CN102836292A

CN102836292A - 五味消毒饮加味提取物对小鼠角叉菜胶炎症的研究方法

Info

Publication number: CN102836292A
Application number: CN 201110164392
Authority: CN
Inventors: 向敏
Original assignee: Suzhou Vocational Health College
Current assignee: Suzhou Vocational Health College
Priority date: 2011-06-20
Filing date: 2011-06-20
Publication date: 2012-12-26

Abstract

本发明公开了五味消毒饮加味提取物对小鼠角叉菜胶炎症的研究方法，以五味消毒饮基础，并加味葛根与丹参两种中药,采用水提醇沉的方法，提取分离五味消毒饮加味粗提取物，采取经典的角叉菜胶诱导小鼠足肿胀模型模型，观察本提取物抗炎症作用效果，并测定其对小鼠血清肿瘤坏死因子-α和白介素-6的影响。本发明的五味消毒饮加味提取物对小鼠角叉菜胶炎症的研究方法，得出五味消毒饮加味提取物对小鼠血清中肿瘤坏死因子-α和白介素-6的水平均有抑制作用，说明其可能是通过抑制炎症细胞因子的分泌来达到抗炎症的效果，为其应用于非细菌性炎症疾病提供实验依据。

Description

五味消毒饮加味提取物对小鼠角叉菜胶炎症的研究方法

技术领域

本发明涉及医学领域，具体涉及五味消毒饮加味提取物对小鼠角叉菜胶炎症的研究方法。

背景技术

始载于《医宗金鉴·外科心法要诀》的五味消毒饮，是治疗疮疡肿毒的著名方剂。由金银花、紫花地丁、紫背天葵、蒲公英、野菊花五味中药组成，具有清热解毒,消散疗疮等功效。大量临床研究已证实该方具有广谱抗菌、抗病毒及增强机体免疫功能的作用,以此方为基础的加减方，己被广泛应用于皮肤科、外科、妇科等火毒湿热所致的多种感染性疾病的治疗，临床效果确切。

然而，目前尚未见国内文献报道有关此方对而对非细菌性炎症的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供了五味消毒饮加味提取物对小鼠角叉菜胶炎症的研究方法，研究五味消毒饮加味提取物对非细菌性炎症作用效果。

本发明的五味消毒饮加味提取物对小鼠角叉菜胶炎症的研究方法，具体步骤如下：

步骤1）准备材料

金银花、紫花地丁、蒲公英、蒲公英、野菊花、葛根、丹参；清洁级KM种小鼠；角叉菜胶、阿司匹林泡腾片、肿瘤坏死因子-α、白介素-6和 ELISA试剂盒；

步骤2）五味消毒饮加味提取物的安全限度试验

以由金银花、紫花地丁、蒲公英、蒲公英、野菊花组成的五味消毒饮为基础，加葛根与丹参两种中药,采用水提醇沉的方法，提取分离出五味消毒饮加味提取物，对五味消毒饮加味提取物的浸膏进行安全限度试验：取若干偶数只清洁级KM种小鼠，雌雄各半，分为相同只数2组，阴性对照组1组，待试药物1组，禁食8小时后，以动物能耐受的最大浓度，最大体积的药量，24h内，分2次灌胃给药，每次0.4 ml/10g体重(折合生药量为450（生药）/kg)，阴性对照用等剂量生理盐水灌胃，连续观察7天，每天固定时刻观察动物的死亡情况；

步骤3）小鼠分组及给药

取若干偶数只清洁级KM种小鼠，雌雄各半，分为相同只数的6组，即生理盐水组、模型对照组、阿司匹林阳性对照组（5g/kg），五味消毒饮加味提取物小剂量组（10g（生药）/kg）、中剂量组（20g（生药）/kg）、大剂量（40g（生药）/kg）3个给药组；每日固定时间按0.2ml/10g体积灌胃给药，每天1次，连续7天；末次给药前标记并测定右后足周长，取两次测量的平均值为准；末次给药30分钟后，于小鼠右后足踝部注射20μL/只0.5%的角叉菜胶致炎，于致炎后30min,90min,120min,180min分别测定足周长，生理盐水组同法注射生理盐水（20μL/只），测定结束后，眼眶取血，滴少量制作血涂片，其余全血于4^oC 5000转/分离心5分钟，分离血清，-20^oC保存以备测定；

步骤4）肿瘤坏死因子-α和白介素-6水平测定

取血清样品，按照肿瘤坏死因子-α和白介素-6试剂盒说明书，用ELISA法测定小鼠血清中肿瘤坏死因子-α和白介素-6的水平；

步骤5）统计学处理

数据均以均数±标准差（

+s）表示,用SPSS 10.0软件进行统计分析,统计方法采用单因素方差分析,组间均数比较采用F检验, P < 0.05表明组间差异有统计学意义。

有益效果：本发明的五味消毒饮加味提取物对小鼠角叉菜胶炎症的研究方法，得出五味消毒饮加味提取物对小鼠血清肿瘤坏死因子-α和白介素-6的水平均有抑制作用，说明其可能是通过抑制炎症细胞因子的分泌来达到抗炎症的效果，为其应用于非细菌性炎症疾病提供实验依据。

具体实施方式

本发明以五味消毒饮基础，并加味葛根与丹参两种中药,采用水提醇沉的方法，提取分离五味消毒饮加味粗提取物，采取经典的角叉菜胶诱导小鼠足肿胀模型模型，观察本提取物抗炎症作用效果，并测定其对小鼠血清中肿瘤坏死因子-α和白介素-6的影响，为其应用于非细菌性炎症疾病提供实验依据。

实施例1

本发明的五味消毒饮加味提取物对小鼠角叉菜胶炎症的研究方法，具体研究实验步骤如下：

步骤1）准备材料

材料:金银花、紫花地丁、蒲公英、蒲公英、野菊花、葛根、丹参均为市售药材，经苏州雷允上制药有限公司执业中药师陈绚鉴定证实。

清洁级KM种小鼠（上海斯莱克实验动物有限公司）,动物许可证号：SCXK(沪)2007-0005，雌雄各半，体重20-25g;

五味消毒饮加味提取物（实验室自制）；

角叉菜胶（Sigma公司，批号：09JK1394）；

阿司匹林泡腾片（德国拜耳公司，规格和批号：H32026201）；

小鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）；

ELISA试剂盒（武汉博士德生物工程公司）。

步骤2）五味消毒饮加味提取物的安全限度试验

以由金银花、紫花地丁、蒲公英、蒲公英、野菊花组成的五味消毒饮为基础，加葛根与丹参两种中药,采用水提醇沉的方法，提取分离出五味消毒饮加味提取物，对五味消毒饮加味提取物的浸膏进行安全限度试验：取清洁级KM种小鼠共40只，雌雄各半，体重20g～25g，分为2组，每组20只，阴性对照组1组，待试药物1组，禁食8小时后，以动物能耐受的最大浓度，最大体积的药量，24h内，分2次灌胃给药，每次0.4 ml/10g体重(折合生药量为450（生药）/kg,)，阴性对照用等剂量生理盐水灌胃，连续观察7天，每天固定时刻观察动物的死亡情况。

步骤3）小鼠分组及给药

取KM种小鼠60只，雌雄各半，分为6组，即生理盐水组（NS组）、模型对照组、阿司匹林阳性对照组（5g/kg），五味消毒饮加味提取物小剂量组（10g（生药）/kg）、中剂量组（20g（生药）/kg）和大剂量（40g（生药）/kg）等3个给药组，每组10只。每日固定时间按0.2ml/10g体积灌胃给药，每天1次，连续7天。末次给药前标记并测定右后足周长，取两次测量的平均值为准。末次给药30分钟后，于小鼠右后足踝部注射20μL/只0.5%的角叉菜胶致炎，于致炎后30min,90min,120min,180min分别测定足周长。生理盐水组同法注射生理盐水（20μL/只）。测定结束后，眼眶取血，滴少量制作血涂片，其余全血于4^oC 5000转/分离心5分钟，分离血清，-20^oC保存以备测定。

步骤4） TNF-α和IL-6的水平测定

取血清样品，按照TNF-α和IL-6试剂盒说明书，用ELISA法测定小鼠血清中TNF-α和IL-6的水平。

步骤5）统计学处理

数据均以均数±标准差（

研究结果

1.五味消毒饮加味提取物的安全限度试验

由于受试药物的浓度或体积限制，一次给药无法测出LD₅₀，因此，进行了最大耐受量的测定，以提取物浸膏，按小鼠最大体积的药量灌胃给药，结果显示，给药剂量为450g（生药）/kg时，小鼠无死亡发生。已知五味消毒饮临床常用剂量为2~3g（生药）/kg，小鼠的最大耐受倍数相当于人体的150~225倍，说明本提取物的毒性比较低。

2.五味消毒饮加味提取物的对角叉菜胶致小鼠足肿胀的影响

由表1可知，角叉菜胶诱导小鼠足肿胀在120min之内，足周长随着时间变化而逐渐上升，2h后，开始下降；五味消毒饮加味提取物各剂量组可以抑制小鼠肿胀发生，且呈一定剂量依赖性关系。大剂量组（40g(生药)/kg）的抑制作用尤其明显（P<0.01或0.05 vs NS 对照组），中剂量组次之。阿司匹林阳性对照组抗足肿胀效果也较为明显（P<0.01或0.05 vs NS 对照组）。

表1. 五味消毒饮加味提取物对角叉菜胶致小鼠足肿胀的影响(n=10,

+s)

注：与NS对照组对照组比较，##P<0.01,#P<0.05。

3.五味消毒饮加味提取物对TNF-α的影响

TNF-α是机体重要的炎症指标之一，是免疫宿主反应的快速反应因子。小鼠注射了角叉菜胶后，模型组小鼠血清中TNF-α水平明显升高（P<0.01 vs模型组），说明小鼠体内产生了严重的炎症应激反应。五味消毒饮加味提取物大剂量组明显抑制小鼠血清TNF-α水平（P<0.01 vs 模型组），提示其有较强的抗炎作用。阿斯匹林也可抑制TNF-α分泌（P<0.01 vs 模型组），但其作用强度没有提取物大剂量用药组强。

表2. 五味消毒饮加味提取物对小鼠血清TNF-α的影响(n=10,

+s)

组别	用药剂量	动物数	TNF-α（pg/mL)	P值
					NS对照组		10	12.22+5.38
模型对照组		10	46.08+8.43	<0.01vs NS组
					阿司匹林组	5g/kg	10	35.23+4.70	<0.01vs模型组
提取物大剂量组	40g(生药）/kg	10	30.31+3.10	<0.01vs模型组
					提取物中剂量组	20g(生药）/kg	10	37.43+3.99	<0.05vs模型组
提取物小剂量组	10g(生药/kg)	10	40.07+8.30

4.五味消毒饮加味提取物对IL-6的影响

IL-6又称前炎症因子，在机体应激反应、免疫反应和造血反应等过程中均起重要作用。结果显示，小鼠注射了角叉菜胶后，模型组小鼠血清中IL-6水平较NS对照小鼠水平升高近3倍多，提示IL-6参与了小鼠炎症反应的过程。五味消毒饮加味提取物各剂量组能抑制小鼠血清IL-6水平，且呈一定剂量依赖性关系，与小鼠足肿胀实验结果一致。阿斯匹林阳性对照抑制IL-6分泌效果最明显（P<0.01 vs 模型组）。

表3. 五味消毒饮加味提取物对IL-6的影响(n=10,

+s)

组别	用药剂量	动物数	IL-6(pg/mL)	P值
					NS对照组		10	78.76+19.10
模型对照组		10	249.36+46.65	<0.01 vs NS组
					阿司匹林组	5g/kg	10	172.75+56.8	<0.01 vs模型组
提取物大剂量组	40g(生药）/kg	10	173.75+90.53	<0.01 vs模型组
					提取物中剂量组	20g(生药）/kg	10	185.00+37.14	<0.05 vs模型组
提取物小剂量组	10g(生药/kg)	10	224.75+40.93	<0.05 vs模型组

结论

结果显示：五味消毒饮加味提取物各剂量组可以抑制小鼠肿胀发生，且呈一定剂量依赖性关系。大剂量组（40g(生药)/kg）的抑制作用尤其明显（P<0.01或0.05 vs NS 对照组），中剂量组（20g(生药)/kg次之，说明本方除现有技术研究出的可直接抑菌外，还具有抗非细菌性炎症反应的作用。

研究已证实，牙龈炎、肿瘤、心脑血管疾病等疾病的发病中，均伴随炎症反应的过程。TNGF-α和IL-6是两种重要的炎症介质细胞因子。IL-6又称前炎症因子,分子质量为21～26 kD，由184 个氨基酸残基组成的糖蛋白，可由成纤维细胞、上皮细胞、单核巨噬细胞、成骨细胞、血管内皮细胞、免疫活性细胞等细胞合成分泌，在机体应急反应、免疫反应和造血反应等过程中均起重要作用。与IL-6受体结合后通过糖蛋白130激活络氨酸蛋白激酶从而活化丝氨酸/苏氨酸激酶,促进相关基因的活化而产生效应。还可促进T淋巴细胞增殖、分化、生成和释放细胞因子; 促进B 淋巴细胞增殖、分化、产生抗体,参与炎症的过程。机体内各种免疫细胞和非免疫细胞均可合成TNF-α，其前体是以跨膜蛋白的形式存在，其生理功能最早被认为有抗肿瘤活性，其对免疫反应、机体代谢、炎症反应等均具有重要的调节和介导作用。本研究法发现，五味消毒饮加味提取物大剂量组（40g(生药)/kg）对小鼠血清IL-6和TNF-α水平均有抑制作用，说明其可能是通过抑制炎症细胞因子的分泌来达到抗炎症的效果。

本研究方法以五味消毒饮基础方，适当调整其组方，并加味葛根与丹参两种中药材。本方以传统清热解毒的中药为主，方中以金银花为君药，清热解毒，散痈消肿。黄芩泻火燥湿，清上焦头面实热；丹参活血祛瘀，化瘀生新，凉血消痈。两者共为臣药。紫花地丁、蒲公英、野菊花共为佐药，清热解毒，凉血散结。葛根为阳明经引药，轻扬升发，解肌退热，生津止渴，引方中诸药直达病灶牙龈所在。七味相伍，共奏清热解毒，凉血消痈之功。

上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims

1. 五味消毒饮加味提取物对小鼠角叉菜胶炎症的研究方法，其特征在于，具体步骤为：

步骤1）准备材料

步骤2）五味消毒饮加味提取物的安全限度试验

步骤3）小鼠分组及给药

步骤4）肿瘤坏死因子-α和白介素-6水平测定

步骤5）统计学处理

数据均以均数±标准差（

2.根据权利要求1所述的五味消毒饮加味提取物对小鼠角叉菜胶炎症的研究方法，其特征在于，所述步骤1）中清洁级KM种小鼠的体重在20-25g之间。

3.根据权利要求1所述的五味消毒饮加味提取物对小鼠角叉菜胶炎症的研究方法，其特征在于，所述步骤2）中，所取的清洁级KM种小鼠为40只。

4. 根据权利要求1所述的五味消毒饮加味提取物对小鼠角叉菜胶炎症的研究方法，其特征在于，所述步骤3）中，所取的清洁级KM种小鼠为60只。