CN109762075B - 一种雪菊糖聚合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种糖聚合物的制备方法，包括以下步骤：1)选材；2)水提；3)分级醇沉；4)碱提；5)纯化；6)离子交换柱层析；7)分子筛凝胶柱层析。本发明还提供了该制备方法得到的雪菊糖聚合物及其应用。本发明利用离子交换层析和分子筛凝胶柱层析方法纯化雪菊糖聚合物，制备出之前未报道过的雪菊精糖聚合物，并且对这些精糖聚合物的理化性质、分子量、单糖组成等进行了系统的分析确认，成功得出了这些精糖聚合物的特征结构，还提供了雪菊糖聚合物在防治神经退行性疾病及其并发症和糖尿病及其并发症方面的活性研究。

Description

一种雪菊糖聚合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药、保健品及食品技术领域，涉及一种植物中糖聚合物的制备方法，特别是涉及一种雪菊粗糖聚合物、精糖聚合物的制备方法，还涉及雪菊糖聚合物在防治神经退行性疾病及其并发症和糖尿病及其并发症中的应用。

背景技术

神经退行性疾病(Neurodegenerative disease)是一种大脑和脊髓的细胞神经元丧失的疾病状态，随着时间的推移而恶化，从而导致功能障碍。阿尔茨海默病(Alzheimerdisease，AD)是一种最常见的神经退行性疾病，起病隐袭，病程呈慢性进行性，主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状，严重影响社交、职业与生活功能。大量研究证实，在阿尔茨海默病的核心病理机制中，神经炎症是神经元变性丢失的重要原因，而小胶质细胞过度活化被认为是神经炎症的重要特征。小胶质细胞的过度活化可产生和分泌大量的神经毒性因子包括趋化因子和促炎性因子，导致了脑部组织损伤，因此抑制小胶质细胞异常激活所介导的神经炎症是阿尔茨海默病治疗的重要策略。目前，治疗阿尔兹海默病的药物往往会引发明显的机体副作用，因此，从天然药物中获得的低毒副作用的糖聚物日益受到人们的关注。

糖尿病是一种由于胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用障碍所致的以高血糖为特征的代谢性疾病。持续高血糖与长期代谢紊乱等可导致全身组织器官，特别是眼、肾、心血管及神经系统的损害及其功能障碍和衰竭。严重者可引起失水，电解质紊乱和酸碱平衡失调等急性并发症酮症酸中毒和高渗昏迷。随着社会经济的发展、人们生活方式的改变(能量摄入增加和运动减少等)及人口老龄化，2型糖尿病发病率在全球范围内呈逐年增高趋势，尤其在发展中国家增加速度将更快(预计到2025年可能增加170％)，呈现流行势态。抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶可以抑制淀粉类降解为寡糖以及寡糖降解为单糖的速率，从而有效控制血糖，尤其是餐后血糖，达到防治糖尿病的目的。目前临床使用的主要降血糖药包括磺脲类，双胍类和噻唑烷二酮等，效果显著但副作用也大，而糖聚物作为毒副作用低的天然药物，在降血糖方面具有良好的活性，被越来越多的学者所关注和研究开发。

雪菊(Coreopsis tinctoria Nutt.)，学名两色金鸡菊，属于菊科金鸡菊属植物，原产于北美、非洲等地，后引入我国，主要分部在新疆和田地区昆仑山雪域。它具有清热解毒、活血化瘀、降血脂和降血糖等功效，还可用以辅助治疗心慌、胃肠不适、痢疾等疾病。现代研究表明，雪菊内含有黄酮类、糖聚物类、氨基酸类、挥发油类等成分，其各种成分具有多种药理活性，如降血糖、抗衰老、降血脂以及抗肿瘤等。目前，国内外对雪菊糖聚合物在防治神经退行性疾病及其并发症和糖尿病及其并发症方面的研究尚未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种雪菊糖聚合物的制备方法。

本发明的另一要解决的技术问题是提供该制备方法得到的雪菊糖聚合物。

本发明的再一要解决的技术问题是提供上述雪菊糖聚合物在防治神经退行性疾病和糖尿病中的应用。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种雪菊糖聚合物的制备方法，包括以下步骤：

1)选材：选取干燥的雪菊的头状花序，用水浸泡6～12h；

2)水提：将步骤1)浸泡好的雪菊的头状花序进行水提，分别收集得到提取液和残渣；

3)分级醇沉：将步骤2)得到的提取液浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇的体积浓度为A％，静置后离心分离得到上清液一和沉淀一，收集沉淀即得粗糖聚合物CT1；将上清液一再次浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇的体积浓度为B％，静置后离心分离得到上清液二和沉淀二，收集沉淀二即得粗糖聚合物CT2；将上清液二再次浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇的体积浓度为C％，静置后离心分离得到沉淀三，收集沉淀三即得粗糖聚合物CT3，其中10≤A＜B＜C＜100；

4)碱提：将步骤2)得到的残渣浸泡于0.1～1M浓度的NaOH溶液中，静置1～4h得到上清液三，将上清液三用0.1～1M浓度的HCl溶液中和至pH值为6～8，离心分离后得到上清液四，将上清液四浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇的体积浓度为30～90％，静置后离心分离得到沉淀四，收集沉淀四即得粗糖聚合物CTB；

5)纯化：对上述粗糖聚合物CT1、CT2、CT3、CTB进行纯化，即得纯化粗糖聚合物CT1、CT2、CT3、CTB；

6)离子交换柱层析：将步骤5)得到的纯化粗糖聚合物CT1、CT2、CT3、CTB进行离子交换柱层析，用0～2M浓度的NaCl溶液进行梯度洗脱，使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收集糖部分，然后浓缩、冷冻干燥，再分别用水进行溶解，离心分离后得到上清液；

7)分子筛凝胶柱层析：将步骤6)所得的上清液进行分子筛凝胶柱层析，用水进行洗脱，使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线收集糖部分，浓缩、冷冻干燥后获得雪菊糖聚合物CTB-1、CT1-2、CT2-1、CT2-1A、CT2-1B、CT2-2。

进一步地，所述步骤1)中，雪菊的头状花序为雪菊的茎、枝顶端的头状花序。

进一步地，所述步骤2)中，水提的具体操作为：用5～15倍体积的60～100℃的热水对雪菊的头状花序提取1～4h。

进一步地，所述步骤3)、步骤4)、步骤6)、步骤7)中的浓缩为40～70℃减压浓缩，所述步骤3)、步骤4)中的醇沉后静置的时间为10～28h，10≤A＜60，60≤B＜80，80≤C＜100。

进一步地，所述步骤4)中，NaOH溶液的体积为残渣体积的5～20倍。

进一步地，所述步骤5)中，纯化的具体操作为：利用Sevag法分别对粗糖聚合物CT1、CT2、CT3、CTB进行除蛋白，除蛋白后再经透析袋进行透析、冻干，透析袋的截留分子量为100Da。

进一步地，所述步骤6)中，离子交换柱为离子交换纤维素或离子交换凝胶。

进一步地，所述步骤7)中，分子筛凝胶层析选用Sephadex G或Sephacryl S系列分子筛色谱柱。

进一步地，上述雪菊糖聚合物的制备方法得到的雪菊糖聚合物中：

雪菊糖聚合物CTB-1是由半乳糖和阿拉伯糖组成的糖，其结构为：

其中，a、b、c、d的范围为1～1000；

雪菊糖聚合物CT1-2是由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖和鼠李糖组成的糖，其结构为：

其中，a、b的范围为1～1000；

雪菊糖聚合物CT2-1是由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖和果糖组成的糖，其结构为：

其中，a、b、c的范围为1～1000；

雪菊糖聚合物CT2-1A是由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖组成的糖，其结构为：

其中，a、b的范围为1～1000；

雪菊糖聚合物CT2-1B是由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖组成的糖，其结构为：

其中，a、b的范围为1～1000；

雪菊糖聚合物CT2-2是由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖组成的糖，其结构为：

其中，x的范围为1～1000。

进一步地，上述制备方法得到的CTB、CTB-1、CT1、CT2、CT1-2、CT2-1、CT2-1A、CT2-1B、CT2-2在制备防治神经退行性疾病及其并发症和糖尿病及其并发症方面的药物或保健品或功能食品中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明利用离子交换层析和分子筛凝胶柱层析方法纯化雪菊糖聚合物，制备出之前未报道过的雪菊精糖聚合物，并且对这些精糖聚合物的理化性质、分子量、单糖组成等进行系统的分析确认，成功得出这些精糖聚合物的特征结构；本发明提供了雪菊中粗糖聚合物、精糖聚合物的制备方法及雪菊糖聚合物在防治神经退行性疾病及其并发症和糖尿病及其并发症方面的活性研究，为雪菊糖聚合物在医药、保健品和功能食品等领域的应用提供依据。

2.与传统水煮法提取糖聚合物相比，本发明采用水提醇沉法和碱提法的结合，乙醇浓度由低到高进行分级醇沉，对雪菊糖聚合物进行初步分离，同时高浓度乙醇能将极性大、水溶性好的糖聚合物与极性小、水溶性差的糖聚合物分离，使所提取的糖聚合物组合物含有更多种类的糖聚合物成分，且操作简单方便，可以大规模生产。

3.本发明通过柱层析法对雪菊粗糖聚合物进行分离纯化，效果显著，制备出多个雪菊糖聚合物纯品。

4.本发明对制备出的6种雪菊糖聚合物的多糖结构进行了鉴定，明确了这些聚合物的理化性质及结构，为探究其药理活性机制提供结构依据。

5.本发明提供了雪菊中具有防治神经退行性疾病及其并发症和糖尿病及其并发症方面的活性成分的制备方法，并且筛选出了含量高、活性强的糖聚合物部位。

附图说明

图1：CTB-1的红外图谱；

图2：CTB-1的¹H NMR图谱；

图3：CTB-1的¹³C NMR图谱；

图4：CTB-1的HSQC图谱；

图5：CTB-1的HMBC图谱；

图6；CTB-1的¹H-¹HCOSY图谱；

图7：CTB-1抗神经炎活性测试结果。其中，图A表示CTB-1对BV2细胞活力的影响；图B、C、D分别表示CTB-1对LPS诱导的BV2细胞中NO、TNF-α和IL-6产量的影响。结果以mean±SEM表示，^###P<0.001是相对于对照组而言，***P<0.001、**P<0.01、*P<0.05是相对于LPS组而言，ns表示阳性药组与20mM的CTB-1组无显著差异。

图8：CTB、CTB-1的降糖活性测试结果。其中，图A、B分别表示粗糖聚合物CTB、精糖聚合物CTB-1对α-淀粉酶的抑制作用；图C、D分别表示粗糖聚合物CTB、精糖聚合物CTB-1对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。

图9：CT2、CT2-1、CT2-1A、CT2-1B、CT2-2对BV2细胞的抗神经炎活性测试结果。其中，图A表示CT2、CT2-1、CT2-1A、CT2-1B、CT2-2对BV2细胞活力的影响；图B、C分别表示CT2和CT2-1、CT2-1A、CT2-1B、CT2-2对LPS诱导的BV2细胞中NO产量的影响。

图10：CT2、CT2-1对RAW264.7细胞的抗神经炎活性测试结果。其中，图A表示CT2、CT2-1对RAW264.7细胞活力的影响；图B、C分别表示CT2、CT2-1对LPS诱导的RAW264.7细胞中NO产量的影响。

图11：CT1、CT2、CT1-2、CT2-1、CT2-1A、CT2-1B、CT2-2的降糖活性测试结果。其中，图A、B分别表示粗糖聚合物CT1、CT2以及精糖聚合物CT1-2、CT2-1、CT2-1A、CT2-1B、CT2-2对α-淀粉酶的抑制作用；图C、D分别表示粗糖聚合物CT1、CT2以及精糖聚合物CT1-2、CT2-1、CT2-1A、CT2-1B、CT2-2对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。

具体实施方式

下面将结合具体实施例来详细说明本发明，在此本发明的示意性实施例及其说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

实施例1

按以下步骤制备糖聚合物：

1)选材：将20kg干燥雪菊的茎、枝顶端的头状花序用水浸泡6h；

2)水提：将步骤1)浸泡好的头状花序用10倍体积的热水(100℃)提取2h，收集提取液和残渣，残渣晾干；

3)分级醇沉：将步骤2)得到的提取液于60℃减压浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇体积浓度为50％，室温静置24h后离心分离得到上清液一和沉淀一，收集沉淀一即为粗糖聚合物CT1；将上清液一于60℃减压浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇体积浓度为70％，室温静置24h后离心分离得到上清液二和沉淀二，收集沉淀即为粗糖聚合物CT2；将上清液二于60℃减压浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇的体积浓度为90％，静置后离心分离得到沉淀三，收集沉淀三即得粗糖聚合物CT3；

4)碱提：将步骤2)得到的残渣浸泡于15倍体积的0.3M浓度的NaOH溶液中，室温静置2h得到上清液三，将上清液三用0.5M浓度的HCl中和至pH值为6～8，离心分离(5000r/min，10min)后得到上清液四，将上清液四60℃减压浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇体积浓度为75％，静置24h后离心分离得到沉淀四，收集沉淀即为粗糖聚合物CTB；

5)纯化：利用Sevag法分别对粗糖聚合物CT1、CT2、CT3、CTB进行除蛋白，除蛋白后粗糖聚合物用透析袋(截留分子量为100Da)进行透析、冻干，即得纯化粗糖聚合物；

6)离子交换柱层析：取180mg纯化粗糖聚合物CTB，溶于9mL的去离子水中，上样于DEAE-Cellulose 52柱，在不同盐浓度的洗脱液条件下出现2个峰，其中峰一为0.05M浓度NaCl洗脱部分，峰二为0.1M浓度的NaCl洗脱部分(洗脱过程中使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收集糖部分)，将峰一所得洗脱液浓缩、冷冻干燥得到一种糖聚合物(峰一糖聚合物)；

7)分子筛凝胶层析：将步骤6)得到的峰一糖聚合物用水进行溶解，离心分离后得到上清液，上Sephadex G75柱，用水进行洗脱，采用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，出现一个单一对称峰，收集主峰，浓缩，冷冻干燥后得雪菊糖聚合物CTB-1。

纯度检测：将雪菊糖聚合物CTB-1配成2％浓度(W/V)的水溶液，HPGPC法测得保留时间，并对CTB-1进行梯度醇沉，收集各沉淀测比旋光度。

经离子交换和凝胶过滤法分离纯化后得到的组分CTB-1呈单一峰，说明CTB-1为均一糖聚合物。

实施例2

按以下步骤制备雪菊糖聚合物：

1)选材：将20kg干燥雪菊的茎、枝顶端的头状花序用水浸泡12h；

2)水提：将步骤1)浸泡好的头状花序用5倍体积的热水(80℃)提取4h，收集提取液和残渣，残渣晾干。

3)分级醇沉：将步骤2)得到的提取液于40℃减压浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇体积浓度为59％，室温静置10h后离心分离得到上清液一和沉淀一，收集沉淀一即为粗糖聚合物CT1；将上清液一于40℃减压浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇体积浓度为79％，室温静置10h后离心分离得到上清液二和沉淀二，收集沉淀即为粗糖聚合物CT2；将上清液二于40℃减压浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇的体积浓度为99％，静置后离心分离得到沉淀三，收集沉淀三即得粗糖聚合物CT3。

4)纯化：利用Sevag法分别对粗糖聚合物CT1、CT2、CT3进行除蛋白，除蛋白后粗糖聚合物用透析袋(截留分子量为100Da)进行透析、冻干，即得纯化粗糖聚合物；

5)离子交换柱层析：取180mg纯化粗糖聚合物CT1，溶于9mL的去离子水中，上样于DEAE-Cellulose 52柱，用0.05M浓度NaCl进行梯度洗脱，洗脱过程中使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线收集糖部分，将洗脱液浓缩、冷冻干燥，用水进行溶解，离心分离后得到上清液；

6)分子筛凝胶层析：将步骤5)得到的上清液上Sephadex S-100柱，用水进行洗脱，采用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线收集糖部分，浓缩，冷冻干燥后得雪菊糖聚合物CT1-2。

实施例3

按以下步骤制备雪菊糖聚合物：

1)选材：将20kg干燥雪菊的头状花序用水浸泡9h；

2)水提：将步骤1)浸泡好的头状花序用15倍体积的热水(60℃)提取4h，收集提取液和残渣，残渣晾干。

3)分级醇沉：将步骤2)得到的提取液于70℃减压浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇体积浓度为10％，室温静置28h后离心分离得到上清液一和沉淀一，收集沉淀一即为粗糖聚合物CT1；将上清液一于70℃减压浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇体积浓度为60％，室温静置28h后离心分离得到上清液二和沉淀二，收集沉淀即为粗糖聚合物CT2；将上清液二于70℃减压浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇的体积浓度为80％，静置后离心分离得到沉淀三，收集沉淀三即得粗糖聚合物CT3。

4)纯化：利用Sevag法分别对粗糖聚合物CT1、CT2、CT3、CTB进行除蛋白，除蛋白后粗糖聚合物用透析袋(截留分子量为100Da)进行透析、冻干，即得纯化粗糖聚合物；

5)离子交换柱层析：取180mg纯化粗糖聚合物CT2，溶于9mL的去离子水中，上样于DEAE-Cellulose 52柱，分别用蒸馏水和0.05M浓度NaCl进行梯度洗脱，洗脱过程中使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线收集糖部分，将洗脱液浓缩、冷冻干燥，用水进行溶解，离心分离后得到上清液；

6)分子筛凝胶层析：将步骤5)得到的上清液上Sephadex S系列柱，用水进行洗脱，采用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线收集糖部分，浓缩，冷冻干燥后得雪菊糖聚合物CT2-1、CT2-1A、CT2-1B、CT2-2。

下面以实施例1提取的CTB-1作进一步的结构分析：

(1)单糖组成分析：

由完全酸水解产物采用PMP-柱前衍生高效液相色谱法测得图谱可知，CTB-1单糖组成为半乳糖和阿拉伯糖。

(2)红外光谱检测

CTB-1的红外光谱(如图1所示)检测结果显示，CTB-1含有糖的特征吸收峰为：3399cm^-1为糖中O-H伸缩振动的特征吸收峰，2925cm^-1和1412cm^-1为糖中C-H伸缩振动的特征吸收峰。1075cm^-1的特征吸收峰是由于糖环上醚键的不对称伸缩振动产生。776cm^-1为吡喃糖的非对称伸缩振动和对称伸缩振动。

(3)甲基化分析

样品经甲基化，水解、还原，乙酰化后GC-MS分析，结果表明CTB-1含有L-Araf-(1→、→5)-L-Araf-(1→、D-Galp-(1→、→6)-D-Galp-(1→和→3,6)-D-Galp-(1→糖残基。

(4)糖聚合物的核磁共振分析

将CTB-1样品置于核磁管中，用D₂O溶解后测谱，所得结果如图2～6所示。

根据上述图2～6的核磁图谱可知各个碳和氢的归属，如下表1所示。

表1CTB-1核磁共振分析结果

经上述完全酸水解、甲基化分析、红外光谱检测及核磁分析，结果显示CTB-1是一种由半乳糖和阿拉伯糖组成的糖聚物，从甲基化分析说明其含有α-L-Araf-(1→、→5)-α-L-Araf-(1→、β-D-Galp-(1→、→6)-β-D-Galp-(1→和→3,6)-β-D-Galp-(1→糖残基，不同糖残基之间的连接顺序由二维核磁HMBC谱图分析得出，由以上分析得出CTB-1的结构为:

其中，a、b、c、d的范围为1～1000。

同理，对CT1-2、CT2-1、CT2-1A、CT2-1B、CT2-2的结构进行上述同样的分析：完全酸水解、甲基化分析、红外光谱检测及核磁分析，获得以下信息：

糖聚合物CT1-2：单糖组成分析CT1-2由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖和鼠李糖组成。甲基化分析显示是由α-D-Glcp-(1→、→6)-α-D-Glcp-(1→、α-L-Araf-(1→、→2)-α-L-Araf-(1→、→3)-α-L-Rhap-(1→、→6)-β-D-Galp(1→和→3,6)-β-D-Manp-(1→糖残基组成，不同糖残基之间的连接顺序由二维核磁HMBC谱图分析得出，由以上分析得出CT1-2的结构为：

其中，a、b的范围为1～1000。

雪菊糖聚合物CT2-1：该糖聚合物由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖和果糖组成。甲基化分析显示是由α-D-Glcp-(1→、→4)-α-D-Glcp-(1→、→5)-α-L-Araf-(1→、→6)-2-OAc-β-D-Galp(1→、→3)-α-L-Rhap-(1→、→3,6)-β-D-Manp-(1→、→6)-β-D-Manp-(1→、→1,6)-β-D-Fruf-(2→、α-L-Araf-(1→和→3)-β-D-Manp-(1→糖残基组成，不同糖残基之间的连接顺序由二维核磁HMBC谱图分析得出，由以上分析得出CT2-1的结构为：

其中，a、b、c的范围为1～1000。

糖聚合物CT2-1A：单糖组成分析CT2-1A由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖组成。甲基化分析显示是由α-D-Glcp-(1→、→2)-α-L-Araf-(1→、→6)-β-D-Galp(1→、→3,6)-β-D-Manp-(1→和→6)-α-D-Glcp-(1→糖残基组成，不同糖残基之间的连接顺序由二维核磁HMBC谱图分析得出，由以上分析得出CT2-1A的结构为：

其中，a、b的范围为1～1000。

糖聚合物CT2-1B：单糖组成分析CT2-1B由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖组成。甲基化分析显示是由α-D-Glcp-(1→、→2,3,6)-α-D-Glcp-(1→、→3,6)-β-D-Manp-(1→、→6)-β-D-Galp(1→、→2)-α-L-Araf-(1→和α-L-Araf-(1→糖残基组成，不同糖残基之间的连接顺序由二维核磁HMBC谱图分析得出，由以上分析得出CT2-1B的结构为：

其中，a、b的范围为1～1000。

糖聚合物CT2-2：单糖组成分析CT2-2由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖组成。甲基化分析显示是由α-D-Glcp-(1→、→4)-α-D-Glcp-(1→、→3,6)-β-D-Manp-(1→、→6)-β-D-Galp(1→和α-L-Araf-(1→糖残基组成，不同糖残基之间的连接顺序由二维核磁HMBC谱图分析得出，由以上分析得出CT2-2的结构为：

其中，x的范围为1～1000。

以上均一糖聚物可能是雪菊糖聚合物抗神经炎症以预防和治疗神经退行性疾病，和/或抗糖尿病的活性成分，因而，均一糖聚合物的结构鉴定将为后续探究雪菊糖聚合物预防和治疗神经退行性疾病和/或糖尿病的机制提供有力依据。

实施例4：雪菊糖聚合物CTB，CTB-1的抗神经炎活性及降糖活性研究：

1实验方法

1.1细胞活力测试：

BV2细胞为小鼠小胶质细胞，购于中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。将状态良好且处于对数生长期的BV2细胞以4×10⁴/mL的密度接种于96孔板(100μL/孔)，在37℃下培养24h。给药组每孔加入100μL溶液，其中含不同浓度的CTB-1(2.5、5、10、20μM)和LPS(1μg/mL)，在37℃下孵育24h。在阳性药组，每孔加入100μL溶液，其中所含米诺环素为25μM，LPS浓度为1μg/mL。在对照组和模型组，分别加入100μL的空白培养基和1μg/mL的LPS。再于每孔加20μL的MTT(5mg/mL)，培养4h,每孔加入150μL的DMSO，充分震荡摇匀，10min后，以490nm为检测波长测定每个孔的OD值，每个浓度设置4个复孔，以加药组，阳性药组和模型组的OD值为A₁，对照组OD值为A₀，细胞存活率计算公式如下：

细胞存活率(％)＝A₁/A₀×100％

1.2CTB-1对BV2细胞中NO,TNF-α和IL-6产量的影响：

1.2.1CTB-1对LPS诱导的BV2细胞中NO产量的抑制作用是由Griess法来评估的。将状态良好且处于对数生长期的BV2细胞以4×10⁴/mL的密度接种于96孔板(100μL/孔)，在37℃下培养24h。给药组每孔加入100μL溶液，其中含不同浓度的CTB-1(2.5、5、10、20μM)和LPS(1μg/mL)，在37℃下孵育24h。在阳性药组，每孔加入100μL溶液，其中所含米诺环素为25μM，LPS浓度为1μg/mL。在对照组和模型组，分别加入100μL的空白培养基和1μg/mL的LPS。随后，移取50μL的细胞上清液至新孔并加入等体积的一氧化氮试剂盒Ⅰ液和Ⅱ液加入其中，震荡摇匀，以酶标仪540nm波长下测吸光度，每个浓度设置4个复孔，以亚硝酸钠标准溶液参照。

1.2.2在CTB-1对LPS诱导的BV2细胞中TNF-α和IL-6产量的影响方面，将状态良好且处于对数生长期的BV2细胞以1×10⁶/mL的密度接种于96孔板(100μL/孔)，在37℃下培养24h。给药组每孔加入100μL溶液，其中含不同浓度的CTB-1(5、10、20μM)和LPS(1μg/mL)。在对照组和模型组，分别加入100μL的空白培养基和1μg/mL的LPS。之后各组在37℃下孵育24h，随后移取50μL的细胞上清液至新孔，TNF-α和IL-6水平用ELISA试剂盒按照使用说明检测，以酶标仪450nm波长下测吸光度，每个浓度设置4个复孔。

1.3CTB、CTB-1对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用

1.3.1以PH值为6.8的0.1M的磷酸缓冲液为溶剂，将25μL的样品溶液和25μL的α-淀粉酶(0.2mg/mL)混合，在37℃下于96孔板中孵育10分钟，之后加入25μL的淀粉溶液继续在37℃下孵育10分钟，随后加入125μL的DNS试剂，并于沸水中加热5分钟。最后在酶标仪中，540nm下测试吸光度。以阿卡波糖为阳性对照，α-淀粉酶的抑制作用按以下公式计算：

抑制率(％)＝[1-(A₁–A₂)/A₃]×100％

其中A₁代表样品溶液的吸光度，A₂指反应体系中α-淀粉酶被等体积的缓冲液替代后的吸光度，A₃指反应体系中样品溶液被等体积的缓冲液替代后的吸光度。

1.3.2以PH值为6.8的0.1M的磷酸缓冲液为溶剂，将40μL的样品溶液和20μL的α-葡萄糖苷酶(0.2UmL^-1)混合，在37℃下于96孔板中孵育5分钟，之后加入50μL 10mM pNPG溶液继续在37℃下孵育30分钟，随后加入90μL的碳酸钠溶液以终止反应。最后在酶标仪中，405nm下测试吸光度。以阿卡波糖为阳性对照，α-淀粉酶的抑制作用按以下公式计算：

抑制率(％)＝[1-(A_sample–A_background)/A_blank]×100％

其中A_sample代表样品溶液的吸光度，A_background指反应体系中α-葡萄糖苷酶被等体积的缓冲液替代后的吸光度，A_blank指反应体系中样品溶液被等体积的缓冲液替代后的吸光度。

2实验结果

2.1CTB-1抗神经炎活性测试的结果：

如图7A所示，MTT法显示LPS对BV2细胞的活力没有显著影响，进一步地，结果显示25μM的米诺环素和不同浓度的CTB-1对LPS诱导的BV2细胞的活力均没有显著影响。如图7B所示，LPS刺激导致BV2细胞的NO产量的显著增加。25μM的米诺环素显著地抑制NO的产量。当LPS刺激后的BV2细胞加入2.5、5、10、20μM的CTB-1后，NO产量以剂量依赖的方式显著下降。同时，20μM的CTB-1和阳性药组的NO产量没有显著性差异，可见二者对LPS诱导的BV2细胞中NO产量的抑制作用相当，即二者的抗神经炎作用相当。

如图7C、D所示，当BV2细胞仅加入LPS，TNF-α和IL-6的生成量显著增加。在LPS诱导的BV2细胞中，当加入5、10、20μM的CTB-1后，TNF-α的产量显著或极显著地下降。另外，当加入5～20μM的CTB-1后，IL-6的产量以剂量依赖方式显著下降。综合来说，10～20μM的CTB-1可显著抑制LPS诱导的BV2细胞中TNF-α和IL-6的生成量，显示良好的抗神经炎活性。

2.2CTB、CTB-1降糖活性测试结果

如图8A所示，CTB的α-淀粉酶抑制作用呈现剂量依赖性。当CTB浓度在1mg/mL时，CTB的α-淀粉酶抑制率达到最高的59.24％，其半数抑制浓度为5.37×10^-5mg/mL，远低于阿卡波糖的0.72mg/mL。因而，CTB对α-淀粉酶的抑制作用是阿卡波糖的13408倍。进一步分析由CTB分离纯化得到的CTB-1的α-淀粉酶抑制作用。如图8B所示，CTB-1的α-淀粉酶抑制率从23.00％增长至55.26％。CTB-1的半数抑制浓度为0.40mM，阿卡波糖为1.07mM，CTB-1对α-淀粉酶的抑制作用是阿卡波糖的2.7倍。

如图8C所示，在抑制α-葡萄糖苷酶方面，CTB的作用呈现剂量依赖性。当CTB的浓度为10mg/mL时，其抑制率达到98.99％，其半数抑制浓度为0.0088mg/mL，远低于阿卡波糖的7.98mg/mL，CTB的α-葡萄糖苷酶抑制作用是阿卡波糖的907倍。进一步分析由CTB分离纯化得到的CTB-1的α-葡萄糖苷酶抑制作用，如图8D所示，CTB-1的α-葡萄糖苷酶抑制率以剂量依赖的方式从36.09％增长至67.35％。CTB-1的半数抑制浓度为0.72mM，阿卡波糖为12.90mM，CTB-1对α-葡萄糖苷酶的抑制作用是阿卡波糖的17.9倍。

2.3CT2、CT2-1、CT2-1A、CT2-1B和CT2-2的抗神经炎活性测试的结果

在雪菊糖聚合物抗神经炎方面，分别检测1μg/mL的LPS、100μM的吲哚美辛、240μg/mL的CT2、200μM的CT2-1、CT2-1A、CT2-1B和CT2-2对BV2细胞活力的影响，检测方法同实施例4中方法1.1。检测30、60、120、240μg/mL的粗糖聚合物CT2，25、50、100、200μM的精糖聚合物CT2-1、CT2-1A、CT2-1B、CT2-2,12.5、25、50、100μM的吲哚美辛对LPS诱导的BV2细胞中NO产量的影响，检测方法同实施例4中方法1.2.1。

结果如图9A所示，1μg/mL的LPS、100μM的吲哚美辛、240μg/mL的CT2、200μM的CT2-1、CT2-1A、CT2-1B、CT2-2对BV2细胞活力无显著影响，因此0～240μg/mL的CT2，0～200μM的CT2-1、CT2-1A、CT2-1B、CT2-2可进行后续实验。如图9B所示，CT2以剂量依赖方式显著抑制BV2细胞中NO的产生。如图9C所示，CT2-1、CT2-1A、CT2-1B和CT2-2对BV2细胞中NO的半数抑制浓度分别为0.12、0.23、0.24和0.27mM，因此以剂量依赖方式展现出对BV2细胞中NO产量的显著抑制作用。

检测1μg/mL的LPS、100μM的吲哚美辛、240μg/mL的CT2、200μM的CT2-1对RAW264.7细胞活力的影响，检测方法同实施例4中方法1.1。检测糖聚物CT2(30、60、120、240μg/mL),CT2-1(25、50、100、200μM)，吲哚美辛(12.5、25、50、100μM)对LPS诱导的RAW264.7细胞中NO产量的影响，检测方法同实施例4中方法1.2.1。

结果如图10A所示，1μg/mL的LPS、100μM的吲哚美辛、240μg/mL的CT2、200μM的CT2-1对RAW264.7细胞无细胞毒性，因此0～240μg/mL的CT2，0～200μM的CT2-1可进行后续实验。如图10B所示，在LPS诱导的RAW264.7细胞中，30～240μg/mL的CT2，25～200μM的CT2-1均以剂量依赖的方式显著降低NO的产量。如图10B所示，CT2轻微抑制BV2细胞中NO的产生。在LPS诱导的RAW264.7细胞中，CT2-1抑制NO产量的半数抑制浓度为0.27mM。因此CT2-1以剂量依赖方式展现出对RAW264.7细胞中NO产量的显著抑制作用。

2.4CT1、CT2、CT1-2、CT2-1、CT2-1A、CT2-1B和CT2-2的降糖活性测试结果

在雪菊糖聚合物降糖活性方面，检测CT1、CT2、CT1-2、CT2-1、CT2-1A、CT2-1B和CT2-2对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用，检测方法同实施例4中方法1.3，以阿卡波糖为阳性对照。

结果如图11A所示，CT1、CT2以剂量依赖的方式抑制α-淀粉酶的活性。如图11B所示，CT1-2、CT2-1、CT2-1A、CT2-1B和CT2-2对α-淀粉酶的半数抑制浓度分别为1.80、2.79、2.77、2.75和3.35mM。阿卡波糖的半数抑制浓度为1.23mM。如图11C所示，CT1、CT2以剂量依赖的方式抑制α-葡萄糖苷酶的活性。如图11D所示，CT1-2、CT2-1、CT2-1A、CT2-1B和CT2-2对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度分别为1.79、3.00、2.14、2.12和4.89mM，阿卡波糖的半数抑制浓度为1.21mM。

3结论

在神经退行性疾病的核心病理机制中，神经炎症是神经元变性丢失的重要原因，而小胶质细胞过度活化被认为是神经炎症的重要特征，抑制小胶质细胞的过度活化产生和分泌的大量神经毒性因子包括(趋化因子和促炎性因子)是神经退行性疾病治疗的重要策略。通过上述方法提取的各雪菊糖聚合物包括CTB-1、CT1、CT2、CT1-2、CT2-1、CT2-1A、CT2-1B和CT2-2均表现出明显的抗神经炎作用。

控制血糖浓度是治疗糖尿病的关键因素，而α-淀粉酶抑制剂和α-葡萄糖苷酶抑制剂可延迟糖的吸收，使血糖浓度得到很好控制，因此从天然产物中寻找低毒性的α-淀粉酶抑制剂和α-葡萄糖苷酶抑制剂成为治疗糖尿病的研究热点。通过上述方法提取的各雪菊糖聚合物包括CTB、CTB-1、CT1、CT2、CT1-2、CT2-1、CT2-1A、CT2-1B和CT2-2均表现出明显的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制作用。

因而，雪菊糖聚合物在防治神经退行性疾病及其并发症和糖尿病及其并发症方面的活性研究为雪菊糖聚合物在医药、保健品和功能食品等领域的应用提供了依据。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (3)

1.一种糖聚合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)选材：选取干燥的雪菊的头状花序，用水浸泡6～12h，雪菊的头状花序为雪菊的茎、枝顶端的头状花序；

2)水提：用5～15倍体积的60～100℃的热水对步骤1)浸泡好的雪菊的头状花序提取1～4h，分别收集得到提取液和残渣；

3)分级醇沉：将步骤2)得到的提取液40～70℃减压浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇的体积浓度为A％，静置10～28h分成上清液一和沉淀一，收集沉淀即得粗糖聚合物CT1；将上清液一再次40～70℃减压浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇的体积浓度为B％，静置10～28h分成上清液二和沉淀二，收集沉淀二即得粗糖聚合物CT2；将上清液二再次40～70℃减压浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇的体积浓度为C％，静置10～28h得到沉淀三，收集沉淀三即得粗糖聚合物CT3，其中10≤A＜60，60≤B＜80，80≤C＜100；

4)碱提：将步骤2)得到的残渣浸泡于0.1～1M浓度的NaOH溶液中，NaOH溶液的体积为残渣体积的5～20倍，静置1～4h得到上清液三，将上清液三用0.1～1M浓度的HCl溶液中和至pH值为6～8，离心分离后得到上清液四，将上清液四40～70℃减压浓缩，加入乙醇进行醇沉使乙醇的体积浓度为30～90％，静置10～28h得到沉淀四，收集沉淀四即得粗糖聚合物CTB；

5)纯化：利用Sevag法分别对粗糖聚合物CT1、CT2、CT3、CTB进行除蛋白，除蛋白后再经透析袋进行透析、冻干，透析袋的截留分子量为100Da，即得纯化粗糖聚合物CT1、CT2、CT3、CTB；

6)离子交换柱层析：取180mg步骤5)得到的纯化粗糖聚合物CTB，溶于9mL的去离子水中，上样于DEAE-Cellulose 52柱，在不同盐浓度的洗脱液条件下出现2个峰，其中峰一为0.05M浓度NaCl洗脱部分，峰二为0.1M浓度的NaCl洗脱部分，洗脱过程中使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收集糖部分，将峰一所得洗脱液40～70℃减压浓缩、冷冻干燥得到峰一糖聚合物；

7)分子筛凝胶层析：将步骤6)得到的峰一糖聚合物用水进行溶解，离心分离后得到上清液，上Sephadex G75柱，用水进行洗脱，采用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，出现一个单一对称峰，收集主峰，40～70℃减压浓缩，冷冻干燥后得雪菊糖聚合物CTB-1；

8)离子交换柱层析：取180mg步骤5)得到的纯化粗糖聚合物CT1，溶于9mL的去离子水中，上样于DEAE-Cellulose 52柱，用0.05M浓度NaCl进行梯度洗脱，洗脱过程中使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线收集糖部分，将洗脱液40～70℃减压浓缩、冷冻干燥，用水进行溶解，离心分离后得到上清液；

9)分子筛凝胶层析：将步骤8)得到的上清液上Sephadex S-100柱，用水进行洗脱，采用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线收集糖部分，40～70℃减压浓缩，冷冻干燥后得雪菊糖聚合物CT1-2；

10)离子交换柱层析：取180mg步骤5)得到的纯化粗糖聚合物CT2，溶于9mL的去离子水中，上样于DEAE-Cellulose 52柱，分别用蒸馏水和0.05M浓度NaCl进行梯度洗脱，洗脱过程中使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线收集糖部分，将洗脱液40～70℃减压浓缩、冷冻干燥，用水进行溶解，离心分离后得到上清液；

11)分子筛凝胶层析：将步骤10)得到的上清液上Sephadex S系列柱，用水进行洗脱，采用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线收集糖部分，40～70℃减压浓缩，冷冻干燥后得雪菊糖聚合物CT2-1、CT2-1A、CT2-1B、CT2-2。

2.根据权利要求1所述的一种糖聚合物的制备方法得到的糖聚合物，其特征在于：

雪菊糖聚合物CTB-1是由半乳糖和阿拉伯糖组成的糖，其结构为：

其中，a、b、c、d的范围为1～1000；

雪菊糖聚合物CT1-2是由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖和鼠李糖组成的糖，其结构为：

其中，a、b的范围为1～1000；

雪菊糖聚合物CT2-1是由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖和果糖组成的糖，其结构为：

其中，a、b、c的范围为1～1000；

雪菊糖聚合物CT2-1A是由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖组成的糖，其结构为：

其中，a、b的范围为1～1000；

雪菊糖聚合物CT2-1B是由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖组成的糖，其结构为：

其中，a、b的范围为1～1000；

雪菊糖聚合物CT2-2是由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖组成的糖，其结构为：

其中，x的范围为1～1000。

3.根据权利要求1所述的一种糖聚合物的制备方法得到的CTB、CTB-1、CT1、CT2、CT1-2、CT2-1、CT2-1A、CT2-1B、CT2-2在制备防治神经退行性疾病及其并发症和糖尿病及其并发症方面的药物中的应用。

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