CN103614301A - 产水解酶的黑曲霉及其在制备香菇酶解物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株产水解酶的黑曲霉（Aspergullus niger）MJ及其在制备香菇酶解物中的应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏编号：CCTCC NO：M2013329，保藏日期：2013年7月11日。本发明的有益效果主要体现在：（1）黑曲霉是食品工业中常用菌种，不产有害物质，使用安全；（2）水解酶的发酵工艺简单，酶的生产成本低；（3）黑曲霉MJ发酵制备的复合水解酶，对香菇中的蛋白质、核酸和多糖的水解效率高；（4）生产工艺不使用有毒有害原料，环保无污染；（5）产品天然绿色，味道鲜美，营养丰富，保健价值高，应用领域广。

Description

产水解酶的黑曲霉及其在制备香菇酶解物中的应用

（一）技术领域

本发明涉及一株产水解酶的黑曲霉（Aspergullis niger）MJ及其在制备香菇酶解物中的应用。

（二）背景技术

香菇，又名香蕈、香菌、冬菇、厚菇或花菇等，为担子菌纲伞菌目侧耳科香菇属的香蕈（Lentinula edodes）的子实体。香菇是世界第二大食用菌，也是我国特产之一，在民间素有“山珍”之称。香菇肉质肥厚细嫩、味道鲜美、香气沁人、营养丰富，是我国人民餐桌上传统的美味菜肴，具有低脂肪、富含维生素和矿物元素等特点，是一种可增强人体免疫力的健康食品。

香菇不仅是人们理想的美味佳肴，而且具有良好的保健功能和较高的药用价值。经常食用香菇可预防缺乏维生素D而引起的血磷、血钙代谢障碍导致的佝偻病，可预防人体各种粘膜及皮肤炎类疾病。从香菇中提取的多糖，具有健胃保肝、降血糖、降血脂、提高免疫力、抗肿瘤、抗病毒和抗感染等活性，临床应用于治疗慢性病毒性肝炎和癌症的辅助治疗等，药品有香菇多糖片和胶囊、香菇多糖注射液等。

香菇作为中国传统的食用菌，味道鲜营养高，深受人们喜爱。目前各种香菇深加工产品品种已有很多，如香菇罐头、香菇片、香菇精、香菇饮料和香菇米酒等，这些产品主要针对的是香菇的风味和营养价值，但针对香菇的药用和保健功效，仍有进一步开发的余地，以更好地满足市场的需求。

已有研究表明，香菇酶解物可以提高小鼠的免疫功能，改善肠道菌群环境，对肠道功能有一定的调节作用，具有较高的药用和保健功效。已有文献和专利报道采用蛋白酶、纤维素酶和5′-磷酸二酯酶等酶复合水解香菇制备酶解物的报道，这些方法虽然具有水解度高的优点，但是水解需要3种商品酶制剂，生产的成本较高，实际应用难度大。

（三）发明内容

本发明目的是提供一株水解酶产生菌——黑曲霉（Aspergullis niger）MJ，及其在制备香菇酶解物中的应用。利用该菌株发酵制备含蛋白酶、5′-磷酸二酯酶和多糖水解酶等酶的复合水解酶系，直接用于酶解香菇得到酶解物，水解率高达35%以上，酶解物中的氨基酸含量达5.36%，5′-核苷酸含量达0.86%，多糖含量达74.2%。产品味道鲜美，营养丰富，保健功效高，可进一步深加工为香菇调味品或保健食品。

本发明采用的技术方案是：

一株黑曲霉（Aspergullus niger）MJ，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏编号：CCTCCNO：M2013329，保藏日期：2013年7月11日。

本发明所述黑曲霉MJ由土壤中分离和筛选，并经过诱变选育得到的优良菌株。

所述黑曲霉MJ的生长特征如下：在马铃薯固体培养基上，30℃条件下，培养3天，菌丝即可长满，并产生大量孢子。菌丝初期为白色绒毛状，之后逐渐呈黑褐色，菌落背面呈浅黄色。菌丝表层有大量黑褐色分生孢子。显微镜下观察到分生孢子头呈黑褐色放射状，分生孢子梗长短不一，顶囊球形，双层小梗，分生孢子黑褐色球形。

本发明还涉及所述的黑曲霉MJ在微生物发酵制备水解酶中的应用。

具体的，所述应用为：将黑曲霉MJ菌种接种至产酶培养基中，25～32℃培养2～4天，获得含有蛋白酶、5′-磷酸二脂酶和多糖水解酶的发酵液。所得发酵液经离心或过滤除去菌体的清液为水解酶的粗酶液，可以直接应用于酶解制备香菇酶解物；也可以保藏于4℃冰箱15天内使用；也可以经过冷冻干燥，制成干酶粉保藏于4℃冰箱长期使用。

所述产酶培养基按如下组成配制：马铃薯100～300g（煮沸20min过滤留汁液），蔗糖20～60g，水补足至1000mL，pH4～6。

本发明还涉及所述的黑曲霉MJ在微生物酶解香菇制备香菇酶解物中的应用。

具体的，所述应用为：将黑曲霉MJ菌种接种至产酶培养基中，25～32℃培养2～4天，发酵液经固液分离获得水解酶的粗酶液。粗酶液经过1～2倍体积的水稀释或不经稀释，加入足量干香菇粉（过量也可），于25～35℃、100～300r/min条件下酶解8～16h，之后，过滤去除未被酶解的香菇残渣，滤液经浓缩、干燥和粉碎，即得香菇酶解物。

所述产酶培养基按如下组成配制：马铃薯100～300g（煮沸20min过滤留汁液），蔗糖20～60g，水补足至1000mL，pH4～6。

所述菌株在产酶培养前，通常需要先经斜面培养基活化培养，或再经过种子扩大培养，然后用孢子或种子液接入产酶培养基进行产酶发酵。具体的，所述活化及种子培养和产酶发酵方法如下：

（1）将黑曲霉MJ菌种孢子接种于斜面培养基，于25～32℃培养2～3天，得到活化后的黑曲霉MJ菌种；所述的斜面培养基组成为：马铃薯100～200g/L（马铃薯洗净去皮，切成小块，加5倍质量水煮沸20～30min，4层纱布过滤去除马铃薯块）、葡萄糖10～20g/L、NaCl5～10g/L、琼脂15～20g/L，溶剂为自来水，pH4～6；

（2）将步骤（1）活化培养后黑曲霉MJ孢子接种至种子培养基中，于25～32℃、150～250r/min振荡条件下培养1～2天，得种子液；所述种子培养基不含琼脂，其他成分以及配制方法同斜面培养基；

（3）将步骤（2）种子液以2%～10%的体积比的接种量，移种到产酶培养基中，或将步骤（1）的黑曲霉MJ孢子直接接入产酶培养基中，产酶培养基于25～32℃、150～250r/min振荡条件下培养2～4天，得到黑曲霉MJ的发酵液；所述产酶培养基按如下组成配制：马铃薯100～300g（煮沸20min过滤留汁液），蔗糖20～60g，NaCl5～10g，水补足至1000mL，pH4～6。

本发明将香菇去柄烘干粉碎后直接为原料，利用水解活性较高的微生物产生的粗酶液直接进行处理香菇粉，香菇中的蛋白质被部分水解成氨基酸，核酸被部分水解成核苷酸、多糖被部分水解为低聚糖，酶解产物富含氨基酸、核苷酸、香菇低聚糖和多糖，具有较高的营养价值和保健功效，可以作为食品调味剂、营养补充剂和保健食品的原料。

本发明的有益效果主要体现在：（1）黑曲霉是食品工业中常用菌种，不产有害物质，使用安全；（2）水解酶的发酵工艺简单，酶的生产成本低；（3）黑曲霉MJ发酵制备的复合水解酶，对香菇中的蛋白质、核酸和多糖的水解效率高；（4）生产工艺不使用有毒有害原料，环保无污染；（5）产品天然绿色，味道鲜美，营养丰富，保健价值高，应用领域广。

（四）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：产酶微生物的富集、分离、筛选和诱变育种

市售新鲜香菇切碎，称取25g到250mL三角瓶中，加入刚采集的菜地土壤5g，加少量水搅拌均匀，置于30℃的恒温箱培养5天，进行产酶微生物的富集。

将长满霉菌的上述富集物用无菌水稀释后涂布于平板培养基上，于30℃的生化培养箱中培养3天至大量菌落形成。挑取颜色和形态不同的霉菌菌落孢子接种于斜面培养基上，斜面培养基于30℃恒温培养3天，得长满孢子的斜面菌种。

用接种环分别挑取上述菌株斜面菌种的孢子，接入50mL产酶培养基中（250mL三角瓶装），于30℃、200r/min振荡条件下培养4天后，将发酵液用4层纱布过滤，取10mL滤液到一只50mL的三角瓶中，加入1g香菇粉。三角瓶用保鲜膜封口后于30℃、200r/min的水浴振荡箱中酶解10h。酶解结束后，酶解液用4层纱布过滤，去除未被酶解的残渣。

用甲醛法测定香菇酶解液中的氨基酸含量，过碘酸氧化法测定5′-核苷酸含量，硫酸—苯酚法测定多糖含量，比较不同菌株所产水解酶对香菇水解能力的大小。经过比较，一个霉菌M9菌株产酶水解香菇得到的酶解物中，氨基酸、5′-核苷酸和多糖的综合含量相对较高，对香菇的水解率达到18.4%。

依据M9菌株的菌落、菌丝和孢子的形态特征初步判断为曲霉菌，采用18S rDNA序列分析方法对菌株M9进行鉴定，确定其为一株黑曲霉（Aspergullis niger）。

对野生菌株黑曲霉M9进行了紫外照射诱变选育，经过筛选，获得一个菌株MJ，其产酶水解香菇制备的酶解物中，氨基酸、5′-核苷酸和多糖的综合含量较野生菌株有所提高，对香菇的水解率达到25.7%，较野生菌株提高了39.7%。将该菌株提交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCC No：M2013329，保藏日期：2013年7月11日。

所述的平板培养基和斜面培养基的组成相同，按如下组成和方法配制：马铃薯洗净去皮，切成小块，称取200g，加自来水1000mL煮沸30min，4层纱布过滤去除马铃薯块，滤液补足到1000mL，再加入葡萄糖20g、NaCl5g、琼脂18g，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min。

所述的产酶培养基按如下组成配制：马铃薯200g，蔗糖20g，NaCl5g，水补足至1000mL，pH6，配制方法同平板培养基。

实施例2：用于制备香菇酶解物的水解酶发酵

以黑曲霉MJ为产酶菌种，经过培养基组成和发酵条件优化后，制备的粗酶液水解香菇，酶解物中氨基酸、5′-核苷酸和多糖的综合含量有一定幅度提高，对香菇的水解率达到36.8%，较未优化前提高了43.2%，优选的制备方法如下：

（1）将试管斜面保藏的黑曲霉MJ菌种接种于斜面培养基，斜面于30℃生化培养箱中培养2天。所述的斜面培养基按如下组成和方法配制：马铃薯洗净去皮，切成小块，称取200g，加自来水1000mL煮沸30min，4层纱布滤去马铃薯块，滤液补足到1000mL，再加入葡萄糖20g、NaCl5g、琼脂18g，pH6，加热至各成分溶化后分装试管，加塞后121℃高压蒸汽灭菌20min。

（2）用接种环挑去步骤（1）活化培养后黑曲霉MJ孢子至种子培养基中，种子培养基于30℃、200r/min振荡条件下培养2天，得种子液；所述种子培养基除不含琼脂外，其他成分和配制方法同斜面培养基。培养基分装于250mL三角瓶，每瓶50mL，八层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。

（3）步骤（2）种子液以5%的体积比接种量接至产酶培养基，30℃、200r/min振荡条件下培养3天，得到含多种水解酶的发酵液；所述产酶培养基按如下组成配制：马铃薯300g（煮沸20min过滤留汁液），蔗糖40g，NaCl8g，水补足至1000mL，pH6。培养基分装于250mL三角瓶，每瓶50mL，八层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。

（4）将步骤（3）黑曲霉MJ的发酵液，用4层纱布过滤除去菌体，所得清液即为用于制备香菇酶解物的水解酶液。

所得水解酶液可以用于制备香菇酶解物，可以立即使用；也可以保藏于4℃冰箱15天内使用；也可以经过冷冻干燥制成干酶粉，保藏于4℃冰箱长期使用。

实施例3：香菇酶解物的制备

将市售新鲜香菇去柄洗净，85℃的烘箱中烘干24h，用粉碎机将其充分粉碎。将实施例2中制备的酶液50mL于250mL三角瓶中，加入10g香菇粉，三角瓶用保鲜膜封口后，于30℃、200r/min的水浴振荡箱中生物转化12h。酶解液用4层纱布过滤去除未被酶解的残渣，滤液经减压浓缩，真空干燥后粉碎，得香菇酶解物3.68g，计算出水解得率为36.8%。

将上述方法制得的香菇酶解物用茚三酮比色法测定其氨基氮含量，过碘酸氧化法测定5′-核苷酸含量，硫酸—苯酚法测定多糖含量。结果表明：本方法制得的香菇酶解物中，氨基酸含量为5.36%，5′-核苷酸含量为0.84%，多糖含量为74.2%。

Claims (3)

1.一株黑曲霉（Aspergullus niger）MJ，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏编号：CCTCCNO：M2013329，保藏日期：2013年7月11日。

2.如权利要求1所述的黑曲霉MJ在微生物发酵制备水解酶中的应用。

3.如权利要求1所述的黑曲霉MJ在微生物酶解香菇制备香菇酶解物中的应用。