CN107778376B - 一种三叶青多糖的制备方法及其应用 - Google Patents
一种三叶青多糖的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术领域,具体涉及了中草药三叶青多糖的制备及应用。以三叶青藤叶为原料,按照如下步骤依次实施:(1)热水浸提;抽滤收集滤液;真空浓缩;浓缩液加入乙醇;收集沉淀,即三叶青粗多糖。(2)将粗多糖溶于水,加入Sevag试剂;搅拌后离心除蛋白层和有机层,重复此步操作多次至不出现蛋白为止;(3)将除蛋白后的多糖溶于去离子水中,通过DEAE‑52离子交换层析和Sephadex G‑100葡聚糖凝胶层析得到三叶青多糖单一组分。本发明所涉及的三叶青多糖,可显著降低机体血糖血脂,改善机体内抗氧化酶酶活力水平,并对胰岛具有一定修复作用,具有很好的药用价值和市场价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种三叶青多糖的制备及其应用。
背景技术
三叶青(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)正名三叶崖爬藤,又名金线吊葫芦、蛇附子,生长于阴湿山坡、山谷等地带,主要分布在我国东南。西南地带。三叶青全草均可入药,是我国著名的中草药之一,具有显著的药用价值,如治疗病毒性脑膜炎、支气管炎、小儿高热惊厥、预防以及治疗癌症等。
糖尿病分为一型糖尿病和二型糖尿病,其中一型糖尿病是指胰岛素相对或绝对分泌不足,必须依赖胰岛素维系生命,二型糖尿病是指胰岛素抵抗或不敏感,患者具有典型的“三多一少”症状,即多食多饮多尿,体重减轻。随着人民生活水平日益增长,我国患糖尿病的人数与日俱增。据统计,目前我国糖尿病病人人数高达9000多万人,位居世界第一,二型糖尿病患者占据糖尿病患病人数的80%以上,且50%以上二型糖尿病患者具有一种或多种糖尿病并发症。糖尿病并发症包括高血压、高血脂、心脑血管疾病等,严重损害人民的身体健康,因此防治糖尿病刻不容缓。
发明内容
本发明的目的在于提供一种三叶青多糖的制备及其应用。
为解决上述技术问题,本发明可以通过以下步骤实现。
所述三叶青多糖的制备,包括以下步骤:
(1)三叶青粗多糖的提取:
干燥三叶青经粉碎后用去离子水80℃煮提 3 小时;抽滤得滤液,滤液经过80度水浴浓缩至原体积的四分之一,加入5倍体积的无水乙醇,沉淀静止过夜;5000转/分离心10分钟收集沉淀,经冷冻干燥后得粗多糖;
(2)Savag法除蛋白。
A1:向10wt%三叶青粗多糖水溶液中加入 Sevag 试剂充分搅拌1~2小时,;
B1:然后3500~4500 转/分离心10~25分钟,去除蛋白层和氯仿层,水层重复操作至不再出现蛋白层为止,所得水溶液经透析和冷冻干燥得到脱蛋白三叶青精多糖。
(3)三叶青精多糖的分级:
将5wt%脱蛋白三叶青多糖经DEAE- 纤维素离子交换层析柱分级;3倍柱体积的不同浓度氯化钠溶液洗脱,收集0.3M氯化钠洗脱液组分,经去离子水透析、冷冻干燥得到多糖级分。
步骤(2)中,Sevag 试剂包括正丁醇及氯仿;其中 :正丁醇与氯仿的体积比为:1 :4;
本发明方法制得的三叶青多糖组分经过Sephadex G-100凝胶洗脱鉴定为单一组分,其中单糖组成以及摩尔比率分别为Rha:Ara:Man:Glc::Gal = 006:0.13:0.38:0.09:0.31。分子量为9×104 ~ 10.0×104Da。
本发明的显著优点在于:
通过传统水提醇沉方式提取多糖,提取条件简单,提取成本低廉,其次通过两步纯化得到单一组分的多糖,便与后续进行降血糖活性的相关应用。
附图说明
图 1 为三叶青多糖的离子交换层析图。
图 2 为三叶青多糖的 Sephadex G-100凝胶层析图。
具体实施方式
为进一步公开而不是限制本发明,以下结合实例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
按如下步骤依次实施制备。
称取干燥三叶青粉末500g,用2升去离子水80℃提取3小时;抽滤得到滤液,在80℃水浴温度下浓缩至原体积的1/4;加入5倍体积的无水乙醇,沉淀静止过夜;5000转/分离心10分钟收集沉淀,经冷冻干燥后得粗多糖50.45克;
称取三叶青粗多糖50克,溶解1500毫升去离子水中,加入300毫升Sevag试剂;氯仿;正丁醇=4:1,v/v;充分搅拌1小时,3500转离心20分钟,去除蛋白层和有机层;水层反复重复除蛋白步骤到不出现蛋白层为止;所得水溶液用去离子水透析72小时,冷冻干燥得脱蛋白三叶青多糖27.56克。
将5克脱蛋白多糖溶解于50毫升去离子水中,用2.6×30cmDEAE-纤维素离子交换柱分离;依次用500毫升水、0.1M-0.3M氯化钠溶液洗脱,洗脱四度为8毫升/分钟,每20毫升洗脱液收集一管,经由苯酚硫酸法检测,收集0.3M氯化钠洗脱下来的组分,用去离子水透析72小时后,冷冻干燥得到2.2克三叶青多糖组分。
三叶青多糖降糖实验。
从100只ICR小鼠中随机取10只作为空白对照组,其余小鼠禁食12小时后,按100mg/kg剂量腹腔注射四氧嘧啶溶液。72小时后,尾静脉采血,测定禁食12小时后小鼠血糖值,取血糖值大于11.0mmol/L的小鼠为成型的糖尿病小鼠。将糖尿病模型小鼠分为6组,每组10只,模型对照组和正常对照组灌胃给去离子水,阳性对照组灌胃给予格列本脲25mg/kg,其余3组为多糖实验组,分别给予三叶青多糖剂量100、200和400mg/kg。每天灌胃给药1次,连续35天,末次给药后所有小鼠禁食12小时后,测定血糖含量。实验结果见表1。
表1 三叶青多糖对糖尿病小鼠血糖的影响。
注:与模型组比较:*,p<0.05;**,p<0.01。
由表1可知,糖尿病小鼠经灌胃给药35天后,三叶青多糖和阳性对照组均能显著降低小鼠血糖值,其中多糖400mg/kg实验组能够极显著降低小鼠血糖,效果接近格列本脲,说明三叶青多糖在口服的情况下即可以实现其降血糖功能。
图1为三叶青除蛋白后的多糖,经过第一轮纯化,即DEAE-52离子交换层析后的结果,如图可知,共洗脱出5个组分,选取主要组分收集起来进行下一步纯化。图2为第二轮纯化,即葡聚糖凝胶G-100的洗脱图,由图2可知,仅出现一个单峰,说明纯化到这一步的多糖是分子量均一,电荷量均一的单一组分多糖。可用于下一步降血糖实验的应用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (2)
1.一种三叶青多糖在制备降血糖药物上的应用,其特征在于:所述三叶青多糖的制备方法,包括如下步骤依次实施:
(1)称取干燥三叶青粉末500g,用2升去离子水80℃提取3小时;抽滤得到滤液,在80℃水浴温度下浓缩至原体积的1/4;加入5倍体积的无水乙醇,沉淀静置过夜;5000转/分离心10分钟收集沉淀,经冷冻干燥后得粗多糖;
(2)称取三叶青粗多糖50克,溶解1500毫升去离子水中,加入300毫升Sevag试剂;充分搅拌1~2小时,3500转/分离心20分钟,去除蛋白层和有机层;水层反复重复除蛋白步骤到不出现蛋白层为止;所得水溶液用去离子水透析72小时,冷冻干燥得脱蛋白三叶青多糖;
(3)将5克脱蛋白多糖溶解于50毫升去离子水中,用2.6×30cmDEAE-纤维素离子交换柱分离;依次用500毫升水、0.1M-0.3M氯化钠溶液洗脱,洗脱速度8毫升/分钟,每 20 毫升洗脱液收集一管,经由苯酚硫酸法检测,收集0.3M氯化钠洗脱下来的组分,用去离子水透析72小时后,冷冻干燥得到三叶青多糖组分。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:Sevag试剂具体为:按体积比计,氯仿;正丁醇=4:1。
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