽黄瓜植株上摘下顶部向下第三、四片叶。按清水、95％乙醇、旋覆花根、茎、叶、花序、全草提取物不同浓度的95％乙醇稀释液(1.25、2.5、5、10、20mg/mL)的顺序用POTTER喷雾塔(压力15kp，沉降30s)分别喷雾至黄瓜叶片背面。每浓度3片叶，每片叶喷药1mL。自然晾干后，用喉头喷雾器接种黄瓜霜霉病菌孢子囊悬浮液(1×10⁵孢子囊/10×10倍视野)，喷匀即可。置于直径12cm铺有湿滤纸的培养皿中，叶柄用湿脱脂棉包裹，在每天18～22℃、16小时光照/8小时黑暗条件下培养7天。调查发病情况，计算病情指数、相对防效。

表17、旋覆花(Inula japonica)花序各萃取组分对黄瓜霜霉病菌抑制作用

结果表明：旋覆花(I.japonica)花序的95％乙醇提取物经过石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水饱和正丁醇顺次萃取后，氯仿相和石油醚相中的组分对黄瓜霜霉病菌具有很强的抑制作用，超过萃取前的粗提物的抑菌活性，其次是乙酸乙酯相中的组分。水相及正丁醇相中的组分抑菌作用较弱。抑菌物主要存在于极性较弱的溶剂萃取相中。

实施例18

以菌落生长速率法测定旋覆花(I.japonica)根、茎、叶、花、全草的95％乙醇提取物对番茄早疫病菌的抑制作用。

表18、旋覆花(I.japonica)各部位提取物浸膏对番茄早疫病菌菌丝生长抑制作用

从表18可知，旋覆花各部位提取物均对番茄早疫病菌菌丝生长具有抑制作用，其中花序的95％乙醇提取物的抑制作用最强，其次是叶的95％乙醇提取物，再次是全草的95％乙醇提取物。

实施例19

测定旋覆花(I.japonica)花序的95％乙醇提取浸膏的萃取组分对番茄早疫病菌的抑制作用。95％乙醇粗提浸膏按1:10(浸膏/蒸馏水，w/v)加入蒸馏水，配成悬浮液，用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水饱和正丁醇顺次萃取，得到石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相，减压浓缩至浸膏状。将浸膏用95％乙醇溶液稀释成系列浓度的药液。参照实施例2，以菌落生长速率法测定旋覆花花序各萃取组分对番茄早疫病菌的抑制作用。结果表明：旋覆花花序的95％乙醇提取物分别以正丁醇、乙酸乙酯、氯仿和石油醚萃取的组分对番茄早疫病菌菌丝生长有明显的抑制作用。按照抑菌作用从强到弱的顺序排列：氯仿相、石油醚相、乙酸乙酯相、水相、正丁醇相。

表19、旋覆花(I.japonica)花序各萃取组分对番茄早疫病菌菌丝生长的抑制作用

实施例20

以菌落生长速率法测定旋覆花(I.japonica)根、茎、叶、花、全草的95％乙醇提取物对番茄叶霉病菌的抑制作用。从表20可知，旋覆花各部位提取物均对番茄叶霉病菌具有抑制作用，其中花序的95％乙醇提取物的抑制作用最强，其次是叶的95％乙醇提取物。

表20、旋覆花(I.japonica)各部位提取物浸膏对番茄叶霉病菌菌丝生长抑制作用

实施例21

测定旋覆花(I.japonica)花序粗提物各萃取组分对番茄晚疫病菌游动孢子释放的抑制作用。分别取旋覆花花序粗提物各萃取组分浸膏，以极少量95％乙醇溶解后加入蒸馏水配成50mg/ml的溶液，分别用蒸馏水稀释得系列浓度(50、25、12.5、6.25、3.125mg/ml)的药液。最高浓度处理中乙醇与蒸馏水体积比为1:20，设置95％乙醇对照。用蒸馏水将番茄叶片上新鲜孢子囊冲下，过滤后用蒸馏水将悬浮液调至10×10倍显微镜下每视野30～50个孢子囊。将孢子囊悬浮液与旋覆花花序粗提物各萃取组分的系列浓度溶液按1:1体积比混合，黑暗10℃保存8小时，促使游动孢子释放。镜检孢子囊数、空孢子囊数，计算空孢囊率、孢子囊释放游动孢子的百分率，每浓度3个重复，每浓度6个视野，计算萃取组分不同浓度药液对游动孢子释放的抑制率。结果表明：旋覆花花序的95％乙醇提取物分别以正丁醇、乙酸乙酯、氯仿和石油醚萃取的组分对番茄晚疫病菌孢子囊释放游动孢子有明显的抑制作用。按照抑菌作用从强到弱的顺序排列：乙酸乙酯相、氯仿相、石油醚相、正丁醇相、水相。抑菌物主要存在于极性较弱的溶剂萃取相中。

表21、旋覆花(I.japonica)花序各萃取组分抑制番茄晚疫病菌游动孢子释放

实施例22

测定旋覆花(Inula japonica)花序粗提物萃取组分对番茄晚疫病菌的孢子囊萌发的抑制作用。旋覆花花序粗提物萃取组分浸膏的溶解及稀释均用95％乙醇，浓度设置为50、25、12.5、6.25、3.125mg/ml，将黑麦琼脂培养基熔化倒入直径6cm的培养皿中，待其凝固后，在平板表面加入药液，0.12mL/皿，对照加入等量的95％乙醇溶液，用涂棒涂匀，在无菌条件下使溶剂完全挥发掉。参照实施例25，配制孢子囊悬浮液(10×10倍显微镜下每视野30～50个孢子囊)，向涂药平板中加入孢子囊悬浮液，0.15mL/皿，荡匀，22℃黑暗培养24小时。镜检孢子囊总数、萌发孢子囊数，计算孢子囊萌发率。每浓度4个重复，每重复10个视野。芽管长度大于孢子囊直径视为萌发。计算各萃取组分不同浓度药液对孢子囊直接萌发的抑制率。结果表明：旋覆花花序的95％乙醇提取物分别以正丁醇、乙酸乙酯、氯仿和石油醚萃取的组分对番茄晚疫病菌孢子囊萌发有明显的抑制作用。按照抑菌作用从强到弱的顺序排列：乙酸乙酯相、氯仿相、石油醚相、正丁醇相、水相。抑菌物主要存在于极性较弱的溶剂萃取相中。

表22、旋覆花(I.japonica)花部各萃取组分对番茄晚疫病菌孢子囊萌发的抑制作用

实施例23

采用凹玻片法测定旋覆花(I.japonica)花序粗提物萃取组分对番茄晚疫病菌休止孢萌发抑制作用。浸膏的溶解及稀释均用95％乙醇，浓度为50、25、12.5、6.25、3.125mg/ml，将系列浓度药液缓慢地加入到凹玻片的凹槽中，10μL/槽，对照加入等量的95％乙醇溶液。待溶剂完全挥发后，每槽加入孢子囊悬浮液10μL，将凹玻片平放于垫湿滤纸的塑料盒中，在10℃黑暗条件下培养12～13小时，镜检休止孢总数、萌发休止孢数(10×10倍显微镜)，计算休止孢萌发率。每浓度4个重复，每重复10个视野，芽管长于休止孢直径视为萌发。计算萃取组分不同浓度药液对休止孢萌发的抑制率。结果表明：旋覆花花序的95％乙醇提取物分别以正丁醇、乙酸乙酯、氯仿和石油醚萃取的组分对番茄晚疫病菌休止孢萌发有明显的抑制作用。按照抑菌作用从强到弱的顺序排列：乙酸乙酯相、氯仿相、石油醚相、正丁醇相、水相。抑菌物主要存在于极性较弱的溶剂萃取相中。

表23、旋覆花(I.japonica)花部各萃取组分对番茄晚疫病菌休止孢萌发的抑制作用

实施例24

采用菌丝生长速率法测定旋覆花(I.japonica)各部位95％乙醇提取浸膏对马铃薯晚疫病菌菌丝生长抑制作用。将黑麦琼脂培养基(黑麦60g，蔗糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL)熔化后倒入φ9cm的培养皿中，待其凝固后在平板表面分别加入不同浓度的各提取物乙醇稀释液，0.27mL/皿，每个浓度重复3次，乙醇对照加入等量的95％乙醇溶液，设空白对照。药液或95％乙醇用涂棒涂匀，使溶剂挥发掉，在平板中央接种马铃薯晚疫病菌菌饼(φ0.5cm)，以封口膜封口。在18℃黑暗条件下培养至空白对照接近长满平板时，测量菌落直径，计算抑制率。

表24、旋覆花(I.japonica)各部位95％乙醇提取物抑制马铃薯晚疫病菌菌丝生长

结果表明：旋覆花根、茎、叶、花、全草的95％乙醇提取物对马铃薯晚疫病菌菌丝生长有明显的抑制作用，其中花序提取物抑菌活性最高，其次为全草提取物，再次为叶片提取物。

与对其它供试植物病原真菌的抑菌活性类似，旋覆花根或茎的提取物抑菌活性较差。

实施例25

脱叶法测定旋覆花(I.japonica)各部位粗提物对番茄晚疫病的防治效果。选择长势一致、大小均匀的番茄叶片，用POTTER喷雾塔在叶背喷药(喷药量1mL/3片；压力15lb/in²；沉降30s)，对照喷等量的95％乙醇溶液。待溶剂完全挥干后，喷雾接种番茄晚疫病菌孢子囊悬浮液(10×10倍显微镜，30～50孢子囊/视野)，叶背面朝上放入培养皿中，保湿培养3～4天(18℃，光照16小时、黑暗8小时交替)。调查发病情况，计算病情指数、相对防效。

表25、旋覆花(I.japonica)各部位的95％乙醇提取浸膏对番茄晚疫病菌抑制作用

结果表明：旋覆花根、茎、叶、花序及全草的95％乙醇提取浸膏对番茄叶片上的晚疫病菌有明显的抑制作用。按照抑菌作用从强到弱的顺序排列：花序、全草、叶、根、茎。

实施例26

采用脱叶法测定旋覆花各部位粗提物及花序粗提物萃取组分对番茄晚疫病的抑制作用。选择长势一致、大小均匀的番茄叶片，用POTTER喷雾塔在叶背喷药(喷药量：1mL/3片，压力：15lb/in²，沉降时间：30s)，对照喷等量的95％乙醇。待溶剂完全挥干后，喷雾接种番茄晚疫病菌孢子囊悬浮液(10×10倍显微镜，30～50孢子囊/视野)，叶背面朝上放入培养皿中，保湿培养3～4天(18℃，光照16小时、黑暗8小时交替)。调查发病情况，计算病情指数、相对防效。

表26、旋覆花花序各萃取组分对番茄离体叶片上晚疫病菌抑制作用

结果表明：旋覆花花序的95％乙醇提取物分别以正丁醇、乙酸乙酯、氯仿和石油醚萃取的组分对番茄晚疫病菌休止孢萌发有明显的抑制作用。乙酸乙酯相、氯仿相、石油醚相中的组分抑制作用相当，明显比正丁醇相和水相中的组分抑菌作用强。抑菌物主要存在于极性较弱的溶剂萃取相中。

实施例27

采用盆栽植株法测定旋覆花(I.japonica)花序粗提物萃取组分对番茄晚疫病的防治效果。配制浓度为25mg/mL的旋覆花花序各萃取组分药液，用喉头喷雾器喷至生长一致的盆栽植株上，每处理4个重复，每植株喷药量10mL，对照喷等量的95％乙醇。24小时后喷雾接种番茄晚疫病菌孢子囊悬浮液(50～100个孢子囊/视野)，流失为度，放入塑料盒于培养室(18～20℃，光照16小时、黑暗8小时交替)中保湿24小时后拆封，再培养3～4天后调查病情，并计算各萃取组分不同浓度药液的病情指数和防治效果。结果表明：旋覆花花序的95％乙醇提取物分别以正丁醇、乙酸乙酯、氯仿和石油醚萃取的组分(25mg/mL稀释液)对番茄晚疫病有明显的防效。乙酸乙酯相、氯仿相、石油醚相中的防效无显著差异，明显比正丁醇相和水相中的组分防效高(表27)。

表27、旋覆花(I.japonica)花序各萃取组分对番茄晚疫病防治作用

实施例28

菌丝生长速率法测定旋覆花(I.japonica)花序的95％乙醇提取物的各萃取组分对马铃薯晚疫病菌抑菌活性。旋覆花花序的95％乙醇粗提浸膏按1:10(浸膏/蒸馏水，w/v)加入蒸馏水，配成悬浮液，用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水饱和正丁醇顺次萃取，得到石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相，减压浓缩至浸膏状。旋覆花花序提取物以石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水饱和正丁醇顺次萃取的组分，加入95％乙醇溶解，稀释成不同浓度的药液(50、25、12.5、6.25、3.125mg/mL)。将黑麦琼脂培养基(黑麦60g，蔗糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL)熔化后倒入直径9cm的培养皿中，待其凝固后在平板表面分别加入不同浓度的各药液，0.27mL/皿，每浓度重复3次，对照加入等量的95％乙醇溶液，用涂棒涂匀，使溶剂挥发完全，接种直径0.5cm的马铃薯晚疫病菌菌饼于平板中央，封口膜封口。在18℃黑暗条件下培养至空白对照接近长满平板时，测量菌落直径，计算抑制率。

结果表明：旋覆花(I.japonica)花序的95％乙醇提取物分别以正丁醇、乙酸乙酯、氯仿和石油醚萃取的组分对马铃薯晚疫病菌菌丝生长有明显的抑制作用。按照抑菌作用从强到弱的顺序排列：氯仿相、石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相。抑菌物主要存在于极性较弱的溶剂萃取相中。

表28、旋覆花(I.japonica)花序提取浸膏各萃取组分抑制马铃薯晚疫病菌菌丝生长

实施例29

以菌落生长法测定旋覆花(I.japonica)根、茎、叶、花、全草的95％乙醇提取物对小麦纹枯病菌菌丝生长的抑制作用。结果表明旋覆花根、茎、叶、花、全草的95％乙醇提取物对小麦纹枯病菌菌丝生长均有一定的抑制作用，其中花序的95％乙醇提取物的抑制作用最强，其次是叶的95％乙醇提取物，再次是叶片的提取物。

表29、旋覆花(I.japonica)各器官提取物对小麦纹枯病菌菌丝生长的抑制作用

实施例30

旋覆花花序粗提物的氯仿相萃取组分经柱层析分离后干柱切割柱9种组分及分离化合物抗菌活性测定。采用实施例23中的凹玻片法测定萃取物经柱层析分离组分及两种分离化合物对番茄晚疫病菌休止孢萌发的抑制作用，采用实施例24中所述的菌落直径法测定萃取物经柱层析分离组分及两种分离化合物对马铃薯晚疫病菌菌丝生长的抑制作用。从表30可知旋覆花花序粗提物的氯仿相萃取组分经柱层析分离后干柱切割柱9种组分中，组分D、E对番茄晚疫病菌休止孢萌发的抑制作用最强，达到100％，组分D对马铃薯晚疫病菌菌丝生长的抑制作用最强，达到81.73％。

从表31、表32及表33可知，旋覆花乙醇提取物中主要抗菌活性成分为大花旋覆花内酯。

表30旋覆花花序粗提物的氯仿相萃取组分经柱层析分离后干柱切割柱9种组分对番茄晚疫病菌休止孢萌发及马铃薯晚疫病菌菌丝生长的抑制作用

注：番茄晚疫病菌休止孢萌发浓度为1mg/mL。马铃薯晚疫病菌菌丝生长浓度为10mg/mL。萃取浸膏重量为40g。

表31、旋覆花提取物中分离化合物对马铃薯晚疫病菌菌丝生长抑制作用

注：各化合物浓度均为1mg/mL。上述数据为3次重复的平均值，同列中数据后含有相同的字母表明数据之间差异不显著(p＝0.05)。

表32、旋覆花提取物中分离化合物对番茄晚疫病菌抑制作用(脱叶法)

注：各化合物测试浓度均为1mg/mL。上述数据为3次重复的平均值，同列中数据后含有相同的字母表明数据之间差异不显著(p＝0.05)。

表33、旋覆花提取物中分离化合物对番茄晚疫病菌休止孢萌发抑制作用

注：各化合物测试浓度均为0.1mg/mL。上述数据为3次重复的平均值，同列中数据后含有相同的字母表明数据之间差异不显著(p＝0.05)。

实施例31

旋覆花乙醇提取物中成分的分离及及鉴别。旋覆花(Inula japonica)花序干粉采用95％的乙醇振荡提取2次(50℃、150r/m)，每次3小时，提取液减压浓缩至不再有溶剂滴出，获得的浸膏按1:10加入蒸馏水(w/v)，配成悬浮液，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水饱和正丁醇萃取，得到石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相，减压浓缩至浸膏状，4℃保存备用。将五种萃取物(浸膏)用95％乙醇溶解稀释成系列浓度，以菌落生长速率法测定各萃取组分对黄瓜灰霉病菌的菌丝生长的抑制作用。结果表明：旋覆花花序的95％乙醇提取物分别以正丁醇、乙酸乙酯、氯仿和石油醚萃取的组分明显地抑制黄瓜灰霉病菌菌丝生长，尤其是氯仿和石油醚的组分抑菌活性较高，其次是正丁醇相和乙酸乙酯相的组分。水相的组分抑菌活性最差。对氯仿萃取物进行常压切割柱层析分离。

一级柱层析分离：采用常压切割柱层析分离，柱长度为80cm，直径6cm，共用200～300目硅胶840g，上样40g，以氯仿：乙醚＝4:6洗脱。等体积150mL收集馏分，共收集4份，待柱中样品明显分成理想的几段后，停止加溶剂，待溶剂流干后，将柱内硅胶按2cm等体积切割，共分成32段，连同所收集4份馏分共36组。TLC检测，馏分1～6中化学成分Rf值较接近，合并为馏分A；馏分7～10中化学成分Rf值较接近，合并为馏分B；馏分11～12中成分较接近，合并为馏分C；馏分13～26中成分较接近，合并为馏分D；馏分27～29成分较接近，合并为馏分E；馏分30为馏分F；馏分31～32成分较接近合并为馏分G；所收集的4份较接近，合并为馏分H。测定了8个馏分的相对质量及对跟踪菌的生物活性。

对抑菌活性较高的馏分D进行二级常压柱层析分离：湿法装柱，柱长为80cm，直径6cm，共用100～200目硅胶630g，上样15g，以石油醚：乙醚＝1:9洗脱。等体积150mL收集，共得123个馏分，TLC检测，馏分1～36中成分Rf值较接近，合并为Da；馏分37～123中成分Rf值接近，合并为Db；换用溶剂乙醚：乙酸乙酯＝1:19洗脱，等体积150mL收集，共得19个馏分，TLC检测，此19个馏分的成分接近，合并为Dc。

馏分Db室温下放置过夜瓶壁即有无色条状晶体出现，回收部分溶剂后有大量结晶析出，过滤，乙醇重结晶后，得到晶体化合物J1，真空干燥箱干燥后保存。组分Dc浓缩后得到淡黄色固体，过滤后以正丁醇重结晶并以甲醇反复多次洗涤，得到无色颗粒状结晶化合物J2。

经熔点测定仪测定化合物Db的熔点为124℃～126℃，紫外分光光度计最大吸收波长为209nm。由状态及所得参数与相关文献比较，初步估计化合物Db为1-O-乙酰大花旋覆花内酯(以下简称大花旋覆花内酯)。

不加校正因子的主成分自身对照法测大花旋覆花内酯纯度：称取少量化合物Db，以色谱纯甲醇配制成0.002mg/mL和0.2mg/mL的溶液，作为对照品溶液和供试品溶液。

色谱条件：Hypersil-C18色谱柱(250mm×4.6mm i.d.，5μm)；柱温：25℃；流动相：乙腈-水(体积比为33：67)；流速：1mL/min；检测波长：209nm。

精密量取化合物Db溶液20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，调节纵轴单位使主峰峰高约为满量程的1/5；再取供试品溶液和对照品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。结果：略去溶剂峰，杂质峰面积总和小于主峰面积的0.5％，可知化合物Db纯度高于99.5％。

化合物Db结构鉴定；化合物经H1-NMR、C13-NMR及红外分析得此化合物分子式为C17H2405，与文献比较确定为1-O-乙酰大花旋覆花内酯。

对石油醚进行加压柱层析分离。取石油醚萃取物65g，用石油醚-乙酸乙酯(10:1～0:10)进行梯度洗脱，将洗脱液合并成3部分，浓缩。第1部分经过重结晶得到化合物I(451mg)；第2部分经过反复柱层析和制备液相色谱分离，得到化合物II、V、VI。第三部分经制备液相制备得到化合物III、IV。经过熔点测定、核磁共振、质谱、红外光谱、紫外光谱分析及对照文献，分别鉴别出化合物I、II、III、IV、V、VI为蒲公英甾醇乙酸酯、β-香树脂、β-扶桑甾醇、豆甾醇、羽扇豆醇、ψ-蒲公英甾醇。

实施例32

旋覆花乙醇提取物中根、茎、叶、花序、全草中大花旋覆花内酯的含量测定。采用高压液相色谱法-外标法。分别称取旋覆花根、茎、叶、花序、全草的乙醇粗提物浸膏少许，以甲醇配成10mg/mL的溶液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，同样配制浓度为0.2mg/mL的1-氧-乙酰大花旋覆花内酯溶液，备用。在上述色谱条件下，取对照品溶液和粗提物溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图及峰面积数值，计算出粗提物浸膏中大花旋覆花内酯的含量，进而计算出旋覆花测得根、茎、叶、花序、全草干粉中大花旋覆花内酯的含量。

公式为：m[x]＝m[r]×A[x]/A[r]

其中m[x]为粗提物中含量；m[r]为对照品进样量；A[x]和A[r]分别为粗提物中相应峰的峰面积和对照品峰面积。

结果表明：旋覆花花序干粉中大花旋覆花内酯含量为0.25％。旋覆花花序干粉采用95％的乙醇振荡提取2次(50℃、150r/m，每次3小时)的浸膏收率为10.2％，浸膏中大花旋覆花内酯含量为2.45％，配制含20％浸膏的制剂中大花旋覆花内酯含量为0.49％。测得根、茎、叶、花序、全草乙醇提取物中大花旋覆花内酯含量分别为0.08％、0.11％、0.22％、0.25％、0.19％，可见旋覆花各器官中，花序大花旋覆花内酯含量最高。

实施例33

利用旋覆花乙醇提取物制备0.49％大花旋覆花内酯乳油。称取旋覆花花序的乙醇提取浸膏20kg(相当于0.49kg大花旋覆花内酯)，95％乙醇60kg，十二烷基磺酸钙5kg，苯乙基苯基聚氧乙烯基醚15kg，在反应釜中搅拌均匀，即得100kg0.49％大花旋覆花内酯乳油。

实施例34

利用旋覆花乙醇提取物制备0.49％大花旋覆花内酯微乳剂。称取旋覆花花序的乙醇提取浸膏20kg、甲苯20kg、脂肪酸聚氧乙烯醚亚磷酸酯10kg、十二烷基磺酸钙5kg，在50％高速搅拌条件下滴加入45kg去离子水，然后再搅拌1小时，即得100kg0.49％大花旋覆花内酯微乳剂。该剂16～64倍稀释液可有效地防治黄瓜霜霉病、黄瓜白粉病、番茄灰霉病及番茄叶霉病。

实施例35

以随机区组法试验大花旋覆花内酯乳油对黄瓜霜霉病(Pseudoperonospora cubensis)的防效。根据农业部药检所“农药田间药效试验准则”，进行田间防治黄瓜霜霉病效果试验。

供试黄瓜品种为北极1号，温室栽培，2007年3月5日定植。试验田位于保定市郊区后营村。

试验设3.2％土木香内酯乳油300倍；3.2％土木香内酯乳油200倍；3.2％土木香内酯乳油100倍；0.49％大花旋覆花内酯乳油64倍；0.49％大花旋覆花内酯乳油32倍；0.49％大花旋覆花内酯乳油16倍；空白对照等7个处理，每处理3次重复，共21个小区，每小区2架黄瓜，面积11m²。小区随机区组排列。

采用背负式手动喷雾器喷雾施药。初见零星病斑时用第一次药(4月11日)，间隔7天用药一次，共用药4次。喷雾均匀周到，尤其是叶背面。以清水为空白对照。用药液量为900L/hm2。每小区随机取4点调查，每点调查2株，每株调查全部叶片，按叶片上病斑占整个叶面积的百分率分级。0级：无病斑；1级：病斑占整个叶面积的5％以下；3级：病斑占整个叶面积的6％～10％；5级：病斑占整个叶面积的11％～25％；7级：病斑占整个叶面积的26％～50％；9级：病斑占整个叶面积的50％以上。

施药前田间零星发病，病情基数视为零(4月11日)；第2次用药后7天及第4次用药后7天调查发病。田间调查各处理病叶数并记录病情，根据以上分级方法计算病情指数、相对防效，数据采用邓肯氏新复极差法(DMRT)进行统计分析。

病情指数＝100×[∑(各级病叶数×相对级数值)]/(调查总数×9)

防治效果(％)＝[(CK病情指数-PT病情指数)/CK病情指数]×100

表32、0.49％大花旋覆花内酯乳油对黄瓜霜霉病的防治效果

实施例36

随机区组法试验大花旋覆花内酯乳油对黄瓜白粉病的防效。根据农业部药检所“农药田间药效试验准则”，进行田间防治黄瓜白粉病效果试验。

供试黄瓜品种为“北极1号”。试验田位于定兴县北庄头村，大棚栽培，8月5日定植，黄瓜白粉病历年发生。

试验设3.2％土木香内酯乳油300倍、3.2％土木香内酯乳油200倍、3.2％土木香内酯乳油100倍、0.49％大花旋覆花内酯乳油64倍、0.49％大花旋覆花内酯乳油32倍、0.49％大花旋覆花内酯乳油16倍、空白对照等7个处理，3次重复，共21个小区，每个小区2架黄瓜，面积11m²。小区随机区组排列。

采用背负式手动喷雾器喷雾施药。初见零星病斑时用第一次药(8月30日)，间隔7天用药一次，共用药4次。喷雾均匀周到，尤其是叶背面。以清水为空白对照。用药液量为900L/hm²。

每小区随机4点调查，每点2株，每株调查全部叶片，按叶片上病斑占整个叶面积的百分率分级。分级标准同实施例30。

施药前田间零星发病，病情基数视为零(8月30日)；第2、4次用药后7天调查发病。田间调查各处理病叶数并记录病情，根据以上分级方法计算病情指数、相对防效，数据采用邓肯氏新复极差法(DMRT)进行统计分析。

表33、0.49％大花旋覆花内酯EC对黄瓜白粉病的防治效果

实施例37

随机区组法试验0.49％大花旋覆花内酯EC对番茄灰霉病的防效。根据农业部药检所“农药田间药效试验准则”，进行田间防治番茄灰霉病效果试验。

供试番茄品种为“佳粉2号”，大棚栽培，4月15日定植。试验田位于保定市郊区西康庄村。试验设3.2％土木香内酯乳油300倍、3.2％土木香内酯乳油200倍、3.2％土木香内酯乳油100倍、0.49％大花旋覆花内酯乳油300倍、0.49％大花旋覆花内酯乳油200倍、0.49％大花旋覆花内酯乳油100倍、空白对照共7个处理，3次重复，共21个小区，每小区2架番茄，面积11m²。小区随机区组排列。

采用背负式手动喷雾器喷雾施药。初见零星病斑时用第一次药(4月20日)，间隔7天用药一次，共用药4次。喷雾均匀周到，尤其是叶背面。以清水为空白对照。用药液量为900L/hm²。每小区随机取4点调查，每点调查2株，每株调查全部番茄果。施药前田间零星发病，摘除所有病果及病叶，病情基数视为零(4月20日)；第2、4次用药后7天调查发病。田间调查各处理病果数、相对防效，数据采用邓肯氏新复极差法(DMRT)进行统计分析。

防治效果(％)＝[(CK病果率-PT病果率)/CK病果率]×100

表34、0.49％大花旋覆花内酯EC对番茄灰霉病的防治效果

实施例38

随机区组法试验0.49％大花旋覆花内酯EC对番茄叶霉病的防效。根据农业部药检所“农药田间药效试验准则”，进行田间防治番茄叶霉病效果试验。

供试品种：长季节硬肉番茄红光。试验田位于河北省定州市辛兴村，日光温室栽培，8月1日定植，番茄叶霉病历年发生。

试验设3.2％土木香内酯乳油300倍、3.2％土木香内酯乳油200倍、3.2％土木香内酯乳油100倍、0.49％大花旋覆花内酯乳油64倍、0.49％大花旋覆花内酯乳油32倍、0.49％大花旋覆花内酯乳油16倍、空白对照等7个处理，3次重复，共21小区，每小区2架番茄，面积11m²。小区随机区组排列。

采用背负式手动喷雾器喷雾施药。初见零星病斑时用第一次药(8月30日)，间隔7天用药一次，共用药4次。喷雾均匀周到，尤其是叶背面。以清水为空白对照。用药液量为900L/hm²。每小区随机4点调查，每点2株，每株调查全部叶片，按叶片上病斑占整个叶面积的百分率分级。分级标准同实施例30。

施药前田间零星发病，病情基数视为零(8月30日)；第2、4次用药后7天调查发病。田间调查各处理病叶数并记录病情，根据以上分级方法计算病情指数、相对防效，数据采用邓肯氏新复极差法(DMRT)进行统计分析。

表35、0.49％大花旋覆花内酯乳油对番茄叶霉病的防治效果

从表32～表35可知，0.49％大花旋覆花内酯乳油16～64倍稀释液对黄瓜霜霉病、黄瓜白粉病、番茄灰霉病、番茄叶霉病均有较好的防治效果，对黄瓜霜霉病的防效尤为突出，等浓度条件下，0.49％大花旋覆花内酯乳油16～64倍稀释液的防效高于3.2％土木香内酯乳油100～300倍稀释液的防效。

附图说明：

图1化合物Db的紫外分光光度计谱图。

图2自身对照法对照品和供试品谱图(上为对照品，下为供试品。

图3粗提物含量测定谱图(上为粗提物，下为对照品。

其它参考文献：

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Claims (14)

1、一种旋覆花提取物的制备方法，包括：获得旋覆花植物材料；用含乙醇溶剂提取旋覆花植物材料，获得旋覆花的提取物，其特征是由下列步骤构成：

(1)采集旋覆花植物材料：根、茎、叶、花、全草，晾干后粉碎成20目粉末；

(2)用溶剂提取旋覆花植物材料，在温度为0～100℃、压力为0.1～5个大气压、浸泡时间为1小时～10天，旋覆花植物材料与溶剂的重量体积比为1:1～1:100，浸泡时搅拌；

(3)分离液相和固相，通过过滤、离心或自然沉降；

(4)重复步骤(2)和(3)1～5次；

(5)合并液相；

(6)浓缩：没有特别的限制，前提是不破坏活性成分；蒸发或减压浓缩，浓缩之后进行干燥，为常压干燥、减压干燥、喷雾干燥和冷冻干燥。

2、按权利要求1所述的方法，其特征是：其中用溶剂提取旋覆花植物材料包括：(1)用溶剂浸泡旋覆花植物材料；(2)分离液相和固相；(3)任选地，重复步骤(1)和(2)1～5次；(4)任选地，合并液相；和(5)任选地，将由步骤(2)或者步骤(4)得到的液相浓缩。

3、按权利要求1-2所述的方法，其特征是：其中所述旋覆花植物材料是旋覆花植物的全草，包括细胞、组织、器官、花、果实、根、茎、叶。

4、按权利要求1所述的方法，其特征是：其中所述溶剂是乙醇或者含有乙醇的溶剂；其中溶剂可以是水、甲醇、丙醇、丙酮、正丁醇或它们的组合。

5、按权利要求1所述的方法，其特征是：其中在用含乙醇溶剂提取旋覆花植物材料之前用水或其他有机溶剂提取，有机溶剂包括：石油醚、氯仿、乙酸乙酯、乙醚、甲醇、丙醇、异丙醇、丙酮或正丁醇或它们的任何组合。

6、按权利要求4所述的方法，其特征是：用95％乙醇提取旋覆花植物材料获得的旋覆花浸膏。

7、一种旋覆花提取物的组合物的制备方法，其特征在于用旋覆花的根茎叶花及全草为原料，用95％乙醇提取，提取物再和溶剂、农药助剂配制成旋覆花源杀菌剂和杀菌微乳剂。

8、按权利要求7所述的方法，其特征在于旋覆花源杀菌剂乳油的各组分重量百分比为：

旋覆花提取物     10％～40％(相当于大花旋覆花内酯0.245％～0.98％)

溶剂             20％～50％

农药助剂         10％～20％

9、如权利要求7所述的方法，其特征在于该杀菌微乳剂的各组分重量百分比为：

旋覆花提取物         10％～40％(相当于大花旋覆花内酯0.245％～0.98％)

溶剂                 20％～50％

水：去离子水或蒸馏水 40％～50％

农药助剂             10％～20％

10、按权利要求8和9所述方法，其特征是：其中所述溶剂是甲醇、乙醇、异丙醇、苯、甲苯、二甲苯、乙酸乙酯等中的任一种或几种。

11、按权利要求8和9所述方法，其特征是：其中所述的农药助剂，是木质素磺酸钠或钙、烃基萘磺酸盐的甲醛缩合物，二丁基萘磺酸盐、聚羧酸酯钠盐、十二烷基苯磺酸钠、琥珀酸二辛酯磺酸钠、烷基聚氧乙烯醚磺酸盐中的任一种或几种。

12、按权利要求8所述方法，其特征是将旋覆花根、茎、叶、花、全草等部位干粉用95％的乙醇振荡提取2次50℃、150r/m，每次3小时，2次提取干粉质量g与溶剂体积mL比分别为1:10和1:8。合并2次提取液，旋转蒸发仪上60℃、0.1个大气压浓缩至不再有溶剂滴出，得到浸膏；在反应釜中，按杀菌乳油配比量依次加入各成分，搅拌均匀即可得旋覆花源杀菌乳油—大花旋覆花内酯乳油。

13、按权利要求9所述方法，其特征是先将旋覆花提取物、农药助剂溶解于溶剂中，在40～50℃、高速搅拌条件下将所得溶剂滴加入去离子水中，恒温搅拌1小时，即得旋覆花源杀菌微乳剂—大花旋覆花内酯微乳剂。

14、一种旋覆花提取物及其组合物的用途，其特征在用于防治黄瓜白粉病、黄瓜霜霉病、黄瓜灰霉病、黄瓜炭疽病、番茄灰霉病、番茄早疫病、番茄晚疫病、番茄叶霉病、马铃薯晚疫病和小麦纹枯病植物真菌病害，其中优选的是，所述组合物是利用旋覆花乙醇提取物制备的大花旋覆花内酯乳油及大花旋覆花内酯微乳剂。

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