CN105504076B - 一种具有解热抗炎作用的三叶青块根多糖及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有解热抗炎作用的三叶青块根多糖及其用途，该三叶青块根多糖具有显著的解热抗炎作用，可用于制备解热抗炎药物，并在肿瘤、自身免疫、2型糖尿病等常伴有低热、炎症疾病的防治中具有一定应用价值。本发明以三叶青为依托，制备三叶青块根多糖，开发其功效，扩大三叶青新的药用资源。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种具有解热抗炎作用的三叶青块根多糖及其用途。
背景技术
保持恒定的体温，是保证新陈代谢和生命活动正常进行的必要条件。一定限度内的发热是人体抵抗疾病的生理性防御反应，但体温过高或时间过长可使机体各种调节功能失调，并引起机体一系列的代谢和功能变化。例如，发热容易导致神经系统的功能障碍，可使病人出现烦躁、谵语、幻觉，甚至抽搐。这种情况在婴幼儿中更容易发生，当体温上升到39℃以上时，极易引起惊厥，若反复发作则会使大脑受到伤害。等到体温达到43℃，只要几小时病人就会因体温过高而死亡；由于循环系统的功能障碍，发热可引起心跳加快，消耗大量的物质和能量，常常导致机体水盐代谢的紊乱。尤其是肿瘤患者，即使是低热也会增加全身的慢性消耗，往往很容易产生负氮平衡，进一步促进恶液质的提前发生。因此，解热对于维持机体身体健康起着至关重要的作用。
目前解热抗炎类药物主要为非甾体类药物，尽管这些药物有明显的解热抗炎作用，但该类药物所引起的不良反应却不容忽视，比如肝肾毒性、消化道出血、镇静、头痛、皮肤过敏、认知功能障碍等，常常因为不良反应中断治疗，影响药物疗效。因此，开发研究药效明确且安全的新型的解热抗炎类药物十分必要。以中药为代表的天然药物因其多靶点的综合作用机制且副反应少而成为解热抗炎新药的最佳研究热点，具有较好的研究及开发前景。
三叶青学名为三叶崖爬藤(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)，是我国特有的葡萄科崖爬藤属珍稀药用植物，主要分布于浙江、广西、江西等少数省份，以地下块根或全草入药。具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛等功效，主治毒蛇咬伤、扁桃体炎、淋巴结结核、跌打损伤、小儿高热惊厥等疾病。尽管已有文献报道三叶青提取物具有解热镇痛抗炎作用，但有关三叶青多糖是否具有解热抗炎作用未见任何报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有解热抗炎作用的三叶青块根多糖，该多糖具有如图1所示的红外特征，且具有显著的解热抗炎作用，扩大了三叶青的药用用途。
本发明还提供了三叶青块根多糖作为制备解热抗炎药物的用途。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种具有解热抗炎作用的三叶青块根多糖，通过以下方法制备获得：
(1)取三叶青块根35-65℃烘箱干燥，干燥至恒重后粉碎，将粉碎物与双蒸水按照1g：10-30mL的料液比混合，加热回流提取2-5次，过滤，合并滤液，减压浓缩，并采用乙醇沉淀法得到三叶青块根粗多糖；
(2)将三叶青块根粗多糖溶于双蒸水，Sevag法除蛋白，接着脱盐，然后过阴离子交换柱，收集0.1-0.8mol/L NaCl洗脱峰，最后除去NaCl得三叶青块根多糖。
发明人通过长期研究发现，三叶青富含多糖，且三叶青多糖具有明确的解热抗炎镇痛作用，进一步研究，发明人利用活性追踪法发现三叶青块根多糖是三叶青解热抗炎的主要活性组分。
通过建立干酵母致小鼠发热模型、二甲苯致小鼠耳肿胀及角叉菜胶致小鼠足跖肿胀等动物模型，本发明人发现三叶青块根多糖具有很强的解热抗炎作用。
通过上述三叶青块根多糖的制备和解热抗炎作用药效的确认。根据现代制剂技术，三叶青块根多糖可以与药剂或者食品上认可的辅料，制成以三叶青块根多糖为主的胶囊剂、片剂、散剂、口服液、软胶囊、丸剂、缓释制剂等各种剂型。
作为优选，步骤(1)乙醇沉淀法具体为：向浓缩物中入3倍体积的95％乙醇，静置过夜后，4200rpm高速离心15min，取沉淀用水溶解，然后再次进行乙醇沉淀，离心得三叶青块根粗多糖。
作为优选，所述阴离子交换柱为DEAE Sepharse Fast Flow阴离子交换柱。一种具有解热抗炎作用的三叶青块根多糖用于制备解热抗炎药物的用途。一种具有解热抗炎作用的药物，由三叶青块根多糖作为有效成分与药学上可接受的辅料制成。
本发明的有益效果是：本发明以三叶青为依托，制备三叶青块根多糖，开发其功效，扩大三叶青新的药用资源。发明人的实验表明：该三叶青多糖具有显著的解热抗炎作用，可用于制备新型的解热抗炎类中药制剂，在肿瘤、自身免疫、2型糖尿病等疾病防治中都有一定应用价值。
附图说明
图1是本发明三叶青块根多糖的红外光谱图。
图2是葡萄糖标准曲线图。
图3是三叶青块根多糖的梯度洗脱曲线。
图4是三叶青块根多糖解热实验体温变化趋势图。
具体实施方式
下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例：
具有解热抗炎作用的三叶青块根多糖制备：
(1)三叶青块根粗多糖的制备：取三叶青块根35-65℃烘箱干燥，干燥至恒重后粉碎，将粉碎物与双蒸水按照1g：20mL的料液比混合，加热回流提取3次，每次1h。过滤后合并3次提取液，减压蒸馏浓缩，加入3倍体积的95％乙醇，静置过夜后，4200rpm高速离心15min，取沉淀用水溶解，然后再次进行乙醇沉淀，离心得三叶青块根粗多糖。
(2)采用苯酚-硫酸法测定粗多糖含量：
①标准液的配制：D-葡萄糖标准品在105℃条件下干燥至恒重，精密称取100mg，置于100mL容量瓶中，加适量蒸馏水溶解并稀释至刻度，配成标准溶液为1.0mg/mL。临用前，精确吸取标准溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0mL，分别置于10mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，即成系列葡萄糖标准溶液。
②绘制标准曲线：精密移取上述系列标准溶液0.5mL，置于10mL的具塞玻璃试管中，空白对照用蒸馏水0.5mL。每管加入1.0mL 5％苯酚溶液中，混匀后，加3.5mL浓硫酸，迅速混匀，室温放置10min，置40℃水浴中加热反应30min，冰水浴冷却至室温，于490nm处测吸光度。
三叶青块根粗多糖样品测定：取三叶青块根粗多糖样品适量，精密称定，定容至100mL，精密吸取0.5mL，于490nm处测吸光度，由绘制的标准曲线计算样品中多糖含量，并换算为干燥药材中含量(％)，计算此方法的多糖收率。标准曲线的绘制以OD值为纵坐标，以葡萄糖标准品浓度为横坐标，求得线性回归方程为：Y＝5.0095X-0.0024，R2＝0.9992。实验结果表明，葡萄糖在浓度范围为0.00625-0.2mg/mL内与吸光度呈线性关系(见图2)。
(3)三叶青块根多糖纯化及精制：
①采用Sevag法除蛋白：将7.04g三叶青块根粗多糖以最大浓度配成150mL水溶液，加入1/4Sevag试剂(氯仿：甲醇＝4:1)，充分振荡10min，4000rpm，离心20min，收集上清液，继续重复上述操作3次，收集旋蒸得除蛋白后多糖3.8g。
②透析袋脱盐：使用截留分子量为13000Da透析袋进行透析。先用蒸馏水冲洗透析袋至无醇味，加入稀释的去蛋白多糖80mL，加入双蒸水作为渗透液，每隔3h换水1次，48h后，浓缩冻干。
多糖的精制：取透析后的多糖冻干粉适量，用蒸馏水溶解，以5mL/min流速上DEAESepharse Fast Flow阴离子交换柱(2.5*10cm)，先用蒸馏水平衡3个床体积，然后分别用0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、0.8mol/L NaCl溶液进行洗脱。每10mL收集一管，用硫酸-苯酚法测定吸光度，并绘制洗脱曲线(见图3)，合并相同组分。将不同组分分别用截留分子量为9000Da的透析袋透析48h，去除NaCl。透析过的组分真空冷冻干燥得精制后的多糖组分即三叶青块根多糖，该多糖具有如图1所示的红外特征。
三叶青块根多糖解热抗炎作用的药效实验：
1.材料
1.1试验药物
三叶青块根采于浙江杭州富阳三叶青种植基地，经浙江省食品药品检验研究院鉴定为为葡萄科植物三叶崖爬藤。
三叶青块根多糖根据上述制备方法得干燥三叶青块根多糖后，用一定量的蒸馏水溶解得三叶青块根多糖低、中、高三个浓度梯度的溶液。
1.2药品及试剂
干酵母片(广东五洲药业有限公司)；阿司匹林肠溶片(辰欣药业股份有限公司)；卡拉胶(Solarbio)；二甲苯(深圳市东港田化工有限公司)。
1.3动物
昆明种小鼠，体重22-30g，雄性，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，生产许可证号SCXK(沪)2012-0002。
1.2仪器
TC-15恒温电热套(海宁市华星仪器厂)；R-201旋转蒸发仪(上海申顺生物科技有限公司)；AR2130精密电子天平；DK-450B恒温水浴锅(上海森信实验仪器有限公司)YLS-Q4耳肿打耳器(山东省医学科学院设备站)；微样进样器(上海高舒工贸有限公司)；MC-347电子体温计(欧姆龙有限公司)。
2.方法
2.1三叶青块根多糖对干酵母致小鼠发热模型的影响
取雄性小鼠每天测量基础体温，连续3d，将肛温高于38℃的小鼠剔除。将体温合格小鼠按基础体温随机分为正常对照组，模型对照组，阳性对照组(阿司匹林片100mg/kg)，三叶青块根多糖低、高剂量组(75，300mg/kg)，每组10只。实验当天，连续测量两次肛温，取平均值作为正常肛温，空白组背部皮下注射生理盐水，其它各组背部皮下注射20％干酵母悬液15mL/kg造模，造模后9h测量其肛温。待温度上升后，正常组和模型组给予ig蒸馏水10mL/kg，阳性组给予阿司匹林片100mg/kg，三叶青块根多糖低、高剂量组分别给予相应的剂量。给药后隔30min，1h，2h测量各组小鼠肛温。
2.2三叶青块根多糖对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响
昆明雄性小鼠，按体重随机分为模型组，阳性组(阿司匹林片100mg/kg)，三叶青块根多糖低、高剂量组(75，300mg/kg)，每组10只。模型组ig蒸馏水10mL/kg，其余各组根据相应给药量，连续灌胃3天，末次给药30min后，在小鼠右耳廓两面用微量进样器均匀涂抹二甲苯20μL致炎，致炎30min后脱颈椎处死小鼠，将小鼠两耳齐根剪下，用直径8mm的打孔器将小鼠双耳相同部位打孔，分别称重，计算耳肿胀度和肿胀抑制率。
肿胀抑制率(％)＝[1-(给药组两耳片重量差/溶媒对照组两耳片重量差)]×100％
2.3三叶青块根多糖对角叉菜胶致小鼠足跖肿胀实验的影响
昆明雄性小鼠，按体重随机分为模型组，阳性组(阿司匹林片100mg/kg)，三叶青块根多糖低、中、高三个剂量组(75，150，300mg/kg)，每组10只。模型组ig蒸馏水10mL/kg，其余各组按上述剂量连续灌胃5天，末次给药30min后，在每只小鼠右足后跖部皮下注射0.04mL1％的角叉菜胶致炎。用足肿胀仪测定小鼠致炎前及致炎后1、2、4h的足肿胀体积(mL)。并以以下公式计算：小鼠右足肿胀度＝致炎后小鼠足体积(mL)-致炎前小鼠足体积(mL)。
2.4数据处理
所有数据用表示，采用SPSS 19.0统计软件对数据进行单因素方差分析，采用Fisher’s PLSD法对组间进行比较，以P<0.05认为组间具有显著性差异。
3.实验结果：
3.1三叶青块根多糖对干酵母致小鼠发热模型的影响
小鼠皮下注射20％干酵母混悬液9h后体温明显升高，与空白组比较，均有非常显著性差异(P<0.001)。给药30min后，阿司匹林组、三叶青块根多糖低、中、高三个剂量组对干酵母致小鼠发热模型均出现明显解热作用。其中多糖低、高剂量组小鼠体温与模型组统计比较具有显著性差异(P<0.01)。给药1，2h后，三叶青块根多糖低、高剂量组体温持续下降，其中低、高剂量组在给药后1h小鼠体温与模型组比较差异均有显著意义(P<0.01；P<0.001)。给药2h后，三叶青块根多糖低、高剂量组小鼠体温与模型组比较差异仍有显著性意义(P<0.01；P<0.001)(见表1，图4)。
表1：三叶青块根多糖对干酵母致小鼠发热模型的影响(n＝10)
注：与空白组比较，***P<0.001；△P<0.05；△△P<0.01；△△△P<0.001。
3.2三叶青块根多糖对二甲苯致小鼠耳肿胀实验的影响
与模型组比较，三叶青块根多糖低、高剂量组对二甲苯引起的小鼠耳肿胀具有明显的抑制作用，差异具有统计学意义(P<0.05)。且耳肿胀抑制率分别达到了38.8％和54.7％(见表2)。
表2：三叶青块根多糖对二甲苯致小鼠耳肿胀实验的影响(n＝10)
与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
3.3三叶青块根多糖对角叉菜胶致小鼠足跖肿胀实验的影响
与模型组比较，三叶青块根多糖低、中、高剂量组均能抑制角叉菜胶致小鼠的足肿胀度。从小鼠足跖致炎后1h、2h、3h足跖肿胀程度来看，三叶青块根多糖低、中、高剂量组均起到了明显的抑制作用，与模型对照组比较具有统计学差异(P<0.05)(见表3)。
表3：三叶青块根多糖对角叉菜胶致小鼠足跖肿胀实验的影响(n＝10)
与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
根据三叶青块根多糖解热抗炎药效实验结果来看，三叶青块根多糖具有良好的解热抗炎作用，实验结果确切可靠。其可以开发成为新型解热抗炎类中药制剂，并作进一步推广使用。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
Claims (2)
1.一种具有解热抗炎作用的三叶青块根多糖用于制备解热抗炎药物的用途；
所述具有解热抗炎作用的三叶青块根多糖，通过以下方法制备获得：
（1）取三叶青块根35-65℃烘箱干燥，干燥至恒重后粉碎，将粉碎物与双蒸水按照1g：10-30mL的料液比混合，加热回流提取2-5次，过滤，合并滤液，减压浓缩，并采用乙醇沉淀法得到三叶青块根粗多糖；
（2）将三叶青块根粗多糖溶于双蒸水， Sevag法除蛋白，接着脱盐，然后过阴离子交换柱，收集0.1-0.8 mol/L NaCl洗脱峰，最后除去NaCl得三叶青块根多糖；步骤（1）乙醇沉淀法具体为：向浓缩物中加入3倍体积的95%乙醇，静置过夜后，4200 rpm高速离心15min，取沉淀用水溶解，然后再次进行乙醇沉淀，离心得三叶青块根粗多糖；所述阴离子交换柱为DEAESepharse Fast Flow 阴离子交换柱。
2.一种具有解热抗炎作用的药物，其特征在于：由三叶青块根多糖作为有效成分与药学上可接受的辅料制成；
所述具有解热抗炎作用的三叶青块根多糖，通过以下方法制备获得：
（1）取三叶青块根35-65℃烘箱干燥，干燥至恒重后粉碎，将粉碎物与双蒸水按照1g：10-30mL的料液比混合，加热回流提取2-5次，过滤，合并滤液，减压浓缩，并采用乙醇沉淀法得到三叶青块根粗多糖；
（2）将三叶青块根粗多糖溶于双蒸水， Sevag法除蛋白，接着脱盐，然后过阴离子交换柱，收集0.1-0.8 mol/L NaCl洗脱峰，最后除去NaCl得三叶青块根多糖；步骤（1）乙醇沉淀法具体为：向浓缩物中加入3倍体积的95%乙醇，静置过夜后，4200 rpm高速离心15min，取沉淀用水溶解，然后再次进行乙醇沉淀，离心得三叶青块根粗多糖；所述阴离子交换柱为DEAESepharse Fast Flow 阴离子交换柱。
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