CN102585022A - 一种从提取苦豆子总碱后的剩余药渣中提取多糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从提取苦豆子总碱后的剩余药渣中提取多糖的方法，包括以下步骤：(1)粉碎；(2)醇提；(3)水提；(4)醇沉；(5)酶解、脱色及除蛋白；(6)柱层脱色分离。该方法可使苦豆子中多糖充分发挥其机体免疫调节功能及增强化疗药物抗肿瘤作用的功效；经本工艺所得苦豆子多糖纯度可以达到95％以上，且产率高，成本低，反应条件易于控制。

Description

一种从提取苦豆子总碱后的剩余药渣中提取多糖的方法

技术领域

本发明涉及提取方法，具体地讲，涉及从植物中提取多糖的方法。

背景技术

苦豆子(Sophora alopecuroides L.)系豆科槐属植物，是一种多年生草本植物。苦豆子全株味苦性寒，药用根、茎、全草及种子，具有清热解毒、祛风燥湿、止痛杀虫等作用。随着现代药理药效学研究的不断深入，苦豆子的药用价值被医药界所公认。

苦豆子是重要的药用植物资源和饲用植物资源，早在1914年国外就从苦豆子籽实中提出“苦参总碱”。世界性研究苦豆子始于20世纪30年代初，前苏联学者用提出的“苦参总碱”入药后，发现具有清热解毒，抗菌消炎等作用，又分离出槐定碱、槐胺碱。此后，波兰、美国学者相继研究报导了苦豆子植物体内的多种化学成份。1930年被正式列入《美国药典》，在世界上广泛引起重视并用于医药界，随后美国抗癌研究中心发现苦参碱中槐果碱在临床上有抗癌效果。

国内研究始于1971年，为了开发资源，1975年研制的苦豆子生物碱制剂“苦豆子片”治疗腹泻新药，被正式载入1977年版《中国药典》，现改名为“克泻灵片”。1983年开发出“苦参碱制剂妇炎栓”，用于治疗妇科疾病。1984年国内建成了第一条苦豆子生物碱工业生产线，生产苦豆总碱、苦参素、苦参碱、槐定碱等，开始了苦豆子生物碱系列产品的批量生产。

苦豆子的化学成分主要是蛋白质、糖类、有机酸、黄酮类、色素和生物碱。苦豆子生物碱属于喹诺里西啶生物碱，由三价氮原子形成的稠合的二个哌啶环，又称双稠哌啶，仍属于哌啶或吡啶的衍生物。按其结构可分为3个类型：即羽扇豆碱，二环型；金雀花碱，三环型；鹰爪豆碱，四环型。

目前从苦豆子中提取分离及鉴定的生物碱有：苦参碱、槐果碱、槐胺碱、新槐胺碱、槐定碱、苦参碱-N-氧化物、槐果碱-N-氧化物、槐定碱-N-氧化物、3-d-羟荃槐定碱、13，14-脱氢槐定碱、N-羟定槐定碱、N-羟荃-13，14-脱氢槐定碱、苦豆碱、N-甲基苦豆碱、烯丙基苦豆碱、金雀花碱、N-甲村金雀花碱、鹰啶叶碱、三巴豆荃基四胺及具有羽扁豆结构特点的两种新生物碱，共21种生物碱。

苦豆子主要生物碱组成和含量受多种因素影响，如苦豆碱在叶内含量较高而根中没有，槐果碱和槐定碱则分布于各组织中。苦豆子生物总碱在青绿期叶中含量为2.790％，花蕾中为3.760％，茎中为4.765％，全株5.218％；霜后期叶为2.705％，茎中为3.179％，种子中7.446％，主要集中在种子里。就地区而言，宁夏产区生物总碱含量最高5.218％。另外生长在碱性土壤中的苦豆子中不含赖氨酸、甘氨酸、脯氨酸，而色氨酸等含量较高。氨基酸含量直接影响植物体内生物碱的合成，这是生物碱组成和含量因产地不同而存在差异的主要原因。

(2)药理作用：

苦豆子味极苦、性寒有毒，具有清热解毒，抗菌消炎、止痛杀虫等作用。民间用根治疗喉痛、咳嗽、痢疾及湿疹等。目前用于药物开发的主要有8种生物碱：苦参碱，氧化苦参碱，槐果碱，氧化槐果碱一，槐胺碱槐定碱，莱曼碱，苦豆碱。苦豆子生物碱的药理作用：①对中枢神经系统的作用，体现在镇静催眠、镇痛及降温；②对心血管系统的作用，体现在抗心律失常、正性肌力作用，降压和降低心率作用，对心肌缺血和梗塞的保护作用，降血脂作用；③抗病毒、抗炎及免疫调节作用，苦参总碱能抑制多种病毒繁殖.增强免疫调节功能和免疫促进作用；④抗肿瘤作用，对肝癌细胞抑制作用明显，对宫颈癌、淋巴肉瘤、肺癌也有抑制作用；⑤对平滑肌的作用，总碱和一些单体生物碱均能对抗由炎症介质诱导的离体回肠收缩，对支气管平滑肌具有松弛作用，对整体模型也有作用：⑥目前临床应用苦豆子浸膏片、苦豆碱治疗急性菌痢，槐果碱片治疗支气管哮喘，苦参碱治疗妇科炎症、苦参素注射液治疗慢性乙型病毒性肝炎均取得很好的疗效，槐定碱和苦豆子总碱注射液用于治疗肿瘤的研究也已开发成功。

临床研究：用苦参素注射液(为从苦豆子中提取的生物碱溶液，98％为氧化苦参碱)肌注，治疗慢性乙型肝炎65例，HbeAg、HBV-DNA转阴率为40.6％(实用医学杂志，1999，10：844)；用苦豆子散剂，撒布于宫颈糜烂处，以无菌棉球填塞防其脱落，治疗宫颈糜烂75例，痊愈70例，有效3例(中国民间疗法，2000，10：33)；用苦豆子碱注射液肌注，同时用2％苦豆子总碱乳膏外搽患处，治疗银屑病120例，痊愈28例，基本痊愈20例，显效32例，有效24例(中华皮肤科杂志，1999，2：79)。

目前，多数对苦豆子的提取时提取苦豆子中的生物碱成分，《苦豆子胶的研究》(黄启华于海泥沙逸仙植物学报1984.26(2)：195-201)报道了“新疆产的苦豆子，经热水泡涨后手工剥离，获得内胚乳(占种子的12.8％)。经80℃烘干、磨碎、过100目筛，即得苦豆子胶”且该文章3段倒数2行文字记载“苦豆子胶虽然取自不同的产地的种子，但其主要成分均为半乳糖和甘露糖”，进一步将“苦豆子胶水解…计算出苦豆子胶中的总糖含量为56.0％”，即该文献通过粗略的方法获取苦豆子胶，再将苦豆子胶水解得到的糖含量较低。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的上述缺陷，提供的一种从提取苦豆子总碱后的剩余药渣中提取多糖的方法，该方法采用从提取苦豆子总碱后的剩余药渣作为原料，所提取的多糖的成分纯度高，提取方法简单有效，避免浪费，且合理利用了资源。

本发明提供的一种从提取苦豆子总碱后的剩余药渣中提取多糖的方法，包括以下步骤：

(1)粉碎：取苦豆子原药材，粉碎，过10-60目筛；

(2)醇提：取步骤(1)过筛后的苦豆子，将其装入渗漉柱内，用浓度为30％-100％的乙醇浸泡18-24h；再以浓度为30％-100％的乙醇为溶剂，以流速10-15ml/min，渗漉提取，得到苦豆子中所含生物碱成分；至渗漉提取液与碘化铋钾反应无颜色变化时停止渗漉，取苦豆子提取苦豆子生物总碱后的药渣，晾干备用；

(3)水提：向步骤(2)晾干后的固体产物中加入体积为该固体产物6-15倍量的水，于60-110℃，回流1-5h得水提物；

(4)醇沉：将步骤(3)得到的水提物于35-90℃减压浓缩成密度为1.02-1.1的液体，加入乙醇至乙醇终浓度为40％-90％醇沉，4℃冰箱放置10-48h，以2000-5000r/min速率离心，取沉淀，得粗糖提取物，粗糖提取物经水复溶后，再加入乙醇至浓度为70％-90％放置10-48h，以2000-5000r/min速率离心，取沉淀，冷冻干燥得棕褐色粗糖粉末；

(5)酶解、脱色及除蛋白：取上述粗糖粉末按比例添加淀粉酶，于85-95℃保温20-40min；加质量百分数为1％-3％的活性炭于40-70℃回流30-50min脱色、以2000-5000r/min速率离心；取上清液采用Sevage法脱蛋白，重复3-5次，取水层浓缩、醇沉、离心、冷冻干燥，得到灰白色粉末；

(6)柱层脱色分离：将上述灰白色粉末和载体按重量比为1∶10-100的比例上样，采用浓度为0.01％-2％的醋酸铵溶液或氯化钠溶液洗脱液梯度洗脱，将洗脱液浓缩，透析24-48h，醇沉，过夜，以2000-5000r/min速率离心，取沉淀冷冻干燥，得到白色苦豆子多糖粉末。

(7)柱层纯化分离：将上述白色苦豆子多糖粉末和载体按重量比为1∶10-100的比例上样，采用浓度为0.01％-2％的醋酸铵溶液或氯化钠溶液洗脱液梯度洗脱，将洗脱液浓缩，透析24-48h，醇沉，过夜，以2000-5000r/min速率离心，取沉淀冷冻干燥，得到苦豆子多糖。

本发明提供的优选的从苦豆子提取苦豆子总碱后剩余药渣中提取多糖的方法，所述柱层脱色分离的载体为选自纳米氧化铝大孔树脂、纤维素DEAE-52以及NKA、NKA-II、AB-8、S-8、X-5、H103、D301R、D201、001×7型树脂中的一种；柱层纯化分离的载体为选自葡聚糖凝胶G-200、G-150、G-75、交联琼脂糖凝胶和快流速琼脂糖凝胶中的一种。

本发明提供的优选的从苦豆子提取苦豆子总碱后剩余药渣中提取多糖的方法，所述树脂通过以下步骤预处理：

a、将纳米氧化铝大孔树脂先用蒸馏水浸泡过夜，倾去上层水液及其中的轻质小分子，然后在100℃条件下烘烤2h，放干燥器中冷却过夜；使用前将此树脂浸入0.2mol/L的氯化钠或醋酸铵中1-2h，待用；

b、将DEAE-52等树脂用蒸馏水充分淋洗，然后再用浓度为85％-95％的乙醇溶液浸泡24h滤出树脂，并用浓度为85-95％的乙醇溶液反复冲洗树脂至洗出液无色，然后用浓度为5％HCl溶液浸泡2-4h，并用蒸馏水洗至中性；最后用浓度为2％NaOH溶液浸泡2-4h，并用蒸馏水洗至中性。

洗脱液为浓度分别为0.02mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L醋酸铵溶液或浓度分别为0.01mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L氯化钠溶液。

本发明中苦豆子多糖粗品经酶解、脱色可有效除去其中的淀粉及色素，再通过Sevage法去除苦豆子多糖经过醇沉后存在的蛋白质，Sevage法的主要优点是条件温和，不会引起多糖的变性。

其次，本发明采用洗脱液梯度洗脱，使得苦豆子多糖的纯度明显提高，产率增加；纯化的技术除了以上提供的几种树脂材料外，采用由天津神能科技有限公司提供的纳米氧化铝大孔树脂，目前，该种树脂为新研发产品，其应用尚处于试验阶段，该树脂通过将硫酸和偏铝酸钠混合加热后经干燥得到，该树脂比普通的氧化铝树脂孔径较大，吸附能力较强，该公司将此树脂运用于石油化工领域，但没有应用到医药领域，本发明将此树脂用于对苦豆子多糖进行纯化；通过去比表面积大吸附力强的特点、使得苦豆子多糖的纯度明显提高，处理所得上清液最后经减压浓缩、醇沉、离心、冷冻干燥等过程可得苦豆子多糖精品；得到的苦豆子多糖精品通过药剂学方法，可制成医药学上的各种剂型。

一般豆类中的淀粉含量较高，本发明采用在常温下采用浓度为30％-100％的乙醇浸泡，避免了淀粉在温度较高情况下糊化影响有效成分的提取。另外，苦豆子中的生物碱成分含量较高，通常情况下，含量较高的生物碱多采用稀酸或乙醇提取，但鉴于本发明要提取的为苦豆子多糖，采用稀酸可能会影响多糖的结构，且可能引入杂质。采用30％-100％的乙醇浸泡，及流速6-10ml/min条件下，可以最大程度提取生物碱，当流速大于10ml/min时，由于流速过快，苦豆子中的生物碱不能及时释放，当流速小于6ml/min时，由于流速过慢，生物碱已被溶解导致释放时间过长，不能最大程度提取生物碱。

采用浓度40％-100％的乙醇醇沉，使得上清液中有效成分最大限度的得到保留，且存在的生物碱得到有效去除。醇沉后静置10-48h，使绝大部分沉淀析出，若静置时间小于10h，则将导致部分苦豆子淀粉杂质不能有效去除。

由于苦豆子本身属豆科类，淀粉含量较高，获得的浸膏的粘稠性较大，将浸膏浓缩在密度为1.02-1.10范围，避免了发生有效成分絮凝现象，且浓度越大，生产成本越低；另外加入淀粉酶，使得淀粉通过酶的进一步催化水解获取多糖；采用柱层脱色分离进一步精制获取多糖。

本发明从提取过苦参素和苦参碱的苦豆子药渣中进行多糖提取；纯化的技术除了之前提供的几种树脂材料外，加入纳米大孔氧化铝树脂，这种树脂现今在多糖纯化领域未曾应用，其主要特点为吸附力强、比表面积大。

苦豆子多糖具有机体免疫调节功能及增强化疗药物抗肿瘤作用的功效，该提取方法，采用提取苦豆子总碱后的剩余残渣为原料，降低了提取苦豆子多糖的成本。

经本工艺所得苦豆子多糖纯度(苯酚硫酸法)可以达到95％以上，而且产率高，成本低，反应条件易于控制。

与现有技术相比，本发明提供的一种从苦豆子中提取多糖的方法具有以下优点：

1、分离、纯化技术可靠，操作步骤简单；

2、所得的苦豆子多糖纯度高、安全性好，含量达95％以上；

3、所得的苦豆子多糖可经药剂学方法制成各种剂型，方便病人使用；

4、条件易于控制，适用于大规模生产；

5、具有生物利用度高，临床使用方便、安全有效、不良反应少等优点；

附图说明

图1是：本发明提供的一种从苦豆子中提取多糖的方法-试验2混合四种单糖对照品衍生物色谱图；

图2是：本发明提供的一种从苦豆子中提取多糖的方法-试验3苦豆子多糖水解衍生物色谱图；

图3是：本发明提供的一种从苦豆子中提取多糖的方法-苦豆子多糖分子量测定色谱图；

图中：1：D-甘露糖、2：D-鼠李糖、3：D-葡萄糖、4：D-半乳糖。

具体实施方式

以下通过具体实施方式，对本发明提供的一种从苦豆子中提取多糖的方法做进一步更详细的说明。

相关试验

试验1苦豆子多糖相对分子质量测定

1.1色谱条件的确定

流动相的选择：根据OHpak SB-804色谱柱条件，可采用三次蒸馏水、磷酸盐缓冲溶液或醋酸盐缓冲溶液做流动相，但缓冲液浓度控制在0.1～0.3mol/L之间，pH值控制在3.0～8.0之间；选用三次蒸馏水和0.2mol/LpH5.0磷酸盐缓冲液和醋酸盐缓冲液为流动相，以右旋糖酐作为分离试样在柱中进行分离检测；3种流动相对苦豆子多糖的分离效果都很好，出于保护色谱柱的考虑，选用三次蒸馏水作流动相；

流速的选择：根据色谱柱条件，流速应当不超过1.5ml/min，采用0.6、0.8、1.0、1.2ml/min的流速进行样品分离实验；

实验结果表明，出峰时间随着流速的加大而减少，其峰形也有所改变，随之柱压也明显升高，对多糖的分离效果也有所下降；采用0.8ml/min的流速，进样量20μl；

柱温的选择：根据色谱柱条件，柱温选择30℃。

1.2多糖分子量标准曲线的制作

分别精密称取右旋糖酐标准品Mw2000000、133800、84400、41100、21400、7100、4600、2500、180各50.0mg，用三次蒸馏水定容于5ml容量瓶中，配成10.0mg/mL的标准品溶液，按照1.3.1节中确定的色谱条件下分别进样，测得各色谱峰保留时间。应用岛津GPC软件以不同分子量标准右旋糖酐的保留时间(RT)为横坐标，相应的相对分子质量对数值(1gMw)为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3苦豆子多糖样品测定

称取苦豆子多糖50.0mg，用三次蒸馏水定容于5ml容量瓶中，配成10.0mg/mL的样品溶液。按制作标准曲线的色谱条件进样，得到苦豆子多糖的保留时间和相对分子质量如下表1。

表1苦豆子多糖的保留时间和相对分子质量

试验2柱前衍生化HPLC法分析苦豆子多糖中单糖组成

2.1方法以三氟乙酸水解苦豆子多糖，加入衍生化试剂1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)生成衍生化产物，采用RP-HPLC法，色谱柱：C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：乙腈-0.1mol·L^-1磷酸盐缓冲液pH6.7(17∶83)，流速：1.0mL·min^-1，检测器：二极管阵列检测器，检测波长：254nm，柱温：35℃；结果苦豆子多糖由D-甘露糖、D-鼠李糖、D-葡萄糖、D-半乳糖等主要4种单糖组成；D-甘露糖、D-鼠李糖、D-葡萄糖、D-半乳糖的比例约450.76∶1∶4.45∶193.97；结论该方法可以准确的测定出苦豆子多糖中含有的各种单糖。

表2苦豆子多糖水解衍生物色谱测定对应参数

1∶254nm，8nm

实施例1

本实施例的原料纳米氧化铝大孔树脂由天津神能科技有限公司提供，从苦豆子中提取多糖的制备方法，包括以下步骤：

(1)粉碎：取苦豆子原药材，粉碎，过10目筛；

(2)醇提：取步骤(1)过筛后的苦豆子，将其装入渗漉柱内，用浓度为30％的乙醇浸泡18h；再以浓度为30％的乙醇为溶剂，以流速10ml/min，渗漉提取，得到苦豆子中所含生物碱成分；至渗漉提取液与碘化铋钾反应无颜色变化时停止渗漉，取苦豆子提取苦豆子生物总碱后的药渣，晾干备用；

(3)水提：向步骤(2)晾干后的固体产物中加入体积为该固体产物2倍量的水，于40℃，回流1h得水提物；

(4)醇沉：将步骤(3)得到的水提物于35℃减压浓缩成密度为1.02的液体，用浓度为40％的乙醇醇沉，室温放置10h，以3000r/min速率离心，取沉淀，得粗糖提取物，粗糖提取物经水溶后，再加入浓度为80％的乙醇放置10h，以2000r/min速率离心，取沉淀；

(5)酶解、脱色及除蛋白：取上述精制糖提取物按比例添加淀粉酶，于85℃保温20min；加质量百分数为1％的活性炭于90℃回流30min脱色、以2000r/min速率离心；取上清液采用Sevage法脱蛋白，重复3次，取水层浓缩、离心、干燥，得到棕褐色粉末；

(6)柱层脱色分离：将上述棕褐色粉末和载体按重量比为1∶100的比例上样，采用浓度为0.02％的醋酸铵溶液为洗脱液梯度洗脱，将洗脱液浓缩，醇沉，过夜，以2000r/min速率离心，取沉淀干燥，得到白色苦豆子多糖粉末。

(7)柱层纯化分离：将上述白色苦豆子多糖粉末和载体按重量比为1∶10的比例上样，采用浓度为0.01％的醋酸铵溶液洗脱液梯度洗脱，将洗脱液浓缩，透析24h，醇沉，过夜，以2000r/min速率离心，取沉淀冷冻干燥，得到苦豆子多糖；其中，载体为纳米大孔氧化铝树脂。

树脂的预处理，包括以下步骤：

将纳米氧化铝大孔树脂先用蒸馏水浸泡过夜，倾去上层水液及其中的轻质小分子，然后在100℃条件下烘烤2h，放干燥器中冷却过夜；使用前将此树脂浸入0.2mol/L的氯化钠或醋酸铵中1h，待用；

实施例2

本实施例的原料纳米氧化铝大孔树脂由天津神能科技有限公司提供，从苦豆子中提取多糖的制备方法，包括以下步骤：

(1)粉碎：取苦豆子原药材，粉碎，过10目筛；

(2)醇提：取步骤(1)过筛后的苦豆子，将其装入渗漉柱内，用浓度为30％的乙醇浸泡18h；再以浓度为30％的乙醇为溶剂，以流速10ml/min，渗漉提取，得到苦豆子中所含生物碱成分；至渗漉提取液与碘化铋钾反应无颜色变化时停止渗漉，回收乙醇，得苦豆子药渣，晾干备用；

(3)水提：向步骤(2)晾干后的固体产物中加入体积为该固体产物6倍量的水，于60℃，回流1h得水提物；

(4)醇沉：将步骤(3)得到的水提物于35℃减压浓缩成密度为1.02的液体，用浓度为40％的乙醇醇沉，室温放置10h，以2000r/min速率离心，取沉淀，得粗糖提取物，粗糖提取物经水溶后，再加入浓度为80％的乙醇放置10h，以2000r/min速率离心，取沉淀；

(5)酶解、脱色及除蛋白：取上述精制糖提取物按比例添加淀粉酶，于85℃保温20min；加质量百分数为1％的活性炭于90℃回流50min脱色、以2000r/min速率离心；取上清液采用Sevage法脱蛋白，重复3次，取水层浓缩、离心、干燥，得到灰白色粉末；

(6)柱层脱色分离：将上述灰白色粉末和载体按重量比为1∶10的比例上样，采用浓度为0.02％的醋酸铵溶液洗脱液梯度洗脱，将洗脱液浓缩，醇沉，过夜，以2000r/min速率离心，取沉淀干燥，得到白色苦豆子多糖粉末。

(7)柱层纯化分离：将上述白色苦豆子多糖粉末和载体按重量比为1∶100的比例上样，采用浓度为2％的氯化钠溶液洗脱液梯度洗脱，将洗脱液浓缩，透析48h，醇沉，过夜，以5000r/min速率离心，取沉淀冷冻干燥，得到苦豆子多糖。

载体为NKA-II。

树脂的预处理，包括以下步骤：

将NKA-II树脂用蒸馏水充分淋洗，然后再用浓度为95％的乙醇溶液浸泡24h滤出树脂，并用浓度为95％的乙醇溶液反复冲洗树脂至洗出液无色，然后用浓度为5％HCl溶液浸泡4h，并用蒸馏水洗至中性；最后用浓度为2％NaOH溶液浸泡4h，并用蒸馏水洗至中性。

实施例3

本实施例的原料纳米氧化铝大孔树脂由天津神能科技有限公司提供，从苦豆子中提取多糖的制备方法，包括以下步骤：

(1)粉碎：取苦豆子原药材，粉碎，过40目筛；

(2)醇提：取步骤(1)过筛后的苦豆子，将其装入渗漉柱内，用浓度为80％的乙醇浸泡20h；再以浓度为80％的乙醇为溶剂，以流速12ml/min，渗漉提取，得到苦豆子中所含生物碱成分；至渗漉提取液与碘化铋钾反应无颜色变化时停止渗漉，回收乙醇，得苦豆子药渣，晾干备用；

(3)水提：向步骤(2)晾干后的固体产物中加入体积为该固体产物8倍量的水，于100℃，回流4h得水提物；

(4)醇沉：将步骤(3)得到的水提物于80℃减压浓缩成密度为1.03的液体，用浓度为80％的乙醇醇沉，室温放置42h，以4000r/min速率离心，取沉淀，得粗糖提取物，粗糖提取物经水溶后，再加入浓度为90％的乙醇放置45h，以3000r/min速率离心，取沉淀；

(5)酶解、脱色及除蛋白：取上述精制糖提取物按比例添加淀粉酶，于90℃保温30min；加质量百分数为2％的活性炭于100℃回流40min脱色、以3000r/min速率离心；取上清液采用Sevage法脱蛋白，重复4次，取水层浓缩、离心、干燥，得到灰白色粉末；

(6)柱层脱色分离：将上述灰白色粉末和载体按重量比为1∶80的比例上样，采用浓度为0.3％的氯化钠溶液洗脱液梯度洗脱，将洗脱液浓缩，醇沉，过夜，以3000r/min速率离心，取沉淀干燥，得到白色苦豆子多糖粉末。

(7)柱层纯化分离：将上述白色苦豆子多糖粉末和载体按重量比为1∶100的比例上样，采用浓度为1％的醋酸铵溶液或氯化钠溶液洗脱液梯度洗脱，将洗脱液浓缩，透析24-48h，醇沉，过夜，以5000r/min速率离心，取沉淀冷冻干燥，得到苦豆子多糖。

载体为AB-8。

树脂的预处理，包括以下步骤：

将AB-8树脂用蒸馏水充分淋洗，然后再用浓度为95％的乙醇溶液浸泡24h滤出树脂，并用浓度为95％的乙醇溶液反复冲洗树脂至洗出液无色，然后用浓度为5％HCl溶液浸泡4h，并用蒸馏水洗至中性；最后用浓度为2％NaOH溶液浸泡4h，并用蒸馏水洗至中性。

实施例4

本实施例的原料纳米氧化铝大孔树脂由天津神能科技有限公司提供，从苦豆子中提取多糖的制备方法，包括以下步骤：

(1)粉碎：取苦豆子原药材，粉碎，过40目筛；

(2)醇提：取步骤(1)过筛后的苦豆子，将其装入渗漉柱内，用浓度为60％的乙醇浸泡20h；再以浓度为7％的乙醇为溶剂，以流速12ml/min，渗漉提取，得到苦豆子中所含生物碱成分；至渗漉提取液与碘化铋钾反应无颜色变化时停止渗漉，分离渗漉液与残渣；取苦豆子提取苦豆子生物总碱后的药渣，晾干备用；

(3)水提：向步骤(2)晾干后的固体产物中加入体积为该固体产物10倍量的水，于80℃，回流3小时得水提物；

(4)醇沉：将步骤(3)得到的水提物于60℃减压浓缩成密度为1.02的液体，加入乙醇至乙醇终浓度为50％醇沉，4℃冰箱放置20h，以3000r/min速率离心，取沉淀，得苦豆子粗糖提取物，粗糖提取物经水复溶后，再加入乙醇至浓度为80％放置30h，以3000r/min速率离心，取沉淀，冷冻干燥得棕褐色苦豆子粗糖粉末；

(5)酶解、脱色及除蛋白：取上述苦豆子粗糖粉末按比例添加淀粉酶，于85-95℃保温30min；加质量百分数为2％的活性炭于60℃回流40min脱色、以3000r/min速率离心；取上清液采用Sevage法脱蛋白，重复4次，取水层浓缩、醇沉、离心、冷冻干燥，得到灰白色粉末；

(6)柱层脱色分离：将上述灰白色粉末和载体按重量比为1∶80的比例上样，采用浓度为1.2％的醋酸铵溶液或氯化钠溶液洗脱液梯度洗脱，将洗脱液浓缩，透析40h，醇沉，过夜，以4000r/min速率离心，取沉淀冷冻干燥，得到白色苦豆子多糖粉末。

(7)柱层纯化分离：将上述白色苦豆子多糖粉末和载体按重量比为1∶80的比例上样，采用浓度为0.01％-2％的醋酸铵溶液或氯化钠溶液洗脱液梯度洗脱，将洗脱液浓缩，透析24-48h，醇沉，过夜，以3000r/min速率离心，取沉淀冷冻干燥，得到苦豆子多糖。

柱层脱色分离的载体为D301R树脂中的一种。

树脂经过下述步骤预处理：

将D301R树脂用蒸馏水充分淋洗，然后再用浓度为80％的乙醇溶液浸泡24h滤出树脂，并用浓度为80％的乙醇溶液反复冲洗树脂至洗出液无色，然后用浓度为5％HCl溶液浸泡3h，并用蒸馏水洗至中性；最后用浓度为2％NaOH溶液浸泡3h，并用蒸馏水洗至中性。

实施例5

本实施例的原料纳米氧化铝大孔树脂由天津神能科技有限公司提供，从苦豆子中提取多糖的制备方法，包括以下步骤：

(1)粉碎：取苦豆子原药材，粉碎，过30目筛；

(2)醇提：取步骤(1)过筛后的苦豆子，将其装入渗漉柱内，用浓度为100％的乙醇浸泡20h；再以浓度为100％的乙醇为溶剂，以流速15ml/min，渗漉提取，得到苦豆子中所含生物碱成分；至渗漉提取液与碘化铋钾反应无颜色变化时停止渗漉，分离渗漉液与残渣；取苦豆子提取苦豆子生物总碱后的药渣，晾干备用；

(3)水提：向步骤(2)晾干后的固体产物中加入体积为该固体产物6-15倍量的水，于60-110℃，回流1-5h得水提物；

(4)醇沉：将步骤(3)得到的水提物于35℃减压浓缩成密度为1.02的液体，加入乙醇至乙醇终浓度为40％醇沉，4℃冰箱放置10h，以2000r/min速率离心，取沉淀，得苦豆子粗糖提取物，粗糖提取物经水复溶后，再加入乙醇至浓度为70％放置10h，以2000r/min速率离心，取沉淀，冷冻干燥得棕褐色苦豆子粗糖粉末；

(5)酶解、脱色及除蛋白：取上述苦豆子粗糖粉末按比例添加淀粉酶，于85℃保温20min；加质量百分数为1％的活性炭于40℃回流30min脱色、以2000r/min速率离心；取上清液采用Sevage法脱蛋白，重复3次，取水层浓缩、醇沉、离心、冷冻干燥，得到灰白色粉末；

(6)柱层脱色分离：将上述灰白色粉末和载体按重量比为1∶10的比例上样，采用浓度为0.01％的醋酸铵溶液或氯化钠溶液洗脱液梯度洗脱，将洗脱液浓缩，透析24h，醇沉，过夜，以2000r/min速率离心，取沉淀冷冻干燥，得到白色苦豆子多糖粉末。

(7)柱层纯化分离：将上述白色苦豆子多糖粉末和载体按重量比为1∶10的比例上样，采用浓度为0.01％的醋酸铵溶液或氯化钠溶液洗脱液梯度洗脱，将洗脱液浓缩，透析24-48h，醇沉，过夜，以2000r/min速率离心，取沉淀冷冻干燥，得到苦豆子多糖。

柱层脱色分离的载体为H103树脂。

树脂经过下述步骤预处理：

b、将H103树脂用蒸馏水充分淋洗，然后再用浓度为85％的乙醇溶液浸泡24h滤出树脂，并用浓度为95％的乙醇溶液反复冲洗树脂至洗出液无色，然后用浓度为5％HCl溶液浸泡4h，并用蒸馏水洗至中性；最后用浓度为2％NaOH溶液浸泡2h，并用蒸馏水洗至中性。

上述实施例中采用的载体除实施例中列举的外，也可以是本发明中的其他载体。

最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：技术人员阅读本申请说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围之内。

Claims (4)

1.一种从苦豆子提取苦豆子生物总碱后的药渣中提取多糖的方法，包括以下步骤：

(1)粉碎：取苦豆子原药材，粉碎，过10-60目筛；

(2)醇提：取步骤(1)过筛后的苦豆子，将其装入渗漉柱内，用浓度为30％-100％的乙醇浸泡18-24h；再以浓度为30％-100％的乙醇为溶剂，以流速10-15ml/min，渗漉提取，得到苦豆子中所含生物碱成分；至渗漉提取液与碘化铋钾反应无颜色变化时停止渗漉，分离渗漉液与残渣；取苦豆子提取苦豆子生物总碱后的药渣，晾干备用；

(3)水提：向步骤(2)晾干后的固体产物中加入体积为该固体产物6-15倍量的水，于60-110℃，回流1-5h得水提物；

(4)醇沉：将步骤(3)得到的水提物于35-90℃减压浓缩成密度为1.02-1.1的液体，加入乙醇至乙醇终浓度为40-90％醇沉，4℃冰箱放置10-48h，以2000-5000r/min速率离心，取沉淀，得苦豆子粗糖提取物，粗糖提取物经水复溶后，再加入乙醇至浓度为70％-90％放置10-48h，以2000-5000r/min速率离心，取沉淀，冷冻干燥得棕褐色苦豆子粗糖粉末；

(5)酶解、脱色及除蛋白：取上述苦豆子粗糖粉末按比例添加淀粉酶，于85-95℃保温20-40min；加质量百分数为1-3％的活性炭于40-70℃回流30-50min脱色、以2000-5000r/min速率离心；取上清液采用Sevage法脱蛋白，重复3-5次，取水层浓缩、醇沉、离心、冷冻干燥，得到灰白色粉末；

(6)柱层脱色分离：将上述灰白色粉末和载体按重量比为1∶10-100的比例上样，采用浓度为0.01％-2％的醋酸铵溶液或氯化钠溶液洗脱液梯度洗脱，将洗脱液浓缩，透析24-48h，醇沉，过夜，以2000-5000r/min速率离心，取沉淀冷冻干燥，得到白色苦豆子多糖粉末。

(7)柱层纯化分离：将上述白色苦豆子多糖粉末和载体按重量比为1∶10-100的比例上样，采用浓度为0.01％-2％的醋酸铵溶液或氯化钠溶液洗脱液梯度洗脱，将洗脱液浓缩，透析24-48h，醇沉，过夜，以2000-5000r/min速率离心，取沉淀冷冻干燥，得到苦豆子多糖。

2.根据权利要求1所述的提取多糖的方法，其特征在于所述柱层脱色分离的载体为选自纳米大孔氧化铝、纤维素DEAE-52以及NKA、NKA-II、AB-8、S-8、X-5、H103、D301R、D201、001×7型树脂中的一种。

3.根据权利要求1所述的提取多糖的方法，其特征在于所述树脂经过下述步骤预处理：

a、将纳米氧化铝大孔树脂先用蒸馏水浸泡过夜，倾去上层水液及其中的轻质小分子，然后在100℃条件下烘烤2h，放干燥器中冷却过夜；使用前将此树脂浸入0.2mol/L的氯化钠或醋酸铵溶液中1-2h，待用；

b、将DEAE-52等树脂用蒸馏水充分淋洗，然后再用浓度为85％-95％的乙醇溶液浸泡24h滤出树脂，并用浓度为85％-95％的乙醇溶液反复冲洗树脂至洗出液无色，然后用浓度为5％HCl溶液浸泡2-4h，并用蒸馏水洗至中性；最后用浓度为2％NaOH溶液浸泡2-4h，并用蒸馏水洗至中性。

4.根据权利要求1所述的提取多糖的方法，其特征在于所述洗脱液为浓度分别为0.02mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L醋酸铵溶液或浓度分别为0.01mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L氯化钠溶液。

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