CN109705229B - 一种三叶青多糖及其在制备免疫调节剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种三叶青多糖及其在制备免疫调节剂中的应用，将三叶青粉末加入双蒸水中，回流浸提，获得三叶青藤叶部位粗多糖；将三叶青藤叶部位粗多糖溶于双蒸水，Sevag法除蛋白，接着脱盐，然后过阴离子交换柱，收集0.3‑0.6mol/L NaCl洗脱峰，最后除去NaCl得三叶青藤叶部位多糖。本发明所述三叶青藤叶部位多糖能激活TLR4通路，显著提高OVA免疫小鼠血清抗OVA特异性抗体IgG水平，能显著促进OVA刺激下的淋巴细胞增殖，同时能显著增加LPS诱导的B淋巴细胞增殖。

Description

一种三叶青多糖及其在制备免疫调节剂中的应用

技术领域

本发明涉及一种三叶青多糖及其作为一种天然TLR4激动剂发挥免疫调节作用。

背景技术

Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)是免疫调节的一个重要受体，也是细菌内毒素(LPS)产生急性炎症作用的一个关键受体。TLR4是LPS激活髓样细胞分化蛋白(MyD88)依赖性途径和β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TRIF)依赖性途径在细胞内信号传导级联的唯一Toll样受体。在识别病原体后，TLR4受体会与其配体发生相互作用引起下游信号产生级联反应，并诱导促炎细胞因子和趋化因子表达，上调MHC分子和共刺激分子，从而架起宿主抵御任何病原体攻击时固有免疫识别与适应性免疫应答，即特异性T、B淋巴细胞反应之间的桥梁。因此，TLR4受体激动剂广泛用作疫苗的佐剂，以诱导强效而持久的免疫应答。

多糖普遍存在于动植物和微生物中，是维持生命活动正常运转的基本物质之一，具有多种生物活性和功能，可作为广谱免疫促进剂以增强机体的免疫调节功能。大多数高等植物多糖相对无毒，也不会引起不良反应，这是与免疫调节细菌多糖和人造化合物的主要区别。三叶青学名为三叶崖爬藤(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)，是我国特有的葡萄科崖爬藤属珍稀药用植物，别名蛇附子、三叶扁藤、金丝吊葫芦、三叶对等。三叶青以块根或全草入药，在民间已有较长的药用历史；具有抗肿瘤、保肝护肝和抗病毒等药理作用。

基于三叶青多糖在免疫方面的研究甚少，发明人通过深入的研究发现三叶青多糖对THP-1源性人巨噬细胞的TLR4信号通路具有激活作用；对OVA免疫小鼠有免疫佐剂作用。

发明内容

本发明目的是提供一种三叶青多糖，该多糖可发挥免疫调节作用，特别是作为一种天然TLR4激动剂，扩大了三叶青的药用用途，为寻求安全有效的免疫佐剂提供了研究方向。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种三叶青藤叶部位多糖，所述三叶青藤叶部位多糖按如下方法制备：(1)取三叶青藤叶部位干燥至恒重后粉碎，获得三叶青粉末；将三叶青粉末与双蒸水混合，加热回流提取(优选3-4次)，过滤，取滤液加入体积浓度95％乙醇水溶液，充分混匀，室温静置12h，离心(优选3800r/min离心10min)，取沉淀用无水乙醇洗涤，抽滤，挥去乙醇溶液，沉淀冷冻干燥，获得三叶青藤叶部位粗多糖；(2)将三叶青藤叶部位粗多糖溶于双蒸水，Sevag法除蛋白，接着脱盐，然后过阴离子交换柱，收集0.3-0.6mol/L NaCl洗脱峰，最后除去NaCl得三叶青藤叶部位多糖。

进一步，步骤(1)所述取三叶青藤叶部位45-55℃烘箱干燥至恒重后粉碎。

进一步，步骤(1)所述双蒸水体积用量以三叶青粉末重量计为20-30ml/g。

进一步，步骤(2)所述双蒸水体积用量以三叶青粉末重量计为20-30ml/g。

本发明提供一种三叶青多糖在制备免疫调节剂中的应用，所述免疫调节剂为TLR4通路激活剂，进一步，所述免疫调节剂为提高抗OVA特异性抗体IgG水平促进剂或脾淋巴细胞体外增殖促进剂，其中脾淋巴细胞为OVA刺激下的淋巴细胞或LPS诱导的B淋巴细胞。

免疫佐剂发展迅速，常见有铝胶、油类缓释刹、高分子聚合物、碳水化合物和脂质体及其他细菌毒素。铝佐剂和弗氏佐剂是目前被广泛使用的免疫增强佐剂，其作用机理主要是在机体注射部位形成抗原储藏库，使抗原缓慢释放，刺激浆细胞产生抗体。但铝佐剂容易形成肉芽肿，甚至会发生局部无菌性脓肿，引起机体过敏反应；而且铝胶冷冻后容易变性，所以含铝佐剂的生物制品不宜冷冻。而弗氏佐剂中的矿物油不能被机体代谢，容易引起注射部位的炎症反应、肉芽肿、溃疡和发热等副反应。因此，寻找更加安全、高效的新型免疫佐剂，以提高免疫原性、减少不良反应成为了当务之急。中药取材于大自然，以多效、毒副作用小而深得患者青睐。其中补益类中药的活性成分以多糖的形式存在，具有免疫调节作用，主要是免疫促进作用，有的还表现为双向调节作用。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

本发明三叶青藤叶部位多糖主要由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成，可作为一种天然TLR4激动剂发挥免疫调节作用，为寻求更安全有效的免疫佐剂提供了研究方向，同时也为三叶青多糖作为免疫佐剂进入临床提供了理论依据。本发明所述三叶青藤叶部位多糖能激活TLR4通路，显著提高OVA免疫小鼠血清抗OVA特异性抗体IgG水平，能显著促进OVA刺激下的淋巴细胞增殖，同时能显著增加LPS诱导的B淋巴细胞增殖。

附图说明

图1 THP对HEK-Blue^TM hTLR4(A)和THP-1(B)细胞细胞增殖率影响

图2三叶青藤叶部位多糖(A)及LPS(B)对HEK-Blue^TM hTLR4细胞TLR4通路的激活程度的影响

图3 THP(A)和LPS(B)对THP-1细胞TNF-α分泌水平的影响

注：与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。

图4 THP(A)和LPS(B)对THP-1细胞IP-10分泌水平的影响

注：与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。

图5 THP对THP-1细胞TNF-α(A)、IL-6(B)、IP-10(C)、IFN-β(D)、TLR4(E)、IL-12p35(F)和IL-12p40(G)mRNA表达的影响

注：与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。

图6 THP对小鼠血清抗OVA特异性抗体IgG水平的影响

注：与正常对照组相比，#P<0.05，##P<0.01；与OVA免疫对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。

图7对小鼠脾淋巴细胞体外增殖的影响

注：与OVA免疫对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明所述三叶青正名：三叶崖爬藤(学名：Tetrastigma hemsleyanum Diels etGilg)又名金线吊葫芦、蛇附子、石老鼠，属鼠李目，葡萄科草质藤本，全草均可入药。

实施例1三叶青藤叶部位多糖(THP)

取三叶青藤叶部位在45-55℃烘箱干燥至恒重后粉碎，获得三叶青粉末。将三叶青粉末与双蒸水按照1g：20mL的料液比混合，加热回流提取3次，过滤，合并滤液，取滤液加入体积浓度95％乙醇水溶液，充分混匀，室温静置12h，离心，取沉淀用无水乙醇洗涤，抽滤，挥去乙醇溶液，沉淀冷冻干燥，获得三叶青藤叶部位粗多糖；将三叶青藤叶部位粗多糖溶于双蒸水，Sevag法除蛋白，接着脱盐，然后过阴离子交换柱，收集0.3-0.6mol/L NaCl洗脱峰，最后除去NaCl，得三叶青藤叶部位多糖。

实施例2 MTS法检测三叶青藤叶部位多糖对HEK-Blue^TM hTLR4细胞和THP-1细胞毒性

HEK-Blue^TM hTLR4细胞(美国InvivoGen公司)；THP-1细胞(中国科学院上海细胞库)。

96孔板实验分组：空白组、对照组和加药组。

收集对数生长期HEK-Blue^TM hTLR4细胞，用DMEM培养液调整细胞密度为5×10⁵/mL的单细胞悬液，每孔100μL接种于96孔板，即5×10⁴/well，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养2h，分为加药组和对照组，同时设立不添加细胞的空白组。加药组每孔再加入100μL含不同终浓度实施例1方法制备的三叶青藤叶部位多糖(0.316、1、3.16、10、31.6、100、316、1000μg/mL)的DMEM培养液，空白组和对照组分别加入100μL DMEM培养液，37℃、5％CO₂培养箱培养24h后每孔加入MTS(新一代四氮唑蓝盐化合物)20μL。37℃孵育2h，490nm波长处测定吸光度值，计算细胞存活率。THP-1细胞实验方法同HEK-Blue^TM hTLR4细胞，分析药物对HEK-Blue^TM hTLR4细胞和THP-1细胞增殖的影响(见图1)。细胞存活率＝(实验组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)。

结果表明三叶青藤叶部位多糖对HEK-Blue^TM hTLR4细胞和THP-1细胞无明显的细胞毒作用。

实施例3三叶青藤叶部位多糖对HEK-Blue^TM hTLR4细胞TLR4信号通路的激活效应评价

实验分组：给药组、LPS组和空白对照组。

收集对数生长期HEK-Blue^TM hTLR4细胞，用DMEM培养液调整细胞密度为5×10⁵/mL的单细胞悬液，每孔100μL接种于96孔板，即5×10⁴/well。置于37℃、5％CO₂培养箱中培养2h，分为给药组、LPS组和空白对照组。给药组加入100μL含不同终浓度实施例1方法制备的三叶青藤叶部位多糖(0.0001、0.000316、0.001、0.00316、0.01、0.0316、0.01、0.316、1、3.16、10、31.6、100、316、1000μg/mL)的DMEM培养液；LPS(脂多糖)组(美国Sigma公司)加入100μL含终浓度1μg/mL LPS的DMEM培养液；空白对照组加入100μL的DMEM培养液，分别置于培养箱中培养24h。分别取各组细胞上清60μL加入一个新的96孔板，再加入新鲜DMEM培养液和140μL QUANTI-Blue^TM液(美国Invitrogen公司)，混匀后37℃孵育15min，于波长620nm处读取OD值，通过测量分泌性碱性磷酸酶(SEAP)含量检测TLR4通路激活程度。TLR4通路激活程度(％)＝[(各加药组OD均值-空白对照组OD均值)/(LPS组OD均值-空白对照组OD均值)]×100％(见图2)。

实验结果表明，三叶青藤叶部位多糖有明显的激活TLR4信号通路的作用。当THP的浓度大于0.001μg/mL时，HEK-Blue^TM hTLR4细胞的TLR4通路明显激活，且呈剂量依赖性；当浓度大于10μg/mL时，HEK-Blue^TM hTLR4细胞TLR4通路的激活程度不再随THP浓度升高而升高。

实施例4三叶青藤叶部位多糖对THP-1源性人巨噬细胞TLR4信号通路的激活作用

1、用ELISA法检测THP-1源性人巨噬细胞上清细胞因子水平

药物处理：收集对数生长期THP-1源性人巨噬细胞，用含5ng/mL的PMA(丙二醇甲醚醋酸酯)的RPMI1640培养液调整细胞密度，以5×10⁴/well接种于96孔板，每孔100μL，置于细胞培养箱中培养48h，分为加药组、LPS组和空白对照组。各加药组每孔加入100μL含不同终浓度实施例1方法制备三叶青藤叶部位多糖(0.1、0.316、1、3.16、10、31.6、100μg/mL)的RPMI1640培养液。LPS组加入100μL含LPS终浓度100ng/mL的RPMI1640培养液；空白对照组加入100μL的RPMI1640培养液，培养18h后用ELISA方法检测THP-1细胞TNF-α和IP-10分泌水平(见图3、4)。

结果表明31.6μg/mL和100μg/mL浓度的三叶青藤叶部位多糖作用下的THP-1细胞TNF-α分泌水平较空白对照组有极显著差异(P<0.01)，分别达到682.6pg/mL和1372.78pg/mL；10μg/mL至100μg/mL浓度范围的三叶青藤叶部位多糖作用下的THP-1细胞IP-10分泌水平较空白对照组有极显著差异(P<0.01)，其中31.6μg/mL浓度的三叶青藤叶部位多糖作用下的THP-1细胞IP-10分泌量达到338.42pg/mL。

2、Q-PCR检测THP-1细胞mRNA表达量

收集对数生长期THP-1源性人巨噬细胞，用含5ng/mL PMA的RPMI1640培养液调整细胞密度，以1×10⁶/well接种于6孔板，每孔2mL，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养48h，设为加药组、LPS组和空白对照组。每孔弃去细胞上清液1mL，加药组每孔加入1mL含不同终浓度(1、10、100μg/mL)实施例1方法制备三叶青多糖的RPMI1640培养液，LPS组加入1mL含LPS终浓度100ng/mL的RPMI1640培养液，空白对照组加入1mL的RPMI1640培养液，培养6h后采用

Premix Ex Taq II试剂盒(日本Takara公司)配制20μL反应体系，Q-PCR检测THP-1细胞TNF-α、IL-6、IP-10、IFN-β和IL-12基因mRNA的表达(反应条件为95℃预变性5min；95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸15s，共40个循环，见图5)。

实验结果发现三叶青藤叶部位多糖对MyD88依赖性途径和TRIF依赖性途径均有激活作用，且对THP-1细胞TLR4本身的mRNA合成也有促进作用，同时能促进IL-12表达。

实施例5三叶青藤叶部位多糖对小鼠血清抗OVA特异性抗体IgG水平和脾淋巴细胞体外增殖的影响

1、动物分组和免疫程序

60只雌性C57BL/6小鼠(6周龄)，适应性喂养7d。随机分为6组，每组10只。组别分为：组1.正常对照组，组2.OVA免疫对照组，组3-组5.THP(实施例1方法制备的三叶青藤叶部位多糖)高、中、低剂量组，组6.阳性(铝佐剂)对照组。组3-组5分别按THP给药量200，100，50mg/kg·bw(药物按0.1mL/10g·bw用蒸馏水配制成相应浓度)，连续灌胃给药4d，组1、组2和组6灌胃相应体积的蒸馏水。在末次给药24h后进行第一次免疫，以OVA为模式抗原，组2、组3-组5小鼠腹股沟皮下注射生理盐水稀释的OVA，20μg/只(0.1mL/只)；组6注射OVA稀释液和铝佐剂体积比1：1混匀的液体，20μg/只(0.1mL/只)；组1注射生理盐水0.1mL/只。14d后进行第二次免疫，二免前同样给药4d，给药和免疫方法同前。二免结束后14d进行样本采集。

2、用ELISA法检测血清抗OVA特异性抗体IgG水平

步骤1二次免疫后小鼠眼球取血至1.5mL离心管中，室温静置1.5h后，3000rpm离心10min，取上清，即为血清。用PBS将小鼠血清按体积比1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400，1:12800稀释。ELISA法检测血清抗OVA特异性抗体IgG水平(见图6)。

结果表明，OVA免疫组与正常对照组相比，在1:400至1:1600倍稀释时均呈显著性差异(P<0.01或P<0.05)，但在1:3200至1:6400倍稀释时无统计学差异。而各THP给药组血清抗OVA特异性抗体IgG水平明显高于OVA免疫对照组；高剂量组在各个稀释度与OVA免疫对照组比较均有极显著差异(P<0.01)，中剂量组和低剂量组只在1:12800稀释时无显著性差异。阳性(铝佐剂)对照组在各个稀释度与OVA免疫对照组比较均有极显著差异(P<0.01)。以上结果表明，THP能显著提高小鼠血清抗OVA特异性抗体IgG水平。

3、脾淋巴细胞增殖反应检测

(1)脾淋巴细胞悬液制备：将脱颈处死的小鼠放入75％酒精中浸泡3-5min后取出脾脏，放入预冷的EP管中(内已加1mL PBS)置于冰上。清洗脾脏两次后，将脾脏放于尼龙网筛底部，加入3mL PBS，用5mL注射器活塞轻轻点压脾脏，直至筛上基本无红色组织物。

(2)去红细胞：将步骤(1)研磨好的脾淋巴细胞悬液放入离心管中，1000rpm离心5min，弃上清；加1mL红细胞裂解液(美国Solarbio公司)和5mL PBS，摇匀，1400rpm离心5min，弃上清；再加5mL PBS，1400rpm离心5min，弃上清；加3mL含5ng/mL PMA(丙二醇甲醚醋酸酯)的RPMI 1640培养液，吹打均匀。

(3)MTS检测细胞增殖：收集步骤(2)生长状态良好的脾淋巴细胞，向96孔板上加入终浓度为5×10⁶cells/mL的细胞，分别使用终浓度为5μg/mL的ConA(刀豆蛋白A)、8μg/mL的LPS(脂多糖)、100μg/mL的OVA抗原(卵清蛋白)刺激，并设置正常对照组、OVA免疫对照组(卵清蛋白100μg/mL)、铝佐剂阳性对照组(Al(OH)₃ 100μg/mL)、THP高剂量组(实施例1制备的三叶青多糖，200mg/kg·bw)、THP中剂量组(实施例1制备的三叶青多糖，100mg/kg·bw)、THP低剂量组(实施例1制备的三叶青多糖，50mg/kg·bw)，每孔最终容量100μL，每个样本重复3孔；置于37℃，5％CO₂培养箱培养48h后用MTS法检测，微孔板酶标仪在490nm处测定吸光值(OD值)。刺激指数(SI)＝(刺激孔OD–空白孔OD)/(未刺激OD–空白孔OD)(见图7)。

小鼠脾淋巴细胞体外增殖检测结果显示，各THP给药组与OVA免疫对照组相比，均能显著增加LPS诱导的B淋巴细胞增殖(P<0.01)，但对ConA诱导的T淋巴细胞增殖无显著影响；而对于OVA刺激的淋巴细胞增殖，中剂量(100mg/kg·bw)和低剂量组(50mg/kg·bw)THP均有极显著的促进作用(P<0.01)，但高剂量(200mg/kg·bw)组未能表现显著的促进作用。阳性(铝佐剂)对照组在LPS诱导的B淋巴细胞增殖和ConA诱导的T淋巴细胞增殖方面与OVA免疫对照组比较无统计学差异，但对于OVA刺激的淋巴细胞增殖有极显著的促进作用(P<0.01)。

Claims (4)

1.一种三叶青多糖在制备免疫调节剂中的应用，其特征在于所述免疫调节剂为TLR4通路特异激活剂或抗OVA特异性抗体IgG水平促进剂；

所述三叶青多糖按如下方法制备：（1）将三叶青地上部分清洗、干燥，粉碎，获得三叶青粉末；将三叶青粉末加入双蒸水中，回流浸提，过滤，取滤液加入体积浓度95%乙醇水溶液，充分混匀，室温静置12 h，离心，取沉淀用无水乙醇洗涤，抽滤，挥去乙醇溶液，沉淀冷冻干燥，获得三叶青粗多糖；（2）将三叶青粗多糖溶于双蒸水，Sevag法除蛋白，接着脱盐，然后过阴离子交换柱，收集0.3-0 .6mol/L NaCl洗脱峰，最后除去NaCl得三叶青多糖。

2.如权利要求1所述应用，其特征在于步骤（1）所述双蒸水体积用量以三叶青粉末重量计为15ml/g。

3.如权利要求1所述应用，其特征在于所述回流浸提是在80℃回流提取3次，每次均提取30 min，合并3次滤液。

4.如权利要求1所述应用，其特征在于所述体积浓度95%乙醇水溶液加入量为滤液体积的3倍。

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