CN107459585B

CN107459585B - 一种低分子量银耳多糖的生产方法

Info

Publication number: CN107459585B
Application number: CN201710760049.0A
Authority: CN
Inventors: 张天萌; 郭文逸; 孙劭靖; 郭学平
Original assignee: Huaxi Biotechnology Co Ltd; Shandong Bloomage Hyinc Biopharm Co Ltd
Current assignee: Huaxi Biotechnology Tianjin Co ltd; Bloomage Biotech Co Ltd
Priority date: 2017-08-30
Filing date: 2017-08-30
Publication date: 2019-11-19
Anticipated expiration: 2037-08-30
Also published as: CN107459585A

Abstract

本发明提供了一种低分子量银耳多糖的生产方法，利用发酵法生产的银耳多糖发酵液，通过醇沉、酸解、脱色、除蛋白、精制、干燥等步骤获得低分子量银耳多糖产品。通过酸处理将破壁和水解合二为一，简化操作，产率可达26g/L，制备得到的银耳多糖相对分子量低于100 kDa，含量大于80%，蛋白质含量小于0.5%，产率高、含量高、杂质少，在医药与日化领域具有广泛用途。

Description

一种低分子量银耳多糖的生产方法

技术领域

本发明涉及一种银耳多糖的生产方法，具体涉及一种低分子量银耳多糖的生产方法及其产品。

背景技术

银耳多糖为银耳中的主要活性物质，无甜味，易溶于热水，水溶液有旋光性，无变旋现象。大多数银耳多糖是以α-(1→3)键连接的甘露糖为主链，主要由木糖、葡萄糖、岩藻糖、甘露糖和葡萄糖醛酸等构成。

银耳多糖具有卓越的保湿锁水能力，应用于护肤类化妆品，具有修复表皮、增加表皮含水量的功能，提高角质层水分含量，提高皮肤电导率积分值，保水能力，降低水释放常数，能提高皮肤的屏障功能，防止水分从皮肤蒸发。而且，银耳多糖具有良好的润滑性和成膜性，添加银耳多糖的护肤品涂抹时润滑感明显，具有良好的手感，可在皮肤表面形成一层均匀的薄膜，使皮肤具有良好的滑爽感和湿润感，不收缩，干爽不紧绷，对皮肤起到保护作用。在护发品产品中，可以在头发表面形成一层保护膜，起到保湿、润滑，消除静电。此外，银耳多糖还具有一定的清除羟基自由基的能力，可作为抗衰老成分应用到化妆品中。

银耳多糖在子实体、孢子、发酵液和细胞壁中都有存在。目前市场上的产品主要来源于银耳子实体，孢子发酵法是利用银耳孢子为菌种进行液体发酵，发酵液中含有孢外多糖及银耳孢子，而银耳孢子中含有大量的孢内多糖，已有报道中，利用超声或超高压破壁等方法，使得孢内多糖释放，但是这些方法强度大，设备要求高，不利于工业化生产，如何找到更高效的方法进行破壁提取孢内多糖是当务之急。

此外，常规提取获得的银耳多糖，分子量高，存在溶解度低、溶液黏度大、不易被生物体吸收并发挥生物学活性，具有一定的缺陷。而低分子银耳多糖，除具有良好的保湿能力外，易被吸收，能够给皮肤提供深层保湿的作用，故低分子量银耳多糖应用更方便、广泛。多糖的水解方法目前主要有三大类：化学降解法、酶降解法和物理降解法。酸水解法是降解多糖的传统方法。多糖在酸性溶液中不稳定，会使糖苷键水解，发生糖苷键的断裂，即长链的部分水解，形成许多聚合度不等的片段。盐酸是水解多糖的常用酸，盐酸浓度较高时，易使糖的结构受到破坏，从而导致抗氧化活性降低，而盐酸浓度较低则降低酸解速度，降低效率。同时，水解温度对降解速度也有较大影响，在一定范围内，随反应温度的提高降解速度加快，但如果水解温度过高，同样易使糖的结构受到破坏。因此，研究获得一种最佳的酸解条件是必要的。

发明内容

为了降低银耳多糖分子量，解决杂质多、产率低的问题，本发明提供了一种低分子量银耳多糖的生产方法及纯度高的低分子量银耳多糖。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种低分子量银耳多糖的生产方法，采用以下步骤：

（1）醇沉：用乙醇沉淀银耳孢子发酵液过滤，沉淀即为粗品；

（2）酸解：将上述粗品用水溶解，加入稀盐酸酸解，得酸解液；

（3）脱色：将酸解液用活性炭吸附，过滤得滤液；

（4）除蛋白：调节滤液pH值至碱性，处理后再次过滤，最后经0.22μm的滤芯精滤，得精滤液；

（5）精制：用乙醇沉淀精滤液，并用乙醇反复洗涤沉淀；

（6）干燥：将洗涤后的沉淀进行真空干燥得低分子量银耳多糖产品。

所述步骤（1）银耳孢子发酵液pH值为4.0-8.0，银耳多糖的含量为10-20 g/L，发酵液中银耳多糖的分子量大于1000 kDa。

所述步骤（1）银耳孢子发酵液中添加氯化钠，氯化钠添加量为3-5%（w/v）；加入乙醇的浓度为90-95%（v/v），用量为发酵液的2-3倍。

所述步骤（2）溶液黏度为8000-15000mPa.s；盐酸终浓度为0.2 mol/L；酸解时间为4-12 h，酸解温度为70-90℃。

所述步骤（3）活性炭用量为0.5-2%（w/v），粒径为200目，吸附pH值为5-6，吸附温度为55-65℃，吸附时间为1-2 h。

所述步骤（4）滤液pH值调节至10.5以上；处理时间为1-2h。

所述步骤（5）乙醇浓度为90-95%（v/v），用量为精滤液体积的3-4倍。

所述步骤（6）真空干燥的温度为小于40℃。

所述低分子量银耳多糖产品中总糖含量大于80%，分子量小于100KDa；蛋白质含量小于0.5 %（w/w），水分含量小于10%。

本发明具有以下优点：

本发明利用发酵法生产的银耳多糖发酵液生产低分子量银耳多糖，发酵液中含有孢外多糖，而银耳孢子内含有孢内多糖，通过酸处理，既可以使孢子破壁释放孢内多糖，又可以降低孢外或孢内多糖分子量得到低分子银耳多糖，将破壁和水解合二为一，简化操作，提高效率。

发酵液中杂质多为蛋白质及发酵液残留物质，经初步乙醇沉淀得到的多糖粗品，可去除培养基中残留的小分子杂质，在醇沉步骤中加入氯化钠以利于大分子物质沉淀。经酸解后，通过活性炭吸附可去除颜色物质等杂质；在吸附过程中进行加热，可对大分子蛋白质进行热变性絮凝为沉淀，经过滤可去除，同时碱变性可进一步去除蛋白。

本发明通过控制盐酸浓度、酸解温度与酸解时间对发酵液进行酸解，生产的低分子量银耳多糖产率高、含量高、杂质少，操作简便。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 低分子量银耳多糖的制备

（1）醇沉：将4%（w/v）氯化钠加入4L银耳孢子发酵液中，充分溶解，以发酵液体积2.5倍的95%乙醇沉淀获得粗品；

（2）酸解：将上述粗品溶于水中，调至黏度为12000 mPa.s，加入盐酸至浓度为0.2mol/L，在70℃下酸解12h；

（3）脱色：将步骤（2）酸解液用40% NaOH调节pH值为5.5，加入1%（w/v） 200目活性炭，在55℃下吸附2 h后，以板框过滤得滤液；

（4）除蛋白：调节滤液pH至11.0，1h后以板框过滤，经0.22μm的聚醚砜滤芯精滤，得精滤液；

（5）精制：用滤液体积3倍的95%乙醇沉淀精滤液，用95%乙醇反复洗涤沉淀3次；

（5）干燥：将洗涤后的沉淀在35℃下进行真空干燥，得低分子量银耳多糖产品。

实施例2低分子量银耳多糖的制备

（1）醇沉：将5%（w/v）氯化钠加入4L银耳孢子发酵液中，充分溶解，以发酵液体积3倍的93%乙醇沉淀获得粗品；

（2）酸解：将上述粗品溶于水，调至黏度为10000 mPa.s，加入盐酸至浓度为0.2mol/L，在75℃下酸解10 h；

（3）脱色：将步骤（2）酸解液用40% NaOH调节pH值为5.8，加入1%（w/v） 200目活性炭，在60℃下吸附1.5 h后，以板框过滤，得滤液；

（4）除蛋白：调节滤液pH至11.0，2h后以板框过滤，经0.22μm的聚醚砜滤芯精滤，得精滤液；

（5）用滤液体积4倍的93%乙醇沉淀精滤液，反复洗涤沉淀3次；

（6）干燥：将洗涤后的沉淀在30℃下进行真空干燥得低分子量银耳多糖产品。

实施例3低分子量银耳多糖的制备

（1）醇沉：将3%（w/v）氯化钠加入4L银耳孢子发酵液中，充分溶解，以发酵液体积3倍的90%乙醇沉淀获得粗品；

（2）稀酸酸解：将上述粗品溶于水，调至黏度为10000 mPa.s，加入盐酸至浓度为0.2 mol/L，在80℃下酸解8h；

（3）脱色：将步骤（2）酸解液用40% NaOH调节pH值为6.0，加入2%（w/v） 200目活性炭，在65℃下吸附1 h后，以板框过滤，得滤液；

（4）除蛋白：调节滤液pH至11.0，1h后以板框过滤，经孔径0.22μm的聚醚砜滤芯进行精滤，得精滤液；

（5）精制：用滤液体积5倍的90%乙醇沉淀精滤液，反复洗涤沉淀3次；

（6）干燥：将洗涤后的沉淀在25℃下进行真空干燥得低分子量银耳多糖产品。

实施例4低分子量银耳多糖的制备

（1）醇沉：将4%（w/v）氯化钠加入4L银耳孢子发酵液中，充分溶解，以发酵液体积3倍的93%乙醇沉淀获得粗品；

（2）酸解：将上述粗品溶于水，调至黏度为9000 mPa.s，加入盐酸至浓度为0.2mol/L，在85℃下酸解6h；

（3）脱色：将步骤（2）酸解液用40% NaOH调节pH值为6.0，加入1.5%（w/v） 200目活性炭，在65℃下吸附1 h后，以板框过滤，得滤液；

（4）除蛋白：调节滤液pH至11.0，1.5h后以板框过滤，经0.22μm的聚醚砜滤芯精滤，得精滤液；

实施例5低分子量银耳多糖的制备

（1）醇沉：将5%（w/v）氯化钠加入银耳孢子发酵液中，充分溶解，以发酵液体积3倍的95%乙醇沉淀获得粗品；

（2）稀酸酸解：将上述粗品溶于水，调至黏度为8000 mPa.s，加入盐酸至浓度0.2mol/L，在90℃下酸解4h；

（3）脱色：将步骤（2）酸解液用40% NaOH调节pH值为6.0，加入0.5%（w/v） 200目活性炭，在60℃下吸附1h后，以板框过滤，得滤液；

（5）精制：用滤液体积4倍的93%乙醇沉淀精滤液，反复洗涤沉淀3次；

实施例6银耳多糖产品质量检测

6.1 低分子量银耳多糖分子量测定

采用多角度光散射（MALS）法测定产品中低分子量银耳多糖重均相对分子量（Mw），以两平行测定结果取平均值。

6.2 低分子量银耳多糖含量测定

采用苯酚硫酸法测定产品中低分子量银耳多糖含量。

标曲制备：准确称取葡萄糖100 mg，加入20 mL蒸馏水溶解，转移至250 mL容量瓶中，加水至刻度，用前稀释10倍，分别吸取0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mL于具塞试管中，各以蒸馏水补至2.0 mL。

样品制备：称取250 mg样品加入20 mL蒸馏水溶解，转移至50 mL容量瓶中，加水定容至刻度作为贮备液，用前量取贮备液4mL，置50 mL容量瓶中，加水至刻度，测前稀释10倍，取2mL于具塞试管中。

测定：将以上标准溶液与样品稀释液，加入6%重蒸酚1.0 mL及浓H₂SO₄ 5.0 mL，摇匀冷却。室温反应20 min后于490 nm测OD，以2.0 mL水按同样显色操作为空白，以糖浓度为纵坐标，以吸光度值为横坐标，得标准曲线及回归方程：y=85.522x-4.2998 (R²=0.9993)。由标曲得多糖浓度，计算产品中低分子量银耳多糖含量，结果如表1所示。

6.3 蛋白质含量测定

采用考马斯亮蓝法测定产品中蛋白质含量：取考马斯亮蓝G250 0.lg，加乙醇50mL溶解后，加磷酸100mL，加水稀释至1000mL，混匀。滤过，取滤液，即得，用前过滤。对照品溶液取牛血清白蛋白（BSA），加水溶解并制成每l mL中含l mg的溶液。

供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备。测定法精密量取对照品溶液0.00 mL、0.01mL、0. 02mL、0.04mL、0.06mL、0.08mL、0.10 mL，分别置具塞试管中，各加水至0.1mL，再分别加入考马斯亮蓝G250溶液5.0mL，混匀，立即在595 nm的波长处测定吸光度；同时以无BSA溶液管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算线性回归方程：y=0.0093x+0.05801(R²=0.9991)。另精密量取供试品溶液适量，同法测定，从线性回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度，并乘以稀释倍数，即得。

表1 酸解前后银耳多糖的理化性质

由表中数据看出，本发明对银耳发酵液进行酸解处理后，孢子破壁释放孢内多糖，提高了银耳多糖收率，产率可达26g/L。制备的低分子量银耳多糖相对分子量低于100 kDa，含量大于80%，蛋白质含量小于0.5%，低分子量银耳多糖含量高、杂质少，在医药与日化领域具有广泛用途。

Claims

1.一种低分子量银耳多糖的生产方法，其特征在于，采用以下步骤：

（1）醇沉：用乙醇沉淀银耳孢子发酵液，沉淀即为粗品；

（3）脱色：将酸解液用活性炭吸附，过滤得滤液；

（5）精制：用乙醇沉淀精滤液，并用乙醇反复洗涤沉淀；

（6）干燥：将洗涤后的沉淀进行真空干燥得低分子量银耳多糖产品；

步骤（1）中，发酵液中银耳多糖的分子量大于1000 kDa；

步骤（2）溶液黏度为8000-15000 mPa.s；盐酸终浓度为0.2 mol/L；酸解时间为4-12 h，酸解温度为70-90℃。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）银耳孢子发酵液pH值为4.0-8.0，银耳多糖的含量为10-20 g/L。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）的银耳孢子发酵液中添加氯化钠，氯化钠添加量为3-5%（w/v）；加入乙醇的浓度为90-95%（v/v），用量为发酵液的2-3倍。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）活性炭用量为0.5-2%（w/v），粒径为200目，吸附pH值为5-6，吸附温度为55-65℃，吸附时间为1-2 h。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将步骤（4）滤液pH值调节至10.5以上；处理时间为1-2 h。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）乙醇浓度为90-95%（v/v），用量为精滤液体积的3-4倍。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（6）真空干燥的温度为小于40℃。