CN104450826A - 一种云芝多糖提取物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种云芝多糖提取物及其制备方法与应用。本发明通过深层发酵培养云芝菌丝体后，发酵产物分离出菌丝体和发酵液，菌丝体烘干，粉碎过筛脱脂干燥后，进行热水浸提并浓缩，得到浸提浓缩液；发酵液超滤去除小分子物质后，浓缩，得到超滤浓缩液。超滤浓缩液和浸提浓缩液通过去蛋白、乙醇沉淀、双氧水脱色，透析最后经真空冷冻干燥，分别制得云芝胞内多糖提取物和云芝胞外多糖提取物。本发明制备过程简单、可高效高质大量生产，提取物对人体无毒害，具有良好降血脂的生理作用，可用于开发降血脂药物或保健食品。

Description

一种云芝多糖提取物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种云芝多糖提取物及其制备方法与应用。

背景技术

通过液体深层发酵食药用真菌菌丝体获得发酵产物，一般可以分别提取菌丝体中的胞内多糖和发酵液中的胞外多糖。

胡成旭等(2007)利用响应面法研究云芝菌丝体多糖的水提取工艺，求得最佳水浸提条件为：提取温度85℃，浸提时间105min，液料比27:1，云芝多糖的提取率为7.27％。Pan等(2010)等利用超声辅助提取法研究了云芝子实体多糖的最佳工艺参数，得出最佳的超声功率为30W，料液比为1:40，时间为8h，此条件下多糖的提取率可达到5.95％。张桂春等(2005)研究了金顶侧耳胞外多糖的最佳提取工艺是将母液浓缩到原体积的1/4，再用75％的乙醇醇沉10h。王永敏等(2009)将蛹虫草发酵清液浓缩至1/5后加3倍95％乙醇沉淀12h，得多糖沉淀，并以Sevage法去除蛋白。Wang等(2011)将蛹虫草发酵液浓缩，乙醇沉淀多糖，用sevage法去蛋白，并透析冷冻干燥可得胞外粗多糖。Meng等(2010)等通过响应面法研究羊肚菌深层培养的发酵液中胞外多糖的提取参数，包括发酵液的浓缩温度，乙醇沉淀时间及pH值。一方面利用子实体获得多糖提取物，需耗费大量资源，目前云芝子实体生长周期较长，且产量有限，自然环境生长采集的野生子实体数量稀少，用来提取多糖成本高；另一方面利用半合成培养基深层发酵对所得的多糖成分影响较大，不利于分离纯化和生理功效鉴定。研究发现，云芝多糖具有明显免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、促进受损肝细胞恢复等作用，(郑炯等，2007；王菲菲等，2012；Kang等，2013；梁语丝等，2014)，开发和利用价值较大。目前云芝多糖提取物的生物活性或药效的研究大多在抗肿瘤和免疫调节等领域。有关云芝液体深层发酵物降血脂作用的研究尚未见到有相关文献报道。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种云芝多糖提取物的制备方法。

本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的云芝多糖提取物，该云芝多糖提取物培养简易高效、提取方法稳定可靠、成本低。

本发明的再一目的在于提供上述云芝多糖提取物的应用。

本发明的目的通过下述方案实现：

一种云芝多糖提取物的制备方法，包含如下步骤：

(1)云芝(Coriolus versicolor)液体深层发酵后，分离得到云芝菌丝体和发酵液，其中，云芝菌丝体干燥粉碎并过筛后，脱脂，干燥，得到脱脂后的菌丝体；发酵液超滤去除小分子物质，得到云芝超滤液；

(2)热水浸提脱脂后的菌丝体，得到含云芝胞内多糖的浸提液；

(3)将步骤(1)得到的云芝超滤液和步骤(2)得到的浸提液分别浓缩，得到超滤浓缩液和浸提浓缩液；

(4)将步骤(3)制备得到的超滤浓缩液和浸提浓缩液分别采用胰蛋白酶和Sevage法去蛋白，得到去蛋白后的胞外多糖提取液和胞内多糖提取液；

(5)用乙醇分别沉降步骤(4)得到的胞外多糖提取液和胞内多糖提取液中的多糖，然后离心分离得到沉淀，脱色透析干燥后，分别制得云芝胞内提取物和云芝胞外多糖提取物；

步骤(1)中所述的干燥温度优选为50～55℃；所述的过筛筛目为14～40目；优选为40目；

步骤(1)中所述的脱脂方法优选为：菌丝体粉末与石油醚按体积比为1:2混匀，振荡或搅拌处理2～3d，脱去菌丝体中的脂质，离心留沉淀；重复脱脂1～2次；

步骤(1)中所述的超滤条件优选为进膜压力为10bar，通量3～5L/min，物料温度22℃；所述的超滤优选用1万分子量PS超滤膜超滤；

步骤(2)中所述的热水浸提的条件为：料液比为1:30，提取时间为2～3h，提取温度为90℃，提取次数为1～3次；

步骤(2)中所述的热水浸提的条件优选为：料液比为1:30，提取时间为2h，提取温度为90℃，提取次数为2次；

步骤(3)中所述的浓缩的温度优选为55℃～60℃；优选为60℃；

步骤(5)中所述的乙醇用量为多糖提取液体积的3～5倍；

步骤(5)中所述的沉降的温度为0～25℃，沉降的时间为12～48h；

步骤(5)中所述的脱色透析干燥的方法为：用水溶解沉淀并调节多糖溶液pH至8.0；然后滴加质量分数为30％的H₂O₂溶液，于50～55℃水浴保温2～3h，对其进行氧化脱色处理；然后将多糖溶液装入截留分子量为8000～15000Da的透析袋中透析2～3d，每8～10h更换一次水；对透析完成后的溶液进行浓缩，并真空冷冻干燥，获得云芝多糖提取物；所述的质量分数为30％的H₂O₂溶液的用量为每100mL多糖液滴加2mL质量分数为30％的H₂O₂溶液；

步骤(4)中所述的胰蛋白酶和Sevage法，包含如下步骤：

①将步骤(3)制备得到的浓缩液分别调pH至8.0；然后将胰蛋白酶加入浓缩液中充分混合并37℃振荡30～60min，再水浴灭酶10～15min，冷却至室温；

②去蛋白后的浓缩液加入0.2倍体积的氯仿正丁醇混合液，剧烈振荡30～40min；然后离心，弃取蛋白层及有机溶液，回收上清液；

③重复步骤②2～3次，得到去蛋白后的多糖提取液；

步骤①所述的胰蛋白酶的初始浓度优选为2％(W/V)；所述的胰蛋白酶的用量为浓缩液体积的(1:10)～(1:20)；

步骤①所述的灭酶温度优选为100℃；

步骤①所述的胰蛋白酶加入浓缩液充分混合的具体操作优选为：配制2％(W/V)的胰蛋白酶溶液，将步骤(3)制备得到的浓缩液调pH至8.0；然后将胰蛋白酶溶液和浓缩液分别37℃水浴预热10～15min，将预热后的胰蛋白酶溶液和发酵浓缩液充分混合；

步骤②所述的氯仿正丁醇混合液中氯仿和正丁醇的体积比为5:1；

步骤②所述的离心转速为8000～10000rpm，所述的离心时间为10～15min；

步骤(1)中所述的云芝(Coriolus versicolor)液体深层发酵培养的方法，优选包含如下步骤：

(Ⅰ)将云芝斜面母种活化培养后转接至斜面固体培养基中，24～27℃培养10～15d，直至菌丝铺满斜面为止，得到云芝斜面菌种；

(Ⅱ)从步骤(Ⅰ)制备得到的云芝斜面菌种上挑取4～6菌块，接种至200mL的液体发酵培养基中，室温静置24h，待菌块伤口处愈合后，在150rpm，27的条件下振荡培养6d，制得一级种子液；

(Ⅲ)将步骤(Ⅱ)制备得到的一级种子液转入50L种子罐培养二级种子液，接种量为7％，培养温度为27℃，转速为150rpm，罐压为0.05～0.07MPa，通气量1.5m³/h(V:V为1:0.6)，培养3d后转入500L发酵罐培养，初始培养条件温度，转速及罐压与种子罐相同，通气量为12m³/h，培养3～5d；

步骤(Ⅰ)所述的斜面固体培养基的配方为：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，蛋白胨1g，(NH₄)₂SO₄2g，MgSO₄·7H₂O 1g，KH₂PO₄1g，琼脂20g，加蒸馏水定容至1000mL，pH调至6.5；

步骤(Ⅱ)和(Ⅲ)中用于一级种子液和二级种子液培养以及发酵培养的培养基配方为：步骤(1)中所述的云芝液体深层发酵的培养基配方为：葡萄糖50g，NH₄NO₃2g，KH₂PO₄2g，MgSO₄·7H₂O 1g，维生素B₁0.05g，水1000mL，pH 6.5；

一种云芝多糖提取物，根据上述制备方法制备得到；

所述的云芝胞内多糖提取物(IPCV)中总糖、还原糖、蛋白质含量分别为66.58％～69.53％，3.14％～3.74％，0.36％～0.40％；胞外多糖提取物(EPCV)中总糖、还原糖、蛋白质含量分别为63.91％～64.89％，3.08％～3.48％，0.17％～0.22％；

所述的云芝多糖提取物具有良好的降血脂作用，显著降低动脉粥样硬化指数，具有抗动脉粥样硬化的能力，可作为生产云芝多糖提取物降血脂和抗动脉粥样硬化药物与保健食品开发的原料；

所述的云芝胞内多糖提取物在降血脂药物与保健食品应用中的使用剂量为50mg/(kg·d)，云芝胞外多糖提取物的使用剂量为200mg/(kg·d)；

与现有的技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

(1)本发明的云芝多糖提取物，采用中式发酵罐生产，从菌丝体中获得云芝胞内多糖提取物，从发酵液中获得胞外多糖提取物，不但制备过程简单，条件易控制，而且可大批量工厂化生产。

(2)本发明使用葡萄糖和硝酸铵作为碳氮源的合成培养基进行发酵，不但培养基成分精确，重复性强，发酵效率高，而且多糖质量稳定、易于分离纯化，特别重要的是发酵的多糖测定不受培养基中糖含量的影响。

(3)使用不同云芝菌株液体发酵，多糖产率和活性有所差异。本发明采用的云芝菌株，性状优良，适宜用于液体发酵产多糖，其产率高。

(4)本发明采用活化的斜面菌块接种于液体培养基，培养获得一级种子液，可以缩短液体种制备周期，简化生产工艺，而不需另外制备菌液。

(5)本发明所得胞外多糖提取物，来源于云芝液体深层发酵液，而且提取过程中安全可控，具有对人体无毒害的优点。

(6)本发明所得云芝胞内多糖提取物溶解性好，胞外多糖提取物有少量难溶物，两者均具有良好的降血脂、抗动脉粥样硬化的作用。

附图说明

图1为云芝多糖提取物对小鼠血清TC的影响图。

图2为云芝多糖提取物对小鼠血清TG的影响图。

图3为云芝多糖提取物对小鼠血清LDL-C的影响图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中涉及到的培养基配方：

斜面固体培养基配方：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，蛋白胨1g，(NH₄)₂SO₄2g，MgSO₄·7H₂O 1g，KH₂PO₄1g，琼脂20g，加蒸馏水定容至1000mL，pH调至6.5；

液体发酵培养基配方：葡萄糖50g，NH₄NO₃2g，KH₂PO₄2g，MgSO₄·7H₂O1g，维生素B₁0.05g，水1000mL，pH 6.5；

云芝(Coriolus versicolor)菌株由华南师范大学生命科学学院提供(张峰源,张松,曾剑锋.罗炜杰,云芝、灵芝和柱状田头菇胞外多糖对果蝇寿命的影响.生命科学研究,11(2):130-133,2007.)；

实施例1

(1)云芝(Coriolus versicolor)经斜面或平板菌种培养、液体振荡培养和液体深层发酵培养，得到菌丝体和发酵液，具体方法如下：

①斜面或平板菌种培养：将活化后的云芝斜面母种菌丝块接入新的斜面固体培养基中，24℃培养10d，置于4℃保存备用。

②一级液体菌种培养：取200mL液体发酵培养基装入500mL三角瓶，在121℃灭菌20min，并接入4个黄豆大小的的云芝母种菌丝块；室温静置24h，待菌块伤口处愈合后在27℃，转速150rpm，避光恒温振荡培养6天，得到一级种子液；

③二级液体菌种培养：50L种子罐装入液体发酵培养基35L，125℃灭菌20min；冷却后接入2.45L培养好的一级种子液，培养温度为27℃，转速为150rpm，罐压为0.05～0.07MPa，通气量约1.5m³/h(V:V为1:0.6)培养3天，取样观察可发现到种子液清澈透亮，菌丝体丰富，大小均匀。

④液体深层发酵培养：将培养好的二级种子液转入500L发酵罐培养，初始培养条件温度，转速及罐压与种子罐相同，通气量约为12m³/h，培养4d；

(2)将发酵产物通过高速离心获得菌丝体和发酵液，发酵液经1万分子量PS超滤膜超滤去除小分子物质后，浓缩至20L，得到云芝超滤液，其中，超滤条件为：进膜压力约为10bar，通量3L/min，物料温度22℃。

(3)将云芝菌丝体55℃烘干粉碎过40目筛后，进行脱脂处理(菌丝体粉末与石油醚按体积比为1:2混匀，振荡或搅拌处理3d，脱去菌丝体中的脂质，离心留沉淀；重复脱脂2次)并干燥；然后以料液比为1:30，提取时间为2h，提取温度为90℃，提取次数为2次的工艺参数热水浸提胞内多糖，获得含有云芝胞内多糖的浸提液；

(4)浓缩：用旋转蒸发仪将步骤(2)得到的云芝超滤液和步骤(3)得到的浸提液分别在60℃的恒温水浴锅中减压浓缩至原体积的1/10，得到超滤浓缩液和浸提浓缩液；

(5)胰蛋白酶和sevage法去蛋白、离心：称取2.0g胰蛋白酶溶于100mL蒸馏水中，再把1000mL的浓缩液调pH至8.0，将酶液及浓缩液同时放入37℃水浴锅中预热10min，把两者充分混合，并振荡保持30min后放入100℃水浴锅中灭酶10min，冷却至室温；然后加入0.2倍体积的氯仿正丁醇混合液(氯仿:正丁醇(V：V)＝5:1)，剧烈震荡30min，然后8000rpm离心10min，弃取蛋白层及有机溶液，回收上清液，此过程重复2次；

(6)在去蛋白后的多糖溶液中加入4倍体积的乙醇，放于4℃冰箱冷藏2d，待析出粗多糖，离心得到沉淀；用少量蒸馏水溶解沉淀，调节多糖溶液pH至8.0，然后滴加30％的H₂O₂(每100mL多糖液滴加2mL质量分数为30％的H₂O₂溶液)，在50℃下水浴保温2h，对其进行脱色素处理；之后，将多糖溶液装入截留分子量为8000～15000Da的透析袋中以蒸馏水透析约3d，每8h更换一次蒸馏水。最后，对透析完成后的溶液进行浓缩，并真空冷冻干燥，获得云芝胞内和胞外多糖提取物(IPCV和EPCV)。

云芝胞内和胞外多糖提取物，经苯酚硫酸法测定含总糖分别为66.58％和63.91％，经DNS比色法测定含还原糖分别为3.14％和3.08％，经考马斯亮兰法测定含蛋白分别为0.36％和0.17％。

实施例2

(1)云芝(Coriolus versicolor)经斜面或平板菌种培养、液体振荡培养和液体深层发酵培养，得到菌丝体和发酵液，具体方法件如下：

①斜面或平板菌种培养：将活化后的云芝斜面母种菌丝块接入新的斜面固体培养基中，25℃培养12d，置于4℃保存备用。

②一级液体菌种培养：取200mL液体发酵培养基装入500mL三角瓶，在121℃灭菌20min，并接入6个黄豆大小的的云芝母种菌丝块；室温静置24h，待菌块伤口处愈合后在27℃，转速150rpm，避光恒温振荡培养6天，得到一级种子液；

③二级液体菌种培养：50L种子罐装入液体发酵培养基35L，125℃灭菌20min；冷却后接入2.45L培养好的一级种子液，培养温度为27℃，转速为150rpm，罐压为0.05～0.07MPa，通气量约1.5m³/h(V:V为1:0.6)培养3天，取样观察可发现到种子液清澈透亮，菌丝体丰富，大小均匀。

④液体深层发酵培养：将培养好的二级种子液转入500L发酵罐培养，初始培养条件温度，转速及罐压与种子罐相同，通气量约为12m³/h，培养5d；

(2)将发酵产物通过高速离心获得菌丝体和发酵液，发酵液经1万分子量PS超滤膜超滤去除小分子物质后，浓缩至20L，得到云芝超滤液，其中，超滤条件为：进膜压力约为10bar，通量5L/min，物料温度22℃。

(3)将云芝菌丝体50℃烘干粉碎过40目筛后，进行脱脂处理(菌丝体粉末与石油醚按体积比为1:2混匀，振荡或搅拌处理3d，脱去菌丝体中的脂质，离心留沉淀；重复脱脂2次)并干燥；然后以料液比为1:30，提取时间为3h，提取温度为90℃，提取次数为3次的工艺参数热水浸提胞内多糖，获得含有云芝胞内多糖的浸提液；

(4)浓缩：用旋转蒸发仪将步骤(2)得到的云芝超滤液和步骤(3)得到的浸提液分别在60℃的恒温水浴锅中减压浓缩至原体积的1/7，得到超滤浓缩液和浸提浓缩液；

(5)胰蛋白酶和sevage法去蛋白、离心：称取2.0g胰蛋白酶溶于100mL蒸馏水中，再把1000mL的浓缩液调pH至8.0，将酶液及浓缩液同时放入37℃水浴锅中预热12min，把两者充分混合，并振荡保持40min后放入100℃水浴锅中灭酶12min，冷却至室温；然后加入0.2倍体积的氯仿正丁醇混合液(氯仿:正丁醇(V：V)＝5:1)，剧烈震荡35min，然后8500rpm离心12min，弃取蛋白层及有机溶液，回收上清液，此过程重复2次；

(6)在去蛋白后的多糖溶液中加入3倍体积的乙醇，置于25℃沉降1d，待析出粗多糖，离心得到沉淀；用少量蒸馏水溶解沉淀，调节多糖溶液pH至8.0，然后滴加质量分数为30％的H₂O₂(每100mL多糖液滴加2mL质量分数为30％的H₂O₂溶液)，在55℃下水浴保温3h，对其进行脱色素处理；之后，将多糖溶液装入截留分子量为8000～15000Da的透析袋中以蒸馏水透析约3d，每9h更换一次蒸馏水。最后，对透析完成后的溶液进行浓缩，并真空冷冻干燥，获得云芝胞内和胞外多糖提取物(IPCV和EPCV)。

云芝胞内和胞外多糖提取物，经苯酚硫酸法测定含总糖68.78％和64.92％，经DNS比色法测定含还原糖3.60％和3.32％，经考马斯亮兰法测定含蛋白0.39％和0.21％。

实施例3

(1)云芝(Coriolus versicolor)经斜面或平板菌种培养、液体振荡培养和液体深层发酵培养，得到菌丝体和发酵液，具体方法件如下：

①斜面或平板菌种培养：将活化后的云芝斜面母种菌丝块接入新的斜面固体培养基中，27℃培养15d，置于4℃保存备用。

②一级液体菌种培养：取200mL液体发酵培养基装入500mL三角瓶，在121℃灭菌20min，并接入5个黄豆大小的的云芝母种菌丝块；室温静置24h，待菌块伤口处愈合后在27℃，转速150rpm，避光恒温振荡培养6天，得到一级种子液；

③二级液体菌种培养：50L种子罐装入液体发酵培养基35L，125℃灭菌20min；冷却后接入2.45L培养好的一级种子液，培养温度为27℃，转速为150rpm，罐压为0.05～0.07MPa，通气量约1.5m³/h(V:V为1:0.6)培养3天，取样观察可发现到种子液清澈透亮，菌丝体丰富，大小均匀。

④液体深层发酵培养：将培养好的二级种子液转入500L发酵罐培养，初始培养条件温度，转速及罐压与种子罐相同，通气量约为12m³/h，培养3d；

(2)将发酵产物通过高速离心获得菌丝体和发酵液，发酵液经1万分子量PS超滤膜超滤去除小分子物质后，浓缩至20L，得到云芝超滤液，其中，超滤条件为：进膜压力约为10bar，通量4L/min，物料温度22℃。

(3)将云芝菌丝体55℃烘干粉碎过40目筛后，进行脱脂处理(菌丝体粉末与石油醚按体积比为1:2混匀，振荡或搅拌处理2d，脱去菌丝体中的脂质，离心留沉淀；重复脱脂1次)并干燥；然后以料液比为1:30，提取时间为3h，提取温度为90℃，提取次数为3次的工艺参数热水浸提胞内多糖，获得含有云芝胞内多糖的浸提液；

(4)浓缩：用旋转蒸发仪将步骤(2)得到的云芝超滤液和步骤(3)得到的浸提液分别在55℃的恒温水浴锅中减压浓缩至原体积的1/5，得到超滤浓缩液和浸提浓缩液；

(5)胰蛋白酶和sevage法去蛋白、离心：称取2.0g胰蛋白酶溶于100mL蒸馏水中，再把1000mL的浓缩液调pH至8.0，将酶液及浓缩液同时放入37℃水浴锅中预热15min，把两者充分混合，并振荡保持60min后放入100℃水浴锅中灭酶15min，冷却至室温；然后加入0.2倍体积的氯仿正丁醇混合液(氯仿:正丁醇(V：V)＝5:1)，剧烈震荡40min，然后9000rpm离心15min，弃取蛋白层及有机溶液，回收上清液，此过程重复3次；

(6)在去蛋白后的多糖溶液中加入5倍体积的乙醇，置于8℃沉降12h，待析出粗多糖，离心得到沉淀；用少量蒸馏水溶解沉淀，调节多糖溶液pH至8.0，然后滴加质量分数为30％的H₂O₂(每100mL多糖液滴加2mL质量分数为30％的H₂O₂溶液)，在52℃下水浴保温2.5h，对其进行脱色素处理；之后，将多糖溶液装入截留分子量为8000～15000Da的透析袋中以蒸馏水透析约2d，每10h更换一次蒸馏水。最后，对透析完成后的溶液进行浓缩，并真空冷冻干燥，获得云芝胞内和胞外多糖提取物(IPCV和EPCV)。

云芝胞内和胞外多糖提取物，经苯酚硫酸法测定含总糖69.53％和64.89％，经DNS比色法测定含还原糖3.74％和3.48％，经考马斯亮兰法测定含蛋白0.40％和0.22％。

实施例4

(1)云芝多糖提取物(实施例1制备得到)降血脂作用的实验(高剂量)

①昆明种小鼠，SPF级别，雄性，体重18～22g，购自中山大学实验动物中心。许可证号：SCK(粤)2011-0029；高脂饲料(配方为：10％猪油、1.0％胆固醇、0.3％胆盐、88.7％普通饲料)，购自广东省医学实验动物中心。许可证号：SCK(粤)2008-0002。小鼠用普通饲料适应性喂养4d后，根据小鼠体重随机分为正常对照组，高脂模型组，阳性对照组(辛伐他汀，10mg/(kg·d))，200mg/(kg·d)多糖提取物高剂量组，每组小鼠数为10只。实验期间小鼠自由饮水，定量给食。所有小鼠饲养于温度为18～22℃，相对湿度为50％～60％，有自然光照的标准实验动物房。除正常对照组小鼠给予普通饲料外，其他各实验组给予高脂饲料，每只小鼠5g/d(后两周增至6g/d)。采取预防模式给药：即高脂饲料建模与给药同时进行。每天上午定时对实验处理组小鼠灌胃各药物一次，每只小鼠灌胃量均为0.5mL，正常对照组和高脂模型组灌胃等体积的蒸馏水。实验进行28d。实验期间每周称量一次体重，每日观察小鼠摄食，自主活动情况。

②最后一天灌胃后，小鼠禁食不禁水12h，断颈取血，分离得血清后分别检测血脂四项指标TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量。取血后迅速解剖小鼠，取其心脏，肝脏、肾脏、脾脏，并计算心指数、肝指数、肾指数和脾指数(以脏器鲜重/体重表示)。

(2)云芝多糖提取物(实施例1制备得到)降血脂作用的实验(中剂量)

方法同步骤(1)，其中，各处理组分别为正常对照组，高脂模型组，阳性对照组(辛伐他汀，10mg/(kg·d))，100mg/(kg·d)多糖提取物中剂量组，每组小鼠数为10只。

(3)云芝多糖提取物(实施例1制备得到)降血脂作用的实验(低剂量)

方法同步骤(1)，其中，各处理组分别为正常对照组，高脂模型组，阳性对照组(辛伐他汀，10mg/(kg·d))，50mg/(kg·d)多糖提取物低剂量组，每组小鼠数为10只。②同步骤(1)。

上述(1)、(2)、(3)的实验数据如表1，表2和表3所示。

由表1可知，小鼠摄食高脂饲料至最后一天，与正常对照组相比，高脂模型组小鼠血清中TC的含量极显著地升高了104.72％(P<0.01)；由表2可知，实验结束时，相对正常对照组，小鼠摄食高脂饲料使得其血清LDL-C、HDL-C和动脉粥样硬化指数AI极显著地升高285.14％，56.16％和44.20％(P<0.01)，以上说明摄入外源性高脂成分使得小鼠体内脂质水平极显著升高，是典型的脂质代谢紊乱症状，这提示本实验小鼠高脂血症模型已成功建立。

表1 云芝多糖提取物对小鼠血清TC及TG水平的影响

注：与正常对照组相比^#P<0.05，^##P<0.01；与高脂模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。

与高脂模型组相比，50mg/(kg·d)、100mg/(kg·d)及200mg/(kg·d)的IPCV分别使高脂血症小鼠血清TC极显著降低19.12％、17.05％和15.90％(P<0.01)。50mg/(kg·d)、100mg/(kg·d)及200mg/(kg·d)的EPCV也分别使小鼠血清TC极显著下降12.67％、17.05％和20.97％(P<0.01)。从上述结果可知，以50mg/(kg·d)的IPCV和200mg/(kg·d)EPCV表现出最佳的降TC的效果。与高脂模型组比较，阳性药物使TC降低11.98％(P<0.01)。与阳性药物相比，各剂量组的云芝多糖均表现出比辛伐他汀更佳的降低TC的效果，但差异不显著(P>0.05)。在最佳作用剂量下，EPCV降低TC的效果略优于IPCV(P>0.05)。

各剂量组的云芝多糖提取物在降低TC的同时，均发挥降低TG的作用。与高脂模型组相比，50mg/(kg·d)、100mg/(kg·d)及200mg/(kg·d)的IPCV均可使小鼠血清TG极显著降低50.41％、43.80％和55.37％(P<0.01)；同时，50mg/(kg·d)、100mg/(kg·d)及200mg/(kg·d)的EPCV也可极显著使TG降低62.81％、67.77％和57.85％(P<0.01)。IPCV在200mg/(kg·d)的剂量下，降低TG效果最佳，低中剂量次之。EPCV在50mg/(kg·d)至100mg/(kg·d)剂量区间内，降低TG的效果增强；但它在200mg/(kg·d)时，作用效果反下降，不如低中剂量。在由上述可知，200mg/(kg·d)的IPCV和100mg/(kg·d)的EPCV表现出最佳的降TG效果，降幅分别55.37％和67.77％(P<0.01)，这种效果甚至极显著优于阳性药物辛伐他汀的降TG作用(P<0.01)。在最佳作用剂量下，EPCV表现出比IPCV更强的降TG效果(P<0.05)。

综上所述，低中高剂量的IPCV及EPCV均表现出极显著地降低高脂血症小鼠血清中TC，TG的水平(P<0.01)。考虑到降血脂作用以首要降低TC水平为目的，故本实验以50mg/(kg·d)剂量的IPCV综合降血脂效果为最佳，它使得TC，TG分别下降19.12％和50.41％(P<0.01)；200mg/(kg·d)的EPCV综合降血脂效果最佳，使TC，TG分别下降20.97％和57.85％(P<0.01)。总体而言，EPCV降血脂效果优于IPCV(P>0.05)。

表2 云芝多糖提取物对小鼠血清LDL-C，HDL-C水平和AI的影响

注：与正常对照组相比^#P<0.05，^##P<0.01；与高脂模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。

由表2可知，实验至最后一天，相对正常对照组，高脂模型中小鼠血清LDL-C的水平极显著的升高(P<0.01)。与高脂模型组相比，各剂量组的IPCV及EPCV均有效降低了高脂血症模型小鼠血清LDL-C的水平。50mg/(kg·d)、100mg/(kg·d)及200mg/(kg·d)的IPCV分别使LDL-C下降26.32％、25.61％和22.11％(P<0.01)，可看出三种剂量间的效果基本一致；对应同剂量的EPCV分别使LDL-C下降24.56％(P<0.01)、16.14％(P<0.01)和27.72％(P<0.05)。其中，EPCV以200mg/(kg·d)的剂量下降低LDL-C的作用效果最佳。由以上可知，50mg/(kg·d)的IPCV及200mg/(kg·d)的EPCV有最佳的降LDL-C效果，这种效果优于阳性药物辛伐他汀的药效(P>0.05)。

与高脂模型组相比，各剂量的IPCV和EPCV均未能显著升高小鼠血清HDL-C的水平(P>0.05)，这表明IPCV和EPCV未能通过HDL-C逆转运这一途径发挥降血脂的作用。

与正常对照组相比，由于TC水平大幅升高，高脂模型组小鼠的AI也极显著升高了(P<0.01)。辛伐他汀、100mg/(kg·d)的IPCV和200mg/(kg·d)EPCV分别使AI下降17.09％(P<0.01)、13.32％(P<0.05)和20.35％(P<0.01)。此两种剂量下均达到辛伐他汀的作用程度(P>0.05)。这提示一定剂量的IPCV或EPCV可明显改善血脂升高所导致的动脉粥样硬化程度，具有抗动脉粥样硬化的能力。

综上所述，IPCV和EPCV均可通过极显著降低LDL-C的水平，同时IPCV和EPCV还可改善动脉粥样硬化程度。但它们均对HDL-C产生显著效果。

表3 云芝多糖提取物对小鼠体重的影响

注：与正常对照组相比^#P<0.05，^##P<0.01；与高脂模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。

在实验起始日，各实验组小鼠体重无明显差异。至第14d时，摄食高脂饲料后，高脂模型组小鼠体重相对正常组有显著增加(P<0.05)。这表明，高脂成分导致小鼠出现肥胖现象。与高脂模型组相比，只有200mg/(kg·d)的EPCV可使高脂小鼠体重下降8.97％(P<0.01)。至第28d，即实验结束时，高脂模型组小鼠体重相对正常对照组的差异不显著(P>0.05)，其原因可能是实验后期小鼠对高脂饲料产生轻微的厌食现象，这使得摄食高脂饲料的小鼠体重增长减慢。与高脂模型组相比，200mg/(kg·d)的EPCV使小鼠体重显著降低10.12％(P<0.01)。从体重增加程度来看,仅200mg/(kg·d)的EPCV能显著抑制小鼠体重的增加(P<0.01)。

综上所述，各剂量的IPCV均对高脂饲料导致小鼠体重增加无明显抑制作用(P>0.05)。但高剂量的EPCV却能极显著地降低高脂血症小鼠体重(P<0.01)。

表4 云芝多糖提取物对小鼠脏器指数的影响

注：与正常对照组相比^#P<0.05，^##P<0.01；与高脂模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。

由表4可知，与高脂模型组比较，50mg/(kg·d)、100mg/(kg·d)和200mg/(kg·d)的EPCV均极显著降低了肝指数水平(P<0.01)，这种效果优于阳性药物辛伐他汀(P>0.05)；但IPCV仅在50mg/(kg·d)和200mg/(kg·d)时可明显降低肝指数(P<0.05)，这表明IPCV及EPCV可减轻高脂血症小鼠肝脏指数，有效保护肝脏。

与高脂模型组比较，高脂模型组小鼠的心指数和肾指数未发生显著变化(P>0.05)。各剂量的IPCV和EPCV对该两项脏器指数无显著影响，同时对脾指数也无显著影响(P>0.05)。

由以上分析，IPCV和EPCV均可有效降低高脂血症小鼠的肝指数，起到保护肝脏的作用。IPCV保肝作用好于EPCV。这表明，云芝多糖提取物具有良好的保肝功能，而且它们优于辛伐他汀。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种云芝多糖提取物的制备方法，其特征在于包含如下步骤：

(1)云芝(Coriolus versicolor)液体深层发酵后，分离得到云芝菌丝体和发酵液，其中，云芝菌丝体干燥粉碎并过筛后，脱脂，干燥，得到脱脂后的菌丝体；发酵液超滤去除小分子物质，得到云芝超滤液；

(2)热水浸提脱脂后的菌丝体，得到含云芝胞内多糖的浸提液；

(3)将步骤(1)得到的云芝超滤液和步骤(2)得到的浸提液分别浓缩，得到超滤浓缩液和浸提浓缩液；

(4)将步骤(3)制备得到的超滤浓缩液和浸提浓缩液分别采用胰蛋白酶和Sevage法去蛋白，得到去蛋白后的胞外多糖提取液和胞内多糖提取液；

(5)用乙醇分别沉降步骤(4)得到的胞外多糖提取液和胞内多糖提取液中的多糖，然后离心分离得到沉淀，脱色透析干燥后，分别制得云芝胞内提取物和云芝胞外多糖提取物；

步骤(4)中所述的胰蛋白酶和Sevage法，包含如下步骤：

①将步骤(3)制备得到的浓缩液分别调pH至8.0；然后将胰蛋白酶加入浓缩液中充分混合并37℃振荡30～60min，再水浴灭酶10～15min，冷却至室温；

②去蛋白后的浓缩液加入0.2倍体积的氯仿正丁醇混合液，剧烈振荡30～40min；然后离心，弃取蛋白层及有机溶液，回收上清液；

③重复步骤②2～3次，得到去蛋白后的多糖提取液。

2.根据权利要求1所述的云芝多糖提取物的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的脱脂方法为：菌丝体粉末与石油醚按体积比为1:2混匀，振荡或搅拌处理2～3d，脱去菌丝体中的脂质，离心留沉淀；重复脱脂1～2次。

3.根据权利要求1所述的云芝多糖提取物的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的超滤条件为进膜压力为10bar，通量3～5L/min，物料温度22℃。

4.根据权利要求1所述的云芝多糖提取物的制备方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的热水浸提的条件为：料液比为1:30，提取时间为2～3h，提取温度为90℃，提取次数为1～3次。

5.根据权利要求1所述的云芝多糖提取物的制备方法，其特征在于：

步骤(5)中所述的脱色透析干燥的方法为：用水溶解沉淀并调节多糖溶液pH至8.0；然后滴加质量分数为30％的H₂O₂溶液，于50～55℃水浴保温2～3h，对其进行氧化脱色处理；然后将多糖溶液装入截留分子量为8000～15000Da的透析袋中透析2～3d，每8～10h更换一次水；对透析完成后的溶液进行浓缩，并真空冷冻干燥，获得云芝多糖提取物。

6.根据权利要求1所述的云芝多糖提取物的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的云芝(Coriolus versicolor)液体深层发酵培养的方法，优选包含如下步骤：

(Ⅰ)将云芝斜面母种活化培养后转接至斜面固体培养基中，24～27℃培养10～15d，直至菌丝铺满斜面为止，得到云芝斜面菌种；

(Ⅱ)从步骤(Ⅰ)制备得到的云芝斜面菌种上挑取4～6菌块，接种至200mL的液体发酵培养基中，室温静置24h，待菌块伤口处愈合后，在150rpm，27的条件下振荡培养6d，制得一级种子液；

(Ⅲ)将步骤(Ⅱ)制备得到的一级种子液转入50L种子罐培养二级种子液，接种量为7％，培养温度为27℃，转速为150rpm，罐压为0.05～0.07MPa，通气量1.5m³/h，培养3d后转入500L发酵罐培养，初始培养条件温度，转速及罐压与种子罐相同，通气量为12m³/h，培养3～5d。

7.根据权利要求6所述的云芝多糖提取物的制备方法，其特征在于：

步骤(Ⅰ)所述的斜面固体培养基的配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨1g，(NH₄)₂SO₄2g，MgSO₄·7H₂O 1g，KH₂PO₄1g，琼脂20g，加蒸馏水定容至1000mL，pH调至6.5。

8.根据权利要求6所述的云芝多糖提取物的制备方法，其特征在于：

步骤(Ⅱ)和(Ⅲ)中用于一级种子液和二级种子液培养以及发酵培养的培养基配方为：步骤(1)中所述的云芝液体深层发酵的培养基配方为：葡萄糖50g，NH₄NO₃2g，KH₂PO₄2g，MgSO₄·7H₂O 1g，维生素B₁0.05g，水1000mL，pH 6.5。

9.一种云芝多糖提取物，其特征在于根据权利要求1～8任一项所述的制备方法制备得到。

10.权利要求9所述的云芝多糖提取物在制备降血脂、抗动脉粥样硬化药物或保健食品中的应用。