CN112094955A - 纯品多糖制备寡糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于寡糖的制备技术领域，具体的涉及一种纯品多糖制备寡糖的方法。将从红曲霉发酵液中提取得到的纯品多糖溶于酸性溶液中，控制纯品多糖溶液浓度为1‑3％，分装于多个EP小管中，然后分别在不同温度的水中进行降解；反应结束后，除去酸性溶液，加水进行溶解，然后加入无水乙醇醇沉，离心收集上清部分，浓缩烘干，制备得到粗寡糖；采用凝胶柱层析法对粗寡糖混合物进行分离纯化，收集后检测糖含量，作洗脱曲线图，收集各个主峰部分浓缩烘干，制备得到寡糖。本发明所述的纯品多糖制备寡糖的方法，工艺简单，对寡糖的结构及其生物活性影响小，且实现了寡糖混合物的分离和成分的确定。
Description
技术领域
本发明属于寡糖的制备技术领域，具体的涉及一种纯品多糖制备寡糖的方法。
背景技术
寡糖是由2-9个单糖聚合而成，通过糖苷键连接成直链或者带直链的低聚合度糖类物质，又可称为低聚糖，分子式一般可表示为(C6H10O5)n(n＝2-9)，分子量约300-2000道尔顿。寡糖独特的结构使其在理化性质、生理功能等方面与单糖及多糖有着显著的差异。寡糖及其衍生物是一类重要的具有生物活性的物质，能够促进双歧杆菌的生长，具有低热量、抗蛀牙、抗肿瘤和防治糖尿病等多种特点与功能，最近的研究发现，寡糖还具有抗凝血、抗氧化和调节免疫系统等作用。
寡糖在植物体中普遍存在，并且存在的方式多种多样，大多数植物的果实和种子中都含有较多的寡糖及其同类物质，构成寡糖的单糖主要包括木糖、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、果糖等。现在已确定的寡糖有上千种，按照组成寡糖的单糖的不同可以分为同寡糖和杂寡糖，同寡糖是由同一种单糖聚合而成的寡糖，杂寡糖是由两种或两种以上不同种类的单糖聚合而成的寡糖。
寡糖的分离纯化是将混合糖中各种不同聚合度、不同结构的糖进行分离，获得较高纯度寡糖的过程。由于寡糖具有相近的官能团，多种不同的异构体，多样的连接方式和分支形式，并且寡糖分子本身缺乏发色基团或荧光基团，检测相对困难，所以寡糖混合物的分离是研究的重点和难点。
发明内容
本发明的目的是：提供一种纯品多糖制备寡糖的方法。该方法工艺简单，对寡糖的结构及其生物活性影响小，且实现了寡糖混合物的分离和成分的确定。
本发明所述的纯品多糖制备寡糖的方法，由以下步骤组成：
(1)将从红曲霉发酵液中提取得到的纯品多糖溶于酸性溶液中，控制纯品多糖溶液浓度为1-3％，分装于多个EP小管中，然后分别在不同温度的水中进行降解；
(2)反应结束后，除去酸性溶液，加水进行溶解，然后加入无水乙醇醇沉，离心收集上清部分，浓缩烘干，制备得到粗寡糖；
(3)采用凝胶柱层析法对粗寡糖混合物进行分离纯化，收集后检测糖含量，作洗脱曲线图，收集各个主峰部分浓缩烘干，制备得到寡糖。
其中：
步骤(1)中所述的纯品多糖为经过纯化后糖含量达98％以上，经凝胶渗透色谱检测只有单一对称峰的纯品多糖。
步骤(1)中所述的酸性溶液为硫酸、盐酸或三氟乙酸中的一种，浓度为0.01mol/L或0.05mol/L；优选浓度为0.01mol/L的盐酸。
步骤(1)中所述的降解温度为70℃-90℃，降解时间为2-4h；优选于70℃水中降解2h。
步骤(1)中所述的EP小管的个数为60-100个。
步骤(1)所说的降解过程中，每间隔20-30min进行取样，采用高效薄层色谱法对降解产物进行研究，并选择一定降解条件下的降解产物进行凝胶色谱分析和硫酸-苯酚法检测，查看降解产物的分布情况，确定降解条件。
步骤(2)中所述的水的加入量为样品体积的3-5倍，加入无水乙醇的量为样品溶解后的水溶液体积的10-15倍。
步骤(2)中所述的离心转速为3000-4000r/min，离心时间10-15min。
步骤(3)中凝胶柱层析法所采用的凝胶柱为Bio-Gel P-4，流动相为0.2mol/L的(NH4)2CO3溶液，流速为0.1mL/min。
步骤(3)中所述的寡糖中的单糖的确定是以十种单糖标准品为标准，利用PMP柱前衍生HPLC法对寡糖样品进行单糖组成测定，包括寡糖的完全酸水解、降解后寡糖的PMP衍生和高效液相色谱分析。
所述的十种单糖为Man、GlcN、Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal、Xyl、Ara和Fuc。
其中，所述的寡糖的完全酸水解是准确称取寡糖样品，置于具塞刻度试管中，加入2-3mol/L的TFA溶液，漩涡震荡使其充分溶解，充N2封管，于100-110℃烘箱中降解6-8h，降解完成冷却后，打开盖加入甲醇后在氮吹仪上用N2吹干，通过不断加甲醇除去多余的盐酸，如此吹干2-3次后密封备用。
优选的，所述的寡糖的完全酸水解是准确称取寡糖样品2mg，置于5mL具塞刻度试管中，加入600μL 2mol/L的TFA溶液，漩涡震荡使其充分溶解，充N2封管，于105℃烘箱中降解6h，降解完成冷却后，打开盖加入200μL甲醇后在氮吹仪上用N2吹干，通过不断加甲醇除去多余的盐酸，如此吹干3次后密封备用。
所述的降解后寡糖的PMP衍生是将降解后的寡糖样品及等摩尔配制的单糖标准品在进行高效液相分析前进行PMP衍生。
向各降解后的寡糖样品和等摩尔单糖标准品混合液中依次加入0.3-0.5mol/LNaOH溶液和0.5-1.0mol/L PMP甲醇溶液，加盖密封，置于70-90℃烘箱中反应60-80min；反应完成后取出冷却至室温，加入0.2-0.3mol/L HCl溶液中和反应液，漩涡震荡混合均匀，依次用氯仿萃取4-5次，吸取上层清液过0.22μm或0.45μm的微孔滤膜后置于液相瓶中备用。
优选的，向各降解后的寡糖样品和100μL等摩尔单糖标准品混合液中依次加入100μL0.3mol/L NaOH溶液和120μL 0.5mol/L PMP甲醇溶液，加盖密封，置于70℃烘箱中反应70min；反应完成后取出冷却至室温，加入100μL 0.3mol/L HCl溶液中和反应液，漩涡震荡混合均匀，依次用200μL氯仿萃取4次，吸取上层清液过0.22μm的微孔滤膜后置于液相瓶中备用。
所述的高效液相色谱分析条件为色谱柱选用Agilent Eclipse XDB-C18(5μm，4.6×150mm)；流动相为乙腈：磷酸盐缓冲液＝17：83(v/v)；进样量：10μL；柱温：35℃；紫外检测器检测波长：254nm；流速：1.0mL/min；通过对照样品与单糖标准品在高效液相色谱图中的保留时间，即可确定样品中寡糖组成。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明所述的纯品多糖制备寡糖的方法，工艺简单，对寡糖的结构及其生物活性影响小，且实现了寡糖混合物的分离和成分的确定。
附图说明
图1是实施例1洗脱曲线；
图2是实施例2洗脱曲线；
图3是实施例3洗脱曲线。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
本实施例1所述的纯品多糖制备寡糖的方法，由以下步骤组成：
(1)将从红曲霉发酵液中提取得到的纯品多糖溶于酸性溶液中，控制纯品多糖溶液浓度为1％，分装于多个EP小管中，然后分别在不同温度的水中进行降解；
(2)反应结束后，除去酸性溶液，加水进行溶解，然后加入无水乙醇醇沉，离心收集上清部分，浓缩烘干，制备得到粗寡糖；
(3)采用凝胶柱层析法对粗寡糖混合物进行分离纯化，收集后检测糖含量，作洗脱曲线图，收集各个主峰部分浓缩烘干，制备得到寡糖。
其中：
步骤(1)中所述的纯品多糖为经过纯化后糖含量达98％以上，经凝胶渗透色谱检测只有单一对称峰的纯品多糖。
步骤(1)中所述的酸性溶液为硫酸，浓度为0.01mol/L。
步骤(1)中所述的降解温度为80℃，降解时间为3h。
步骤(1)中所述的EP小管的个数为80个。
步骤(1)所说的降解过程中，每间隔25min进行取样，采用高效薄层色谱法对降解产物进行研究，并选择一定降解条件下的降解产物进行凝胶色谱分析和硫酸-苯酚法检测，查看降解产物的分布情况，确定降解条件。
步骤(2)中所述的水的加入量为样品体积的3倍，加入无水乙醇的量为样品溶解后的水溶液体积的10倍。
步骤(2)中所述的离心转速为3000r/min，离心时间15min。
步骤(3)中凝胶柱层析法所采用的凝胶柱为Bio-Gel P-4，流动相为0.2mol/L的(NH4)2CO3溶液，流速为0.1mL/min。
实施例2
本实施例2所述的纯品多糖制备寡糖的方法，由以下步骤组成：
(1)将从红曲霉发酵液中提取得到的纯品多糖溶于酸性溶液中，控制纯品多糖溶液浓度为2％，分装于多个EP小管中，然后分别在不同温度的水中进行降解；
(2)反应结束后，除去酸性溶液，加水进行溶解，然后加入无水乙醇醇沉，离心收集上清部分，浓缩烘干，制备得到粗寡糖；
(3)采用凝胶柱层析法对粗寡糖混合物进行分离纯化，收集后检测糖含量，作洗脱曲线图，收集各个主峰部分浓缩烘干，制备得到寡糖。
其中：
步骤(1)中所述的纯品多糖为经过纯化后糖含量达98％以上，经凝胶渗透色谱检测只有单一对称峰的纯品多糖。
步骤(1)中所述的酸性溶液为盐酸，浓度为0.01mol/L。
步骤(1)中所述的降解温度为70℃，降解时间为2h。
步骤(1)中所述的EP小管的个数为70个。
步骤(1)所说的降解过程中，每间隔30min进行取样，采用高效薄层色谱法对降解产物进行研究，并选择一定降解条件下的降解产物进行凝胶色谱分析和硫酸-苯酚法检测，查看降解产物的分布情况，确定降解条件。
步骤(2)中所述的水的加入量为样品体积的5倍，加入无水乙醇的量为样品溶解后的水溶液体积的15倍。
步骤(2)中所述的离心转速为3500r/min，离心时间12min。
步骤(3)中凝胶柱层析法所采用的凝胶柱为Bio-Gel P-4，流动相为0.2mol/L的(NH4)2CO3溶液，流速为0.1mL/min。
实施例3
本实施例3所述的纯品多糖制备寡糖的方法，由以下步骤组成：
(1)将从红曲霉发酵液中提取得到的纯品多糖溶于酸性溶液中，控制纯品多糖溶液浓度为3％，分装于多个EP小管中，然后分别在不同温度的水中进行降解；
(2)反应结束后，除去酸性溶液，加水进行溶解，然后加入无水乙醇醇沉，离心收集上清部分，浓缩烘干，制备得到粗寡糖；
(3)采用凝胶柱层析法对粗寡糖混合物进行分离纯化，收集后检测糖含量，作洗脱曲线图，收集各个主峰部分浓缩烘干，制备得到寡糖。
其中：
步骤(1)中所述的纯品多糖为经过纯化后糖含量达98％以上，经凝胶渗透色谱检测只有单一对称峰的纯品多糖。
步骤(1)中所述的酸性溶液为三氟乙酸，浓度为0.05mol/L。
步骤(1)中所述的降解温度为90℃，降解时间为4h。
步骤(1)中所述的EP小管的个数为90个。
步骤(1)所说的降解过程中，每间隔20min进行取样，采用高效薄层色谱法对降解产物进行研究，并选择一定降解条件下的降解产物进行凝胶色谱分析和硫酸-苯酚法检测，查看降解产物的分布情况，确定降解条件。
步骤(2)中所述的水的加入量为样品体积的4倍，加入无水乙醇的量为样品溶解后的水溶液体积的12倍。
步骤(2)中所述的离心转速为4000r/min，离心时间10min。
步骤(3)中凝胶柱层析法所采用的凝胶柱为Bio-Gel P-4，流动相为0.2mol/L的(NH4)2CO3溶液，流速为0.1mL/min。
对实施例1-3制备分离纯化得到的寡糖的成分进行确定，包括以下方法：
单糖组分的测定：
以十种单糖标准品为标准，利用PMP柱前衍生HPLC法对寡糖样品进行单糖组成测定，包括寡糖的完全酸水解、降解后寡糖的PMP衍生和高效液相色谱分析。
所述的十种单糖为Man、GlcN、Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal、Xyl、Ara和Fuc。
其中，
所述的寡糖的完全酸水解是准确称取寡糖样品2mg，置于5mL具塞刻度试管中，加入600μL 2mol/L的TFA溶液，漩涡震荡使其充分溶解，充N2封管，于105℃烘箱中降解6h，降解完成冷却后，打开盖加入200μL甲醇后在氮吹仪上用N2吹干，通过不断加甲醇除去多余的盐酸，如此吹干3次后密封备用。
所述的降解后多糖的PMP衍生是将降解后的多糖样品及等摩尔配制的单糖标准品在进行高效液相分析前进行PMP衍生。
向各降解后的寡糖样品和100μL等摩尔单糖标准品混合液中依次加入100μL0.3mol/L NaOH溶液和120μL 0.5mol/L PMP甲醇溶液，加盖密封，置于70℃烘箱中反应70min；反应完成后取出冷却至室温，加入100μL 0.3mol/L HCl溶液中和反应液，漩涡震荡混合均匀，依次用200μL氯仿萃取4次，吸取上层清液过0.22μm的微孔滤膜后置于液相瓶中备用。
所述的高效液相色谱分析条件为色谱柱选用Agilent Eclipse XDB-C18(5μm，4.6×150mm)；流动相为乙腈：磷酸盐缓冲液＝17：83(v/v)；进样量：10μL；柱温：35℃；紫外检测器检测波长：254nm；流速：1.0mL/min；通过对照样品与单糖标准品在高效液相色谱图中的保留时间，即可确定样品中寡糖组成。
由附图1可知，实施例1制备得到的寡糖是由葡萄糖以及甘露糖和氨基葡萄糖组成，三者摩尔比为3：1.5：1。最后制成的单糖亦是葡萄糖以及甘露糖和氨基葡萄糖，与寡糖的组成一致。
由附图2可知，实施例2制备得到的寡糖是由葡萄糖以及半乳糖组成，二者摩尔比为3：1。最后制成的单糖亦是葡萄糖以及半乳糖，与寡糖的组成一致。
由附图3可知，实施例3制备得到的寡糖是由甘露糖和半乳糖组成，二者摩尔比为4：1。最后制成的单糖亦是甘露糖和半乳糖，与寡糖的组成一致。
Claims (8)
1.一种纯品多糖制备寡糖的方法，其特征在于：由以下步骤组成：
(1)将从红曲霉发酵液中提取得到的纯品多糖溶于酸性溶液中，控制纯品多糖溶液浓度为1-3％，分装于多个EP小管中，然后分别在不同温度的水中进行降解；
(2)反应结束后，除去酸性溶液，加水进行溶解，然后加入无水乙醇醇沉，离心收集上清部分，浓缩烘干，制备得到粗寡糖；
(3)采用凝胶柱层析法对粗寡糖混合物进行分离纯化，收集后检测糖含量，作洗脱曲线图，收集各个主峰部分浓缩烘干，制备得到寡糖。
2.根据权利要求1所述的纯品多糖制备寡糖的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的纯品多糖为经过纯化后糖含量达98％以上，经凝胶渗透色谱检测只有单一对称峰的纯品多糖。
3.根据权利要求1所述的纯品多糖制备寡糖的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的酸性溶液为硫酸、盐酸或三氟乙酸中的一种，浓度为0.01mol/L或0.05mol/L。
4.根据权利要求1所述的纯品多糖制备寡糖的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的降解温度为70℃-90℃，降解时间为2-4h；所述的EP小管的个数为60-100个。
5.根据权利要求1所述的纯品多糖制备寡糖的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的水的加入量为样品体积的3-5倍，加入无水乙醇的量为样品溶解后的水溶液体积的10-15倍。
6.根据权利要求1所述的纯品多糖制备寡糖的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的离心转速为3000-4000r/min，离心时间10-15min。
7.根据权利要求1所述的纯品多糖制备寡糖的方法，其特征在于：步骤(3)中凝胶柱层析法所采用的凝胶柱为Bio-Gel P-4，流动相为0.2mol/L的(NH4)2CO3溶液，流速为0.1mL/min。
8.根据权利要求1所述的纯品多糖制备寡糖的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的寡糖中的单糖的确定是以十种单糖标准品为标准，利用PMP柱前衍生HPLC法对寡糖样品进行单糖组成测定，包括寡糖的完全酸水解、降解后寡糖的PMP衍生和高效液相色谱分析。
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