CN111052997B - 一种提高草莓连作障碍抗性生物刺激素的制备及应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高草莓连作障碍抗性生物刺激素的制备及应用方法，该生物刺激素由蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）MGW6，CGMCC No.18689、芽孢杆菌(Bacillus sp.)MGW9，CGMCC No.18690、褪黑素和载体葡萄糖组成。本发明提供的生物刺激素可以缓解草莓连作障碍，提高草莓连作障碍抗性，并具有植株促生、连作土壤修复等功效，特别是成本低廉,操作简单,易于产业化实施。

Description

一种提高草莓连作障碍抗性生物刺激素的制备及应用方法
技术领域
本发明涉及一种提高草莓连作障碍抗性生物刺激素的制备及应用方法，可以缓解草莓连作障碍，提高草莓连作障碍抗性，并具有植株促生、连作土壤修复等功效，特别是成本低廉,操作简单,易于产业化实施。
背景技术
草莓(Fragaria ananassa Duch) 属蔷薇科（Rosaceae）草莓属植物，是一种营养价值和经济价值较高的水果，因其色、香、味俱佳，深受消费者喜爱。近年来，我国草莓栽培面积迅速增长，但连作栽培容易产生连作障碍，使植株生长发育异常、土传根病加重、产量与品质下降，严重阻碍了草莓生产的可持续发展。
对草毒连作障碍发生原因的研究主要集中在土传病害加重、土壤理化性质恶变、残体腐解物和根系分泌物化感作用等方面。近年来，化感自毒作用引起了研究者的兴趣。特别是草莓根系分泌物逐年积累并产生自毒作用，已成为草莓连作障碍发生的重要原因之一。
土壤是化感物质最大的聚集地，通过根系分泌、植物残茬分解等途径释放的化感物质直接进入土壤，而地上部淋溶下来的化感物质也进入土壤发挥作用，如：酚酸类物质就是最常见、研究最多的化感物质之一。
连作障碍的调控技术主要有合理轮作与间作、清园与消毒、改土与施肥、施用有机物料、嫁接、施用有益菌、选育抗性品种和施用植物源农药等。
目前对草莓连作障碍的防治以化学防治为主，尽管其中一些化学药品有着较好的防效，但化学药剂毒性大，过多使用影响草莓产品的安全性，同时也会对土壤造成污染。因此做好连作障碍防控工作，研发一套安全有效的防控技术及产品缓解草莓连作障碍，促进连作草莓植株生长，增强植株连作障碍抗性，提高草莓产量和品质一直以来备受人们关注，已成为现代草莓产业健康发展亟待解决的重大课题。
近年来，生物刺激素已成为全球农资市场上一个极其时尚的名词。按照国际组织的定义，生物刺激素是一种包含某些成分和微生物的物质，这些成分和微生物在施用于植物或者根际时，其功效是对植物的自然进程起到刺激作用，包括加强/有益于营养吸收、营养功效、非生物胁迫耐抗能力及作物品质，而与营养成分无关。在欧洲，生物刺激素的使用已涉及果树(柑橘、橄榄、葡萄等)、蔬菜和水果(西兰花、辣椒、黄瓜、草莓、西红柿、甜瓜等)、粮食作物(土豆、小麦、玉米、油菜等)和花卉、苗圃等，并取得了良好的效果。
目前我国利用生物刺激素产品提高草莓连作障碍抗性的报道甚少。针对草莓连作障碍问题，研发目标生物刺激素产品已成为一种高效的策略，能够实现提质增效、绿色生产，这对加快我国新旧动能转换、保障我国草莓产业可持续性发展。
基于有益微生物的分离鉴定，结合其他物质成分，研发生物刺激素新产品，加以科学应用，具有改善草莓植株根际环境、提高草莓连作障碍抗性等功效，具有巨大的市场空间和发展潜力，非常值得我们去研发。
发明内容
本发明的目的在于满足生物刺激素市场的需求和克服现有技术不足，提供一种提高草莓连作障碍抗性生物刺激素的制备及应用方法，该生物刺激素的制备及应用具有改善草莓植株根际环境、提高草莓连作障碍抗性等功效，以满足我国草莓产业可持续发展需要。
为了实现上述目的，本发明基于生物刺激素对植物的自然进程起到刺激作用，特别是具有提高植物生长对非生物胁迫耐抗能力等功效。围绕“提高草莓连作障碍抗性”这一目标，广泛收集目标有益微生物的可能来源样本，并通过分离鉴定等一系列作业，获得目标菌株，结合其他组分（如：化学药剂等），完成目标生物刺激素的研发，并通过应用实效验证。本发明采用以下技术方案来实现一种提高草莓连作障碍抗性生物刺激素的制备及应用方法，主要包括以下作业：（1）草莓连作障碍（自毒）抗性评价体系构建；（2）有益菌株的筛选和利用；（3）生物刺激素的制备；（4）生物刺激素应用实效检测。
所述作业（1）中，基于前期大量试验结果，草莓连作障碍（自毒）抗性评价指标主要包括幼苗生长指标、根系生理指标、叶片生理指标、根际土壤酶活性指标、根际土壤矿质氮指标、土壤酚酸类物质含量指标等。
所述作业（2）中，根据研发目标，菌株分离筛选、纯化、鉴定。本发明菌源为甘肃省山丹县明长城(Ming Great Wall)附近（100.88E，38.84N），极度干旱的土壤（1千克左右）（感谢青岛农业大学赵延明教授帮忙取样）。
获得的两个有益菌株分别为：蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus MGW6和菌株芽孢杆菌Bacillus sp. MGW9。以25％甘油作冷冻保护剂，将MGW6 和MGW9菌株在-80℃超低温冰箱保存，保存地点为：青岛农业大学农学院种子科学与工程实验室，并在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所）也进行了保存。
菌株MGW6在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保存登记入册编号（CGMCC No.）为18689；经保藏中心于2019年10月16日检测结果为存活；建议的分类命名为：Bacillus cereus。
菌株MGW9在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保存登记入册编号（CGMCC No.）为18690；经保藏中心于2019年10月16日检测结果为存活；建议的分类命名为：Bacillus sp.。
褪黑素(melatonin)化学名称为N-乙酰基-5-甲氧基色胺，是一种吲哚类化合物，普遍存在于动物体内。近年来研究发现褪黑素也广泛存在于高等植物体内。研究表明，褪黑素在植物体内具有各种生理功能，可以调节植物光周期及植物的生长发育等。我们前期研究发现褪黑素处理具有一定的缓解草莓连作障碍的效果。
所述作业（3）中，生物刺激素制备：主要包括微生物菌剂组分、化学药剂组分和载体组分。
所述作业（4）中，对目标生物刺激素进行连作障碍土壤草莓生产应用实效验证及使用方法研究。
本发明的有益效果是：基于生物刺激素可对植物的自然进程起到刺激作用，特别是具有提高对非生物胁迫的耐抗能力等功效。为提高草莓连作障碍抗性，保障草莓产量和品质，通过（1）草莓连作障碍（自毒）抗性评价体系构建；（2）有益菌株的筛选和利用；（3）生物刺激素的制备；（4）生物刺激素应用实效检测等作业获得目标生物刺激素及其使用方法。本发明的生物刺激素制备方法，简单易行，成本低廉，易于产业化实施；本发明可以缓解草莓连作障碍，提高草莓连作障碍抗性，并具有植株促生、连作土壤修复等功效。
附图说明
图1为本发明的作业流程图。
图2为本发明的生物刺激素对草莓幼苗生长的影响。
图3为本发明的生物刺激素对草莓根系生理指标的影响。
图4为本发明的生物刺激素对草莓叶绿素含量的影响。
图5为本发明的生物刺激素对草莓根际土壤酶活性的影响。
图6为本发明的生物刺激素对草莓根际土壤矿质氮的影响。
图7为本发明的生物刺激素对草莓根际土壤酚酸类物质含量的影响。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行详细的描述。
如图1所示，本发明基于生物刺激素可对植物的自然进程起到刺激作用，微生物有益菌等物质作为生物刺激素重要组成，对其开发利用将有利于提高草莓连作障碍抗性，并可持续影响草莓植株后期的产量和品质。本发明涉及的一种提高草莓连作障碍抗性生物刺激素的制备及应用方法，包括草莓连作障碍（自毒）抗性评价体系构建、有益菌株的筛选和利用、生物刺激素的制备、生物刺激素应用实效检测等作业。
本发明涉及一种提高草莓连作障碍抗性生物刺激素的制备及应用方法，其具体实施方式如下。
（1）草莓连作障碍（自毒）抗性评价体系构建：基于发明人前期在连作草莓酚酸自毒方面开展了大量研究工作，完成了草莓连作障碍（自毒）抗性评价指标的筛选。评价指标体系主要由幼苗生长指标（株高、根长、地上部鲜重、地下部鲜重等）、根系生理指标（根系活力、SOD酶活性、MDA含量等）、叶片生理指标（叶绿素含量等）、根际土壤酶活性指标（脲酶活性、蔗糖酶活性、多酚氧化酶活性等）、根际土壤矿质氮指标、土壤酚酸类物质含量指标（对羟基苯甲酸、肉桂酸、阿魏酸、对香豆酸、丁香酸等）等构成。
（2）有益菌株的筛选和利用：选取从甘肃省山丹县明长城（Ming Great Wall）附近（100.88E，38.84N）极度干旱土壤中分离获得的蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）MGW6，CGMCC No.18689、芽孢杆菌(Bacillus sp.) MGW9，CGMCC No.18690两种有益菌。
蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus MGW6具有耐盐、固氮、产生吲哚乙酸、溶磷能力等能力。
菌株芽孢杆菌Bacillus sp. MGW9具有耐盐、固氮、产生吲哚乙酸、溶磷等能力。
（3）生物刺激素的制备：目标生物刺激素主要包括微生物菌剂组分、化学药剂组分和载体组分。
所述微生物菌剂组分由优良目标菌株蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus MGW6和菌株芽孢杆菌Bacillus sp. MGW9组成；所述化学药剂组分为褪黑素，购买于sigma公司；所述载体组分为葡萄糖。
本发明涉及的目标生物刺激素制备主要步骤为：
首先，根据需求量选择相应规格的发酵罐，使用前对罐体进行高压蒸汽灭菌，121℃，45min，然后进行菌液培养。
其次将所述蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）MGW6和芽孢杆菌(Bacillus sp.)MGW9分别接种到不同罐内牛肉膏蛋白胨液体培养基中，搅拌转速150r/min，培养温度28℃，通气量为1.5L/min，培养48-60h，并调整MGW6菌数为2.0×108-3.0×108cfu/ml，MGW9菌数为3.0×108—4.0×108cfu/mL。
再次将蜡样芽孢杆菌MGW6菌液和芽孢杆菌MGW9菌液进行1:1体积混合（活菌数比例为1：1.5），得到复合菌液。
然后在复合菌液中加入葡萄糖0.2-0.3kg每升，加入褪黑素150μmol每升，混合均匀。
最后，再次调整PH值为7.0-7.8，即得所述目标生物刺激素。
（4）生物刺激素应用实效检测：将目标生物刺激素于草莓定植期和幼果期各喷施植株叶片及连作障碍土壤表层一次，表层土浅耕混匀，喷水使土壤湿润，即可。
实施例:以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
试验材料：土壤采自青岛城阳区夏庄镇连作5年草莓大棚，将土壤过筛，剔除大的石块（经酚酸成分检测存在草莓生长自毒效应）。供试草莓品种为红颜，幼苗根系健壮、生长均匀良好。试验于2018年8月至2019年3月在青岛城阳区夏庄镇草莓温室大棚内进行。
试验采用盆栽（聚乙烯盆，φ16cm×15cm），每盆装土2kg。
选取长势一致的草莓幼苗60株定植，其中对照（Control，C），30盆；处理（Treatment，T）（基于前期相关研究，本处理为在草莓幼苗定植期和幼果期各施一次目标生物刺激素）30盆，生物刺激素每盆用量为150mL。在生长期内根据盆内土壤湿度适当浇水。
于缓苗期、现蕾期、幼果期和采收始期取草莓植株和根际土样，进行幼苗生长测定、根系指标测定、叶片指标测定、根际土壤酶活性指标测定、根际土壤矿质氮指标测定、土壤酚酸类物质含量指标测定。
各项指标测定方法
幼苗生长测定
于缓苗期、现蕾期、幼果期和采收始期取草莓植株进行株高、根长、地上部鲜重和根鲜重指标测定（其中待测根系用自来水和去离子水清洗干净并用吸水纸吸干浮水后供测）。
根系生理指标测定：取幼嫩根尖（＜2cm）用于根系活力测定、超氧化物歧化酶(SOD)活性测定、丙二醛(MDA)含量测定。
根系活力测定：采用TTC法（Zhang X，Huang G，Bian X，et al．Effects of rootinteraction and nitrogen fertilizationon the chlorophyll content,rootactivity,photosynthetic characteristics of intercropped soybean and microbialquantity in the rhizosphere.Plant Soil Environment,2013,59(2):80-88．）进行。称取0.5 g根尖，依次加入0.4%TTC溶液和(1/15) mol/L磷酸缓冲液各5mL，充分混合，并使根尖切段完全浸入上述反应液中，置于37℃的恒温箱内暗培养2h，以使根尖切段显色（红色）。将已显色的根尖切段装入具塞刻度试管中，加入10mL甲醇，使根尖切段完全浸入甲醇中，然后将试管置于37℃的保温箱中，使根尖切段完全变白为止，用分光光度计在波长485nm下比色，以空白试验作参比测出吸光度，基于标准曲线，即可求出提取液中四氮唑还原量。
超氧化物歧化酶（SOD）活性测定：称取0.5g根尖，分3次加入50 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7.8）于预冷的研钵中共5mL，研磨，合并提取液,4℃,10000g离心15 min,取上清液备用。采用氮蓝四唑（NBT）法(Wang YC,Qu GZ,Li HY,et al.Enhanced salt tolerance oftransgenic poplar plants expressing a manganese superoxide dismutase fromTamarix androssowii.Molecular Biology Reports,2010,37:1119-1124．)进行。以抑制NBT光化学还原50％所需酶量为酶活性单位（U），计算公式：SOD活性(units/gFW)=((ACk－AE)×V)/(0.5×ACk×W×Vt)，式中ACk为照光对照管的吸光度,AE为样品管的吸光度，V为样品液总体积（3mL），Vt为测定时样品用量，W为测定时样品重量（0.5g），蛋白质含量单位为mg/gFW。
丙二醛(MDA)含量测定：称取0.5g根尖，分3次加入l0％三氯乙酸于预冷的研钵中共5 mL，研磨，合并提取液，4℃，4000g离心15 min，取上清液备用。采取硫代巴比妥酸（TBA）法（Wang YC，Jiang J，Zhao X，et al．A novel LEA gene from Tamarix androssowiiconfers drought tolerance in transgenic tobacco.Plant Science,2006,171(6):655-662.）进行。
叶片生理指标测定
叶绿素含量测定：称取0.1g鲜叶备用。采取丙酮提取法（Amon DI.Copper enzymesin chloroplasts.Polyphenol oxidase in Beta vulgaris.Plant physiology,1949,24:1-15．)进行。
根际土壤样品准备：鲜土取样后剔除根茬等残体后，一部分室内自然风干后过1mm筛4℃密封冷藏供测根际土壤酶活性；另一部分用于测土壤矿质氮和酚酸类物质含量。
根际土壤酶活性指标测定:包括脲酶活性测定、蔗糖酶活性测定和多酚氧化酶活性测定。
土壤脲酶、蔗糖酶和多酚氧化酶活性的测定分别采用靛酚蓝比色法（mg NH3-N·kg-1·24h-1，37℃）、3, 5-二硝基水杨酸比色法（mg glucose g-1·24h-1，37℃）和邻苯三酚比色法（mg gallic acid g-1·2h-1，30℃），具体操作步骤见《土壤酶及其研究法》（关松荫，1986）。
根际土壤矿质氮指标测定：鲜土过2 mm筛，准确称取12.00 g于三角瓶中,加入100mL 0.01mol/ L CaCl2 溶液浸提, 25 ℃振荡1 h 后, 过滤, 滤液保存于-20 ℃冰柜里，上机前解冻，采用连续流动分析仪（TRAACS2000，Germany）测定土壤矿质氮浓度。
土壤酚酸类物质含量指标测定：包括羟基苯甲酸、丁香酸、对香豆酸、阿魏酸和肉桂酸含量测定。
滤液用Agilent 1100 LC/MSD Trap VL液一质联用仪进行分析。Symmetry® C18色谱柱（2.1 mm × 10 cm × 3.5 μm），检测波长λ= 254 nm，柱温设定25℃，进样量为10 µL，流动相组分为甲醇-水，1.0 mL/min，电喷雾离子化，负离子检测模式，全离子扫描范围（m/z）:15-300。对羟基苯甲酸、丁香酸、对香豆酸、阿魏酸和肉桂酸出峰时间分别为3.7min、4.1min、6.6min、7.2min和26.5min，结果按照烘干土重换算。
数据分析：采取Excel 2007、SPSS 17.0和SAS 9.0对数据进行处理和统计分析。
各项指标测定结果分析
目标生物刺激素对草莓幼苗生长的影响。
由图2可知，目标生物刺激素在不同程度影响草莓幼苗的株高、根长、地上与地下部鲜重，综合各项指标，处理促进了草莓幼苗植株的生长。
目标生物刺激素对株高的影响在现蕾期、幼果期和采收始期表现明显，且与对照相比差异显著（图2A）；对根长的影响在4个生育期表现均明显，且与对照相比差异显著（图2B）；对地上部鲜重的影响在现蕾期、幼果期和采收始期表现明显，且与对照相比差异显著（图2C）；对地下部鲜重的影响在现蕾期、幼果期和采收始期表现明显，且与对照相比差异显著（图2D）。
图2中C代表对照（Control），T代表处理（Treatment）。同一生育期对照和处理不同字母表示差异显著（p＜0.05）。
目标生物刺激素对草莓根系生理指标的影响。
由图3A可知，随生长发育时间的推移，处理的草莓根系活力先升高后降低，在现蕾期根系活力达最高值。与对照相比，目标生物刺激素处理后提高了草莓根系活力，在现蕾期、幼果期和采收始期差异显著。
由图3B可知，随生长发育时间的推移，处理的草莓根系超氧化物歧化酶（SOD）的活性先升高后降低，酶活性在幼果期达最高值。与对照相比，目标生物刺激素处理后提高了草莓根系超氧化物歧化酶的活性，4个生育时期差异均显著。
由图3C可知，随生长发育时间的推移，处理的草莓根系丙二醛（MDA）含量逐渐升高。与对照相比，目标生物刺激素处理后可以降低草莓根系丙二醛（MDA）的含量，幼果期和采收始期差异显著。
图3中C代表对照（Control），T代表处理（Treatment）。同一生育期对照和处理不同字母表示差异显著（p＜0.05）。
目标生物刺激素对草莓叶绿素含量的影响。
由图4可知，随生长发育时间的推移，处理的草莓叶片叶绿素含量先升高后降低，叶绿素含量在幼果期达最高值。与对照相比，目标生物刺激素处理后提高了各生育期草莓叶片的叶绿素含量，4个生育时期差异均显著。
图4中C代表对照（Control），T代表处理（Treatment）。同一生育期对照和处理不同字母表示差异显著（p＜0.05）。
目标生物刺激素对草莓根际土壤酶活性的影响。
由图5A可知，随生长发育时间的推移，处理的草莓根际土壤脲酶活性逐步降低。与对照相比，目标生物刺激素处理后增加了草莓根际土壤脲酶活性，4个生育时期差异均显著。
由图5B可知，随生长发育时间的推移，处理的草莓根际土壤蔗糖酶活性先升高后降低，在现蕾期酶活性达最高值。与对照相比，目标生物刺激素处理后可以增加草莓根际土壤蔗糖酶活性，4个生育时期差异均显著。
由图5C可知，随生长发育时间的推移，处理的草莓根际土壤多酚氧化酶活性先升高后降低，在现蕾期酶活性达最高值。与对照相比，目标生物刺激素处理后增加了草莓根际土壤多酚氧化酶活性，4个生育时期差异均显著。
图5中C代表对照（Control），T代表处理（Treatment）。同一生育期对照和处理不同字母表示差异显著（p＜0.05）。
目标生物刺激素对草莓根际土壤矿质氮的影响。
由图6可知，随生长发育时间的推移，处理的草莓根际土壤矿质氮含量降低。与对照相比，目标生物刺激素处理后增加了草莓根际土壤矿质氮含量，4个生育时期差异均显著。
图6中C代表对照（Control），T代表处理（Treatment）。同一生育期对照和处理不同字母表示差异显著（p＜0.05）。
目标生物刺激素对草莓根际土壤酚酸类物质含量的影响。
由图7可知，处理的土壤中检测到对羟基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸、对香豆酸和丁香酸，随着草莓生育期的延长，这些酚酸类物质的含量呈现先升高后降低的趋势，对羟基苯甲酸、肉桂酸、阿魏酸和丁香酸含量在现蕾期最高，对香豆酸幼果期含量最高。土壤中对羟基苯甲酸的含量最高，阿魏酸次之，丁香酸最少。目标生物刺激素处理后降低了土壤中对羟基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸、对香豆酸和丁香酸的含量，与对照相比差异显著。
图7中C代表对照（Control），T代表处理（Treatment）。同一生育期对照和处理不同字母表示差异显著（p＜0.05）。
结论与讨论
定植期和幼果期各施目标生物刺激素一次能够促进草莓苗的生长、提高草莓植株根系超氧化物歧化酶活性、降低丙二醛含量、增强其根系活力，草莓植株根系对营养物质的吸收能力增强，进而使草莓连作障碍抗性大大增强。
目标生物刺激素的使用提高了草莓叶片叶绿素含量，增强了草莓的光合作用，促进了草莓营养物质的转化与积累，提高了草莓对连作障碍的抵抗能力。除了目标生物刺激素有益菌组分外，组分褪黑素可能在调节草莓植株的生长发育，叶片叶绿素含量等方面也发挥重要作用。
目标生物刺激素的使用对连作障碍土壤具有一定修复作用，处理提高了根系土壤脲酶、转化酶和多酚氧化酶活性，增加了根系土壤矿质氮含量，减少了根系土壤酚酸类物质积累。可能与目标生物刺激素组分蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）MGW6和芽孢杆菌(Bacillus sp.) MGW9具有固氮、溶磷等功效有关，不仅为草莓植株提供了营养，而且使草莓根际土壤中各种酶的活性升高，促进了有机质的降解，释放出了更多的营养元素，提高了土壤自我调节能力，促进了草莓植株的生长，影响了草莓根系分泌物的成分和含量来改变土壤酚酸类物质的含量。
目标生物刺激素具有改善草莓植株根际环境、提高草莓连作障碍抗性，并具有植株促生、连作土壤修复等功效。本发明可以广泛的应用于连作草莓生产中。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明实施的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的设计精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (2)

1.一种提高草莓连作障碍抗性生物刺激素的制备及应用方法，其特征在于，包括：
步骤1、草莓连作障碍抗性评价体系构建；
步骤2、有益菌株的筛选和利用；
步骤3、生物刺激素的制备；
步骤4、生物刺激素应用实效检测；
所述步骤1中，草莓连作障碍抗性评价体系包括幼苗生长指标：株高、根长、地上部鲜重、地下部鲜重，根系生理指标：根系活力、SOD酶活性、MDA含量；叶片生理指标：叶绿素含量；根际土壤酶活性指标：脲酶活性、蔗糖酶活性、多酚氧化酶活性；根际土壤矿质氮指标、土壤酚酸类物质含量指标：对羟基苯甲酸、肉桂酸、阿魏酸、对香豆酸、丁香酸；
所述步骤2中，选取从甘肃省山丹县明长城附近，经纬度坐标为100.88E，38.84N，极度干旱土壤中分离获得的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus MGW6，CGMCC No.18689、芽孢杆菌Bacillus sp. MGW9，CGMCC No.18690两种目标有益菌；
所述步骤3中，该生物刺激素由蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus MGW6、芽孢杆菌Bacillus sp. MGW9、褪黑素和载体葡萄糖组成；
所述步骤4中，将目标生物刺激素于草莓定植期和幼果期各喷施植株叶片及连作障碍土壤表层土一次，表层土浅耕混匀，喷水使土壤湿润，即可。
2.权利要求1所述的一种提高草莓连作障碍抗性生物刺激素的制备及应用方法，其特征在于，首先根据需求量选择相应规格的发酵罐，使用前对罐体进行高压蒸汽灭菌，121℃，45min，然后进行菌液培养；其次将所述蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus MGW6和芽孢杆菌Bacillus sp. MGW9分别接种到不同罐内牛肉膏蛋白胨液体培养基中，搅拌转速150r/min，培养温度28℃，通气量为1.5L/min，培养48-60h，并调整MGW6菌数为2.0×108—3.0×108cfu/ml，MGW9菌数为3.0×108—4.0×108cfu/mL；再次将蜡样芽孢杆菌MGW6菌液和芽孢杆菌MGW9菌液进行1：1体积混合，活菌数比例为1：1.5，得到复合菌液；然后在复合菌液中加入葡萄糖0.2-0.3kg每升，加入褪黑素150μmol每升，混合均匀；最后，再次调整PH值为7.0-7.8，即得所述目标生物刺激素。
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