CN106589083B - 一种治疗酒精性肝病的云芝胞内糖肽活性成分PSK-1c1 - Google Patents
一种治疗酒精性肝病的云芝胞内糖肽活性成分PSK-1c1 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种云芝胞内糖肽活性成分PSK‑1c1,以及活性成分PSK‑1c1的提取纯化方法,和应用方法。该成分可用于治疗酒精性肝病,成人(60kg体重),每次服用2~3mg,每日2~3次,服用1~3个月即可见效,能降低血清ALT、AST、胆固醇和游离脂肪酸等指标,起到良好的治疗效果。
Description
技术领域
本发明属于药学领域,具体涉及一种云芝胞内糖肽的活性成分,及利用该成分治疗酒精性肝病的方法。
背景技术
酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是长期大量饮用酒精饮品造成的中毒性肝损伤。随着社会的快速发展和人类物质生活水平的提高,酒及酒制品在全球的消费量逐年升高,酒精性肝病的发病率也在逐渐增高。过量摄入酒精已经成为全世界范围发病及死亡的一个重要原因,也是全球导致慢性和急性肝病的主要原因之一,长期过量或一次性大量饮用酒制品会导致酒精性肝病,造成将近4%的死亡率,现已成为一个重要的社会问题。世界卫生组织(WHO)最新统计表明每年有250万人死于不当饮用酒制品;酒精的作用可能会导致60种不同类型的疾病(如心脏病、海默症、中风、呼吸系统疾病、肥胖症、骨癌)。目前,发达国家中患酒精性肝病的患者比例在所有疾病中最高,得病率高达84%,其中25%左右可发展为肝硬化。2007年美国国立卫生院在对2万多名死于肝硬化的患者调查显示与酒精相关的患者大于死亡人数一半以上;某学者在对意大利某地区的成人和青少年的调查中发现,因饮酒而引起的肝病患者占该地区总肝病患者人数的一半;Hornyak等预计2005-2050年,墨西哥将会有210多万慢性肝病患者,其中ALD占比最多;在葡萄牙,因ALD住院的患者占总肝病人数的63%,并且,酒精性肝病病程10年以上的死亡率可达60%。
发展中国家的ALD被预计在疾病中所占的比例会迅速增加。据统计,在我国,酒精性肝损伤已变为仅低于病毒性肝病的第二大肝病病因。解放军302医院对2002-2013年之间住院的肝病患者统计后发现,在12年期间,酒精性肝病的人数在肝病患者总人数占比增加了3%;我国中西部和南部省份的ALD患者为总人数的4.3%-6.5%;浙江某医院对2000-2004年间的住院肝病病人调查,发现该5年内的酒精肝发病率呈递增趋势。
目前,在临床上尚没有理想的治疗酒精性肝损伤的药物。
对于酒精性肝病的重症者,糖皮质激素是最多研究也是最有效果的药。但是激素治疗死亡率仍很高,特别是患者会伴发肾功能衰竭。激素对于是否能延缓肝硬化、改善生存率尚不明确。
己酮可可碱是一种非选择性的磷脂酶抑制剂,它能够改善红细胞对变形的应急应答,还能通过抑制TNF-α基因的转录抑制炎症反应,从而治疗酒精性肝病。
丙基硫氧嘧啶、秋水仙碱、磷脂酰胆碱、抗内毒素剂、降脂药、水飞蓟素等药物在临床上也先后用来尝试治疗酒精性肝损伤,但是都有许多局限性。严重的患者可能要进行肝脏移植手术。
联苯双酯是合成的五味子丙素类似物,是本国首次创造的具有新结构的、高效低毒的抗肝炎药。联苯双酯可减轻肝组织的结构损伤,具有不错的保肝降酶作用;其可通过增进游离型核糖体蛋白和RNA含量,促进细胞固有结构蛋白质的合成,强化细胞膜的结构和功能,从而促进肝细胞对毒性物质的抵抗和损伤修复能力。联苯双酯主要通过改善肝细胞的结构和功能来降低天门冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)的水平,而血清ALT、AST的变化是反映酒精性肝损伤最明显的指标。此外,联苯双酯可显著抑制肝细胞脂肪的变性、炎细胞的浸润和纤维组织的增生。
目前国内外研究发现,在许多微生物、植物和动物中,存在着天然的抗酒精性肝病物质,如多糖类、黄酮类、萜类、肽类和酚类物质,在该类天然食物资源中寻找预防和治疗酒精性肝损伤的活性功能因子,开发功能食品和药品,意义十分重大。
发明内容
本发明采用发酵获得的云芝胞内糖肽提取活性成分,用于治疗酒精性肝病,能降低血清ALT、AST、胆固醇和游离脂肪酸,起到良好的治疗效果。
①云芝菌丝体的制备:
斜面活化:取4℃保存的云芝斜面,于无菌超净台中接种于PDA斜面,28℃培养5d,并观察菌体生长情况;一级种子培养:将云芝菌丝块从PDA斜面接种到云芝种子培养基中,置于28℃摇床中,180rpm培养4d;二级种子培养:将云芝一级种子按10%(v/v)的接种量接种于400L发酵罐中,在温度28℃、转速180rpm、通气量1v/v·m的条件下培养4d;发酵培养:将400L发酵罐中培养4d后的云芝种子液通过管道全部接种于4t发酵罐中,在温度28℃、转速180rpm、通气量1v/v·m的条件下培养3d。发酵结束后,发酵液采用离心机8000rpm离心10min,沉淀即为菌丝体,50℃真空干燥后粉碎,得到云芝菌丝体。
②采用分步醇沉的方法将云芝胞内糖肽分为三个组分。
(1)取20kg云芝发酵菌丝体,加入160L水,90℃水浴4h,离心,收集上清;
(2)将离心后沉淀中加入24L水中,90℃水浴2h,离心,收集上清;
(3)将两次上清合并,60℃旋转蒸发至浓缩液比重为1.2;
(4)加入95%乙醇,调浓缩液的乙醇终浓度为43%,4℃过夜;
(5)离心,分别收集上清和沉淀,沉淀60℃真空干燥,命名为PSK-1。
③PSK-1的纯化
用Superdex 75 10/300GL凝胶色谱柱进行分离纯化。先用水将柱子平衡2个柱体积。上样浓度为10mg/mL,进样0.5mL,以水为洗脱液,洗脱流速为0.5mL/min,自动收集器收集样品,每管1mL,洗脱1.5个柱体积。根据苯酚-硫酸法测得的吸光度(A490)值画洗脱曲线,依据出峰位置合并收集第3个峰的洗脱液,浓缩,冷冻干燥,得到分离纯化后的多糖PSK-1c1。
④云芝胞内糖肽活性成分PSK-1c1的结构确定。
PSK-1c1的主链主链为→1-β-Glcp-(4→1)-α-Glcp-(4→1)-β-Glcp-(4→1)-β-Galp-6→,支链连在β-Glcp的C-6位上,为α-Xylp-(1→4)-β-Xylp-(1→6)-β-Galp-(1→3)-α-Manp-1→;结构示意图如说明书附图1所示。
⑤云芝胞内糖肽活性成分PSK-1c1用法与用量
成人(60kg体重),每次服用4~5mg,每日2~3次,服用2周~3个月即可见效。
应用本发明的云芝胞内糖肽活性成分PSK-1c1制备成口服药时,可按照常规方法制备成散剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、茶剂、混悬剂、流体浸膏剂、液体剂、糖浆剂等,制剂过程中,必要时可应用常规的制剂化载体,如赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、矫味剂、矫味剂等,必要时,可用适当的包被剂制备包衣。
云芝胞内糖肽活性成分PSK-1c1不仅限于医药用途,可作为功能性食品、保健品、健康食品和营养补充剂等摄取,它们可以茶、酒、饮料、饼干、糖果等其他多种形式摄取。
以下通过实施例对本发明进行说明,但本发明并不局限于此。
附图说明
图1云芝胞内糖肽活性成分PSK-1c1结构示意图
图2云芝胞内糖肽活性成分PSK-1c1对ALT的作用
图3云芝胞内糖肽活性成分PSK-1c1对AST的作用
图4云芝胞内糖肽活性成分PSK-1c1对甘油三酯的作用
图5云芝胞内糖肽活性成分PSK-1c1对MDA的作用
图6云芝胞内糖肽活性成分PSK-1c1对NEFA的作用
图7云芝胞内糖肽活性成分PSK-1c1对总胆固醇的作用
图8云芝胞内糖肽活性成分PSK-1c1对低密度脂蛋白的作用
图9云芝胞内糖肽活性成分PSK-1c1对高密度脂蛋白的作用
图2-9中control表示正常对照组,EtOH表示模型组,L表示活性成分PSK-1c1低剂量组,H表示活性成分PSK-1c1高剂量组,云芝糖肽表示喂以市售云芝胞内糖肽胶囊内容物的组。
具体实施方式
实施例1
收集内科收治的酒精肝患者60例,分为云芝胞内糖肽对照组和活性成分实验组,其中每组30例。云芝胞内糖肽对照组男20例,女10例,平均年龄(48.41±1.32)岁;活性成分实验组男20例,女10例,平均年龄(50.38±1.44)岁。所有患者符合酒精肝的诊断标准,患者除酒精肝以外无其他肝脏疾病,无黄疸或腹水症状,患者无重要脏器的重大疾病,无恶性肿瘤,无内分泌系统疾病及血液系统疾病,所有患者在实验前3个月未服用过相关药物,对实验药物无过敏。
两组患者入院后均给予常规护理,嘱患者按时服药,并改变不良生活习惯等。云芝胞内糖肽对照组给予云芝胞内糖肽胶囊0.5g/次,tid;活性成分实验组给予PSK-1c1 3mg/次,tid。治疗均连续2周。
患者血清检查:取治疗前后所有患者清晨空腹静脉血,由检验科进行血清样本检验,检测指标有:谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、谷氨酰转移酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、肝纤维化4项(包括层黏蛋白(LN)、透明质酸(HA)、III型前胶原(PCIII)、IV型胶原(CⅣ))。
患者临床疗效判定:治疗后对患者疗效进行判定。临床症状、体征完全消失,肝功能、血脂、影像学的各项检查均正常为痊愈;临床症状及体征明显改善,肝功能、血脂等指标下降超过50%为显效;临床症状、体征好转,肝功能、血脂下降超过20%但小于50%为有效;临床症状、体征未见明显好转甚至加重,各项指标检查均无改善为无效,计算患者的总有效率。
治疗后,患者肝功能各指标均显著下降,与治疗前相比,差异具有统计学意义(P<0.05),与云芝胞内糖肽对照组相比,活性成分实验组患者治疗后肝功能各指标下降较为显著,差异具有统计学意义(P<0.05),具体见表1。
表1患者治疗前后肝功能水平比较(U/L)
注:与治疗前相比,*P<0.05;与对照组相比,#P<0.05。
治疗后,患者TC、TG水平均显著下降,与治疗前相比,差异具有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,实验组患者治疗后TC、TG水平下降较为显著,经统计学分析,差异具有统计学意义(P<0.05);具体见表2。
表2患者治疗前后血脂水平比较(IU/L)
注:与治疗前相比,*P<0.05;与对照组相比,#P<0.05。
治疗后,患者肝纤维化各指标均显著下降,与治疗前相比,差异具有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,实验组患者治疗后肝纤维化各指标下降较为显著,经统计学分析,差异具有统计学意义(P<0.05);具体见表3。
表3患者治疗前后肝纤维化水平比较(ng/mL)
注:与治疗前相比,*P<0.05;与对照组相比,#P<0.05。
治疗后,实验组患者的总有效率为96.67%,与对照组患者的总有效率90.0%相比,显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);具体见表4。
表4患者疗效比较(例(%))
注:与对照组相比,#P<0.05。
由以上结果可知,云芝胞内糖肽活性成分PSK-1c1对酒精肝有显著疗效,可明显降低谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、谷氨酰转移酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP),同时对血脂有调节,可显著降低甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC),减缓肝纤维化的进程,且疗效显著高于市售的云芝胞内糖肽胶囊。
实施例2
患者赵某,男,年龄52岁,患有酒精肝和脂肪肝,经三级医院内科确诊,治疗前各项指标为:谷丙转氨酶(ALT)95.8、谷草转氨酶(AST)85.7、谷氨酰转移酶(GGT)170.8、碱性磷酸酶(ALP)150.2、甘油三酯(TG)6.9、总胆固醇(TC)2.4、肝纤维化4项(包括层黏蛋白(LN)220.2、透明质酸(HA)310.5、III型前胶原(PCIII)210.5、IV型胶原(CⅣ))145.7,给予云芝胞内糖肽活性成分PSK-1c1 3mg/次,bid,服用2个月,各项血清指标为谷丙转氨酶(ALT)44.6、谷草转氨酶(AST)45.6、谷氨酰转移酶(GGT)67.8、碱性磷酸酶(ALP)54.4、甘油三酯(TG)5.0、总胆固醇(TC)1.5、肝纤维化4项(包括层黏蛋白(LN)90.2、透明质酸(HA)102.5、III型前胶原(PCIII)81.5、IV型胶原(CⅣ))84.7,患者自述服用云芝胞内糖肽活性成分PSK-1c1后,右上腹胀痛发作减少,原本难以忍受,现在仅偶尔隐痛,食欲改善明显,身重乏力情况有所改善,大便由不成形、粘滞不畅变为基本成型,每日1~2次,比较规律,生活质量较前明显提高,服药期间无不良反应。
实施例3
患者石某,男,年龄68岁,曾因服用抗结核药物导致药物性肝损伤,谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)持续多年超过正常范围;现经三级医院内科确诊为酒精肝伴药物性肝损伤,,给予给予云芝胞内糖肽活性成分PSK-1c1 2mg/次,bid,服用3个月。治疗后各项指标为谷丙转氨酶(ALT)52.7、谷草转氨酶(AST)46.3、谷氨酰转移酶(GGT)77.1、碱性磷酸酶(ALP)59.9、甘油三酯(TG)5.1、总胆固醇(TC)1.5、肝纤维化4项(包括层黏蛋白(LN)81.2、透明质酸(HA)110.5、III型前胶原(PCIII)81.5、IV型胶原(CⅣ))83.3,患者自述服用云芝胞内糖肽活性成分PSK-1c1后,右上腹隐痛偶尔发作,食欲明显改善,自觉身轻体健,大便规律,生活质量较前明显提高,服药期间无不良反应。
实施例4
比较本发明的云芝胞内糖肽活性成分PSK-1c1和市售云芝胞内糖肽胶囊在急性酒精性肝损伤小鼠模型上的治疗作用。
小鼠适应环境(至少1周)后,在实验开始第1d到第15d,所有组均给予正常颗粒饲料喂养;第16d至第20d所有组均给予Lieber-DeCarli正常液体饲料以使小鼠适应液体饲料进食。从第21d开始,正常组(Group 1.CTRL)给予Lieber-DeCarli正常液体饲料,其余各组给予含有5%酒精的Lieber-DeCarli酒精液体饲料。从实验开始第1d到第30d,每天下午对云芝胞内糖肽胶囊对照组(Group 3)和云芝胞内糖肽活性成分PSK-1c1实验组(Group 4-9)小鼠以灌胃的方式分别喂以小鼠体重200mg/kg的云芝胞内糖肽胶囊内容物和不同剂量的云芝胞内糖肽活性成分PSK-1c1(低剂量组:50mg/kg;高剂量组:100mg/kg),正常组(Group1)和模型组(Group 2)喂以小鼠体重10mL/kg 0.5%羧甲基纤维素钠溶液。
在实验开始的第31d清晨6点左右对小鼠进行一次灌胃,模型组灌胃45%(w/v)麦芽糖糊精(保证小鼠摄入热量相同),实验组灌胃31.5%乙醇溶液,所有小鼠均不禁食禁水,灌胃后每30min观察一次小鼠恢复情况。灌胃后9h处死小鼠取材。对小鼠眼眶取血,收集血清(3000rpm,4℃,15min),之后颈椎脱臼处死,摘取肝脏最大和次大肝叶,液氮急冻后,保存于-80℃冰箱用于后续实验。
小鼠实验结束后,测定小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、血清丙二醛含、甘油三酯、总胆固醇、游离脂肪酸等结果。见说明书附图2-9。
图中control表示正常对照组,EtOH表示模型组,L表示活性成分PSK-1c1低剂量组,H表示活性成分PSK-1c1高剂量组,云芝糖肽表示喂以市售云芝胞内糖肽胶囊内容物的组。从图中可以看出,云芝胞内糖肽活性成分PSK-1c1的效果明显优于市售的云芝糖肽胶囊。
Claims (7)
1.一种云芝胞内糖肽活性成分 PSK-1c1,其特征为,PSK-1c1的主链为→1-β-Glcp-(4→1)-α-Glcp-(4→1)-β-Glcp-(4→1)-β-Galp-6→,支链连在β-Glcp的C-6位上,为α-Xylp-(1→4)-β-Xylp-(1→6)-β-Galp-(1→3)-α-Manp-1→ 。
2.一种酒精性肝病治疗剂,其特征为,它包括权利要求1所述的活性成分。
3.一种脂肪肝治疗剂,其特征为,它包括权利要求1所述的活性成分。
4.一种高血脂治疗剂,其特征为,它包括权利要求1所述的活性成分。
5.一种口服药物,其特征为,它包括权利要求1所述的活性成分。
6.一种保健品,其特征为,它包括权利要求1所述的活性成分。
7.一种饮料,其特征为,它包括权利要求1所述的活性成分。
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