CN111647093A

CN111647093A - 一种银耳多糖的制备方法

Info

Publication number: CN111647093A
Application number: CN202010521478.4A
Authority: CN
Inventors: 刘江云; 单佳晶; 李雅丽; 李冉
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2020-06-10
Filing date: 2020-06-10
Publication date: 2020-09-11

Abstract

本发明公开一种银耳多糖的制备方法，采用分子量大于1500kD的均一银耳多糖原料，在0.05–0.15mol/L酸度范围和70–100℃温度范围内进行水解0.5‑10小时，获得在10‑1000kDa范围的特定分子量的银耳多糖。该银耳多糖酸水解产物的分子量采用高效分子排阻色谱法检测，并采用紫外显色法测定其含量，所制得的银耳多糖是一种α‑(1→3)‑D‑甘露糖为主链的酸性杂多糖，银耳多糖酸水解产物完整保留了原型银耳多糖的结构单元。该方法可获得分子量可控、均一性好的银耳多糖水解产物，具有操作简便、容易控制、适于工业化生产等优点，可应用于食品、化妆品、药品等领域。

Description

一种银耳多糖的制备方法

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种银耳多糖的制备方法。

背景技术

银耳(Tremella fueiforms Berk)，又称白木耳、雪耳、银耳子等，是药食两用的传统中药材，味甘、淡，性平、无毒，具有提高免疫调节能力，辅助抑制肿瘤，延缓衰老，调节血糖、血脂，保护胃黏膜，抗辐射等作用。银耳多糖为银耳主要的功效成分，可从其子实体、孢子体或者深层发酵液中提取得到。银耳多糖的结构复杂，主要是一类以α-(1-3)-D-甘露糖为主链的杂多糖，并含有由木糖、葡萄糖醛酸等多种单糖组成的复杂支链。不同的原料来源、加工工艺制备的银耳多糖在分子量、单糖组成、糖苷键的连接方式等方面存在差异，其表现出来的生物活性不同。由于银耳多糖结构的复杂性，目前市场上缺乏与之相关的专属性质量分析方法，难以比较各种提取技术、加工工艺得到的银耳多糖质量差异，影响其在生产生活各个领域的开发与应用。建立专属性强的质量分析方法，规范银耳多糖的来源及生产工艺，对银耳多糖的生产与质量控制有重要意义。

银耳多糖常作为优良的天然食品增稠剂、化妆品成份、药品原料使用，但其子实体中的多糖分子量一般大于1500kD，水溶液饱和浓度约为1％，粘稠度很高。通过适当降解银耳多糖分子量，可以达到降低粘稠度、提高溶解度的有益效果，获得更广泛的用途。常用的多糖降解方法包括酸水解、过氧化氢氧化降解、酶解、超声和微波等物理降解方法等，其中酸水解法是工业化生产中常用的方法。不同结构类型的多糖，需要研究相应的特定酸水解条件，才有望获得所需的特定分子量规格降解产物。现对银耳多糖的提取方法主要集中于酸水解法、过氧化氢氧化降解、酶解、机械力物理降解等方法制备低分子量银耳多糖或其低聚糖。然而，现有技术只在提取过程中进行低分子量银耳多糖的制备，虽然生产成本较低，但存在着原料和工艺过程参数难控制、终产品分子量分布不均一等问题；此外，现有技术均缺乏原料和产品纯度、分子量分布范围监控等质量控制关键方法。现有公开技术方案中，未见控制降解制备高品质的银耳多糖产品的文献报道。因此，有必要研究开发如何制备高品质的银耳多糖产品。

发明内容

本发明目的是提供一种银耳多糖的制备方法，以获得高品质的银耳多糖。

本发明的一种技术方案是：

一种银耳多糖的制备方法：

(1)选取分子量大于1500kDa的均一银耳多糖原料，制备成0.5％-1.5％的银耳多糖溶液；

(2)在所述银耳多糖溶液中加入无机酸并调节至0.05–0.15mol/L酸度范围，获得银耳多糖酸性水溶液；

(3)将所述银耳多糖酸性水溶液加热至70–100℃进行酸水解0.5-10小时，加入碱溶液中和至pH 5-7，获得银耳多糖水解溶液；

(4)将所述银耳多糖水解溶液浓缩至原溶液体积的4-8倍，加入乙醇，沉淀，过滤，在低于70℃的温度条件下真空干燥，即得在10-1000kDa范围的特定分子量的银耳多糖。

进一步的，步骤(1)中，所述银耳多糖原料由银耳子实体中提取获得。

进一步的，步骤(2)中，所述无机酸为盐酸，所述酸度范围为0.08–0.12moL/L。

进一步的，步骤(3)中，加热温度至80–90℃进行酸水解，酸水解时间为1.0-6.0小时。

进一步的，步骤(4)中，所述浓缩方法为减压浓缩或超滤膜浓缩。

进一步的，所述超滤膜浓缩选用截留分子量3～10kD的超滤膜。

进一步的，步骤(4)中，所述银耳多糖的分子量采用高效分子排阻色谱法检测。

进一步的，所述高效分子排阻色谱法的色谱条件为：选用TSK G4000色谱柱(7.8x300mm)；流动相0.1mol/L(NH₄)₂SO₄，流速0.5–0.6mL/min；示差折光检测器。

进一步的，步骤(4)中，所述银耳多糖的含量采用紫外显色法检测。

进一步的，所述紫外显色法检测的测定方法为：以葡萄糖醛酸作为对照品，采用间羟基联苯法测定酸性糖含量；以葡萄糖作为对照品，采用苯酚硫酸法测定中性糖含量；样品中的总糖含量按酸性糖和中性糖含量总和计算。

本发明提供了一种银耳多糖的制备方法，选用高纯度的均一高分子量银耳多糖为原料，在均相水溶液中选择控制酸水解反应，首次提供了一种制备特定分子量规格(10-1000kDa范围)的均一银耳多糖产品的技术方案。根据对银耳多糖产品的结构特征(包括分子量、单糖组成、红外和NMR结构分析、粘度测定等)研究，在此基础上首次建立了HPSEC法测定银耳多糖分子量、间羟基联苯法和苯酚硫酸法联用紫外显色法测定含量的专属性质量分析方法。该方法可大幅提高生产控制效率，并达到生产过程和质量可控、产品纯度高、重现性好、容易放大生产的目的。

附图说明

图1为本发明所述的一种银耳多糖的制备方法在实施例1中银耳多糖F3样品的高效分子排阻色谱图；

图2为本发明所述的一种银耳多糖的制备方法在实施例1中银耳多糖的高效分子排阻色谱叠加图，其中，TFP、F1–F5依次为银耳多糖原料、银耳多糖F1–F5样品的色谱峰；

图3为本发明所述的一种银耳多糖的制备方法在实施例1中银耳多糖TFP、F1–F5的红外谱叠加图；

图4为本发明所述的一种银耳多糖的制备方法在实施例1中银耳多糖F5的¹H-NMR谱图；

图5为本发明所述的一种银耳多糖的制备方法在实施例1中银耳多糖F5的¹³C-NMR谱图。

具体实施方式

本发明的目的是提供银耳多糖的制备方法，选用分子量大于1500kDa的银耳多糖进行控制酸水解，从而能够制备获得10-1000kDa范围的特定分子量的银耳多糖。并且选用高效分子排阻色谱法(HPSEC)测定银耳多糖分子量，并选用紫外显色法测定含量。具体包括如下步骤：

在本步骤中，银耳多糖可由银耳的子实体、孢子体或者深层发酵液中提取得到，提取方法与银耳多糖原料可从市场上获得。为保证产品的纯度和分子量范围，银耳多糖原料优选由银耳子实体中提取获得，更优选分子量大于1500kDa的均一银耳多糖原料。银耳多糖的常规溶解度为0.5％-1.5％，优选在加热条件下进行配制，优选浓度为1.0％左右。

(2)将银耳多糖溶液，加入无机酸并调节至0.05–0.15mol/L酸度范围，

得到银耳多糖酸性水溶液；

在本步骤中，加入无机酸配制反应液，可选用常规的强酸例如盐酸、硫酸等，其中优选盐酸。酸度范围根据所需银耳多糖产品的具体分子量规格进行实验确定，一般优选酸度范围为0.08–0.12moL/L。

(3)将银耳多糖酸性水溶液加热至70–100℃进行酸水解0.5-10小时，

加入碱溶液中和至pH 5-7，得银耳多糖水解溶液；

在本步骤中，优选加热反应温度80–90℃，酸水解时间优选为1.0-6.0小时。

(4)将银耳多糖水解溶液，浓缩至原溶液体积的4-8倍，加入乙醇，沉淀，过滤，在低于70℃的温度条件下真空干燥，即得在10-1000kDa范围的特定分子量的银耳多糖。

在本步骤中，浓缩方法为减压浓缩或超滤膜浓缩，更优选截留分子量为3～10kD的超滤膜浓缩。为更好地选择具体制备工艺参数和检测银耳多糖产品品质，银耳多糖的分子量采用高效分子排阻色谱法检测，其色谱条件可根据产物分子量范围进行选择，例如具体的色谱柱、流动相、流速、检测器等。高效分子排阻色谱法的色谱条件为：选用TSK G4000色谱柱(7.8x 300mm)；流动相0.1mol/L(NH₄)₂SO₄，流速0.5–0.6mL/min；示差折光检测器。银耳多糖的含量采用紫外显色法检测。根据银耳多糖为酸性杂多糖的结构特征，银耳多糖的紫外显色法含量测定方法为：以葡萄糖醛酸作为对照品，采用间羟基联苯法测定酸性糖含量；以葡萄糖作为对照品，采用苯酚硫酸法测定中性糖含量；样品中的总糖含量按酸性糖和中性糖含量总和计算。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。

首先，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

实施例1

控制酸水解制备银耳多糖。

一种银耳多糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)选取分子量大于1500kDa的银耳多糖(TFP)原料10.0g，用纯净水制备成1.0％(W/V，下同)的银耳多糖溶液，其中，银耳多糖(TFP，批号WSK181117)，为白色固体粉末，由上海辉文生物技术股份有限公司提供，主要提取工艺流程为：取银耳子实体原料，经热水提取，浓缩，脱色，乙醇醇沉，过滤，干燥，研磨，得干燥的银耳子实体多糖粉末。采用G6000色谱柱进行HPSEC分析，测定TFP相对分子量按右旋糖苷计算为3843kD；

(2)在银耳多糖溶液中加入2mol/L HCl并调节至0.10mol/L酸度范围，得银耳多糖酸性水溶液；

(3)将银耳多糖酸性水溶液在90℃恒温水浴进行酸水解，依次在0.5、1.0、1.5、3.0、4.5小时取出200mL反应液，用1mol/LNaOH中和至pH 5-7，得银耳多糖F1-F5水解溶液；

(4)将银耳多糖F1-F5水解溶液，浓缩至约25-50mL，加入4倍体积乙醇至使沉淀，过滤，沉淀在60℃以下减压真空干燥，即得在10-1000kDa范围的银耳多糖F1-F5产物。

在步骤(2)中，如选用酸度为0.01mol/L HCl，则该条件下无法获得降解产物；如选用2mol/L HCl，则发现银耳多糖需要约8小时才能完全降解，推测这主要是因为银耳多糖是复杂网状结构的酸性多糖，因而常规条件难以达到控制降解效果。经反复实验和HPSEC跟踪测试，最终发现，TFP仅在0.05–0.15mol/L HCl范围内才可以有效降解，更高的酸度条件下，反应产物为分子量不均一的低分子量银耳多糖或者寡聚糖。

在明确该反应酸度控制条件下，进一步对相关工艺参数范围进行了考察，优化的其他反应参数范围为：HCl优选酸度范围为0.08–0.12moL/L；反应温度70–100℃，优选范围80–90℃；水解时间0.5-10小时，优选范围1-6小时。在该水解条件下，酸水解反应速率稳定、工艺参数可重复性好、容易实现放大生产和过程控制。此外，实验室制备工艺步骤(4)中选用减压浓缩较为方便，放大生产中也可选用超滤膜浓缩，一般选用截留分子量3～10kD的超滤膜浓缩。

实施例2

银耳多糖的检测分析

为确定实施例1制备的银耳多糖的纯度品质并进行质量监控，本发明研究建立了银耳多糖的分子量和含量测定方法：

(1)平均重均分子量的测定

选用HPSEC法，以系列分子量葡聚糖为标准品进行分子量测定。通过对流动相、温度、流速的探索，发现在(NH₄)₂SO₄盐溶液中多糖样品的基线波动小，峰形好，分离度更高。确定优化后的液相条件为：TSK-gel G4000

PWXL色谱柱(7.8x 300mm)；流动相0.1mol·L-1(NH₄)₂SO₄，流速0.5mL·min^-1；示差折光检测器；柱温30℃；进样量20μL。

称取10mg系列已知重均分子量(Mw)的葡聚糖对照品，用于测定标准曲线；称取TFP及F1-F5样品，分别用流动相配制为1.0mg/mL，备用。

根据分子量适宜范围，分别选用TSK-gel G4000色谱柱(7.8x 300mm)；流动相0.1mol/L(NH₄)2SO₄，流速0.5mL/min；示差折光检测器；柱温30℃；进样量20μL。

分别以葡萄糖、TFP作为最小、最大分子量测定范围的保留时间，采用系列葡聚糖对照品T10～T730测定G4000色谱柱的分子量-保留时间线性范围。以对照品重均分子量的对数(lgMw)对保留时间(tR，min)作线性回归，得回归方程(1)：y＝-0.3267x+10.004(r²＝0.9928)，结果表明在10～

730kD分子量范围内，lgMw与t_R呈良好的线性关系。

此外，选用G6000色谱柱，对更大分子量范围的样品(TFP及F1)进行测定。测定葡聚糖对照品T110～T2000的保留时间，分析发现该条件下的lgMw～t_R线性相关性不佳，改用Mw～t_R作线性回归，得回归方程(2)：y＝

-556.34x+10140.88(r²＝0.9976)，表明在110～2000kD范围内，MW与t_R呈良好的线性关系。

样品的测定：经HPSEC测定分析，银耳多糖样品F2～F5的分子量范围在方程(1)范围内，其保留时间代入回归方程(1)，计算Mw依次为267.3、107.6、25.95和12.23kD；F1的保留时间代入回归方程(2)，测得分子量为1061kD。TFP在G6000的保留时间T为11.32min(小于T2000)，其分子量在线性范围外，采用外推法计算Mw为3843kD。

请参阅图1和图2，图1和图2分别为代表性样品F3、TFP和F1–F5样品叠加的液相色谱图。如图1和2所示，本发明制备方法所得到的样品F1-F5与TFP相同，均为高纯度的均一银耳多糖。

此外，多糖的粘度与分子量相关，也可以通过控制粘度来间接控制产品分子量。请参阅表1，表1为根据Huggins方程和Kraemer方程测定的TFP及F1～F5的特性粘数[η]与分子量相关参数。如表1所示，本发明制备方法可以成功获得分子量范围10-1000kD的特定分子量规格的均一银耳多糖。

表1

(2)紫外比色法测定银耳多糖含量

银耳多糖是一种酸性杂多糖，现有分析方法中未考虑酸性糖的含量分析。为此，本发明参照相关文献，采用间羟基联苯法测定糖醛酸含量，采用苯酚—硫酸法测定中性糖含量。以吸光度(A，525nm)对葡萄糖醛酸质量浓度(C，μg/mL)作线性回归，得方程(3)：A＝9.2273C-0.0057，r²＝0.9994，结果表明在5.065～50.65μg/mL范围内，吸光度与糖醛酸质量浓度线性关系良好。以吸光度(A，490nm)对葡萄糖质量浓度(C，μg·mL^-1)作线性回归，得方程(4)：A＝6.0384C-0.0104，r²＝0.9993，结果表明在10.21～102.1μg/mL的范围内，吸光度与葡萄糖浓度线性关系良好。

样品的测定：将样品吸光度值分别代入回归方程(3)、(4)，计算供试品中糖醛酸、中性糖的含量。请参阅表2，表2为TFP及F1～F5的糖醛酸、中性糖和总糖含量。如表2所示，TFP及F1-F5的糖醛酸含量均在15％～25％之间，中性糖含量在60％～70％，总糖含量在80％～90％。以上结果表明，酸水解样品中，银耳多糖的糖醛酸、中性糖、总糖含量均基本保持一致。

表2

实施例3

银耳多糖的结构分析

为确定本发明中制备的银耳多糖是否保留原型多糖的结构特征，对银耳多糖进行了单糖组成分析、红外和NMR测试。

(1)单糖组成分析

分别称取TFP及F1～F5样品粉末各10mg于具塞玻璃管中，用4mL 4mol·L^-1TFA溶解，分别100℃水解反应8h(TFP和F1)、6h(F2和F3)、4h(F4和F5)；反应溶液减压浓缩除尽TFA，加2mL水溶解，配置成5mg·mL^-1的样品溶液。

称取甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、木糖、岩藻糖各10mg于100mL容量瓶中，用适量纯水溶解，定容，得0.1mg·mL^-1的单糖混标溶液。分别吸取混标溶液和样品溶液各1mL，加入0.5mL 0.3mol·L^-1的NaOH溶液和0.5mol·L^-1的PMP甲醇溶液，混匀，70℃反应100min。冷却，用0.3mol·L^-1的HCL中和，加入2mL氯仿重复萃取3～4次，取上层清液进行液相分析。液相分析的色谱条件：色谱柱Aglient-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为A磷酸盐缓冲液(pH6.8)-B乙腈(83：17)等度洗脱；流速1.0mL·min^-1；检测波长254nm；进样量10μL。

样品分析：TFP及F1～F5组成单糖种类相同，均由甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、木糖、岩藻糖五种单糖组成(保留时间依次为：13.89、21.44、29.72、34.79和41.67min)。根据峰面积，以葡萄糖为参比计算其相对摩尔比，请参阅表3，表3为TFP及F1～F5的单糖组成相对摩尔比，如表3所示，甘露糖为主要组成单糖，其次为木糖和葡萄糖醛酸，其相对比例有一定幅度变化；含量较少的为葡萄糖和岩藻糖，其中岩藻糖相对含量显著降低，表明其在水解过程中容易丢失。

表3

(2)IR分析

称取F1-F5样品各5mg，置于研钵中，添加干燥的KBr，充分研磨混匀，压片，使用HYPERION 2000傅里叶变换红外光谱仪在4000-500cm^-1进行波长扫描。

红外测试结果见图3。在3600～3200cm^-1处有O-H的伸缩振动峰，3000～2800cm^-1处是C-H伸缩振动，1400～1200cm^-1是C-H的变角振动，这三个特征峰证明其为糖类化合物。1200～950cm^-1是C-O-C环内醚的C-O伸缩振动和C-O-H的O-H的变角振动。1600cm^-1处是-COO－的C＝O非对称伸缩振动，1418cm^-1处是-COO-的C＝O对称伸缩振动和C-O伸缩振动，800cm^-1处存在甘露糖残基的特征吸收峰。

结合单糖组成分析结果和相关文献，表明TFP及F1～F 5是以甘露糖为主链并含有糖醛酸的酸性杂多糖。本发明制备的银耳多糖完整保留了原型银耳多糖的重复结构单元。

(3)NMR分析

称取F1～F5样品各5mg，置于研钵中，添加干燥的KBr，充分研磨混匀，压片，使用HYPERION 2000傅里叶变换红外光谱仪在4000-500cm^-1进行波长扫描。测试结果表明，TFP及F1-F 5的NMR谱图基本一致，其中代表性样品F5的NMR谱图见图4和图5。

如图4所示，在¹H NMR谱中，五个异头氢的信号峰位于4.8-5.1ppm处的，大于5.0ppm处的信号峰证明多糖中的糖苷键类型为α型；如图5所示，在¹³C NMR谱中，五个峰位于100～103ppm处，为银耳多糖中五种单糖的异头碳信号，并进一步证明α-糖苷键的构型；在175.75ppm处的信号峰证明糖醛酸的存在。以上结果证明TFP及F1～F 5是以α-甘露糖为主链，含有糖醛酸的酸性杂多糖。

综上所述，本发明采用分子量大于1500kD的均一银耳多糖原料，在0.05–0.15mol/L酸度范围和70–100℃温度范围内进行水解0.5-10小时，获得在10-1000kDa范围的特定分子量的银耳多糖。该银耳多糖酸水解产物的分子量采用高效分子排阻色谱法检测，并采用紫外显色法测定其含量，所制得的银耳多糖是一种α-(1→3)-D-甘露糖为主链的酸性杂多糖，银耳多糖酸水解产物完整保留了原型银耳多糖的结构单元。该方法可获得分子量可控、均一性好的银耳多糖水解产物，具有操作简便、容易控制、适于工业化生产等优点，可应用于食品、化妆品、药品等领域。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种银耳多糖的制备方法，其特征在于：

2.根据权利要求1所述的一种银耳多糖的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述银耳多糖原料由银耳子实体中提取获得。

3.根据权利要求1所述的一种银耳多糖的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述无机酸为盐酸，所述酸度范围为0.08–0.12moL/L。

4.根据权利要求1所述的一种银耳多糖的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，加热温度至80–90℃进行酸水解，酸水解时间为1.0-6.0小时。

5.根据权利要求1所述的一种银耳多糖的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述浓缩方法为减压浓缩或超滤膜浓缩。

6.根据权利要求5所述的一种银耳多糖的制备方法，其特征在于：所述超滤膜浓缩选用截留分子量3～10kD的超滤膜。

7.根据权利要求1所述的一种银耳多糖的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述银耳多糖的分子量采用高效分子排阻色谱法检测。

8.根据权利要求7所述的一种银耳多糖的制备方法，其特征在于，所述高效分子排阻色谱法的色谱条件为：选用TSK G4000色谱柱(7.8x 300mm)；流动相0.1mol/L(NH₄)₂SO₄，流速0.5–0.6mL/min；示差折光检测器。

9.根据权利要求1所述的一种银耳多糖的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述银耳多糖的含量采用紫外显色法检测。

10.根据权利要求9所述的一种银耳多糖的制备方法，其特征在于，所述紫外显色法检测的测定方法为：以葡萄糖醛酸作为对照品，采用间羟基联苯法测定酸性糖含量；以葡萄糖作为对照品，采用苯酚硫酸法测定中性糖含量；样品中的总糖含量按酸性糖和中性糖含量总和计算。