CN110123854A - 一种基于北柴胡组分的抗炎活性药物组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药领域，具体涉及一种基于北柴胡组分的抗炎活性药物组合物及其制备方法，该组合物的成分均来自中药北柴胡，其具体由质量百分比为10‑50％的北柴胡寡糖片段和50‑90％的北柴胡总皂苷组成。从本发明药理及活性实验结果来看，该组合物能够有效抑制急性腹腔炎小鼠模型腹腔液中白细胞的渗出，展现出良好的抗炎活性；其作用机制与拮抗血管内皮P‑选择素介导的白细胞黏附功能密切相关。这些结果表明，北柴胡中药组合物可用于制备新型治疗急性炎症的有效药物，有着广阔的应用前景。

Description

一种基于北柴胡组分的抗炎活性药物组合物及其应用

技术领域

本发明涉及一种药物组合物，具体是指具有抗炎功效的药物组合物，特别是指一种基于北柴胡组分的抗炎活性药物组合物及其制备方法。

背景技术

柴胡是我国传统和常用大宗中药材之一，《中华人民共和国药典》(2015年版)收载伞形科多年生草本植物北柴胡(Bupleurum chinense DC.)和狭叶柴胡(南柴胡，Bupleurumscorzonerifolium Willd.)的干燥根为柴胡的药用部位，北柴胡是商品柴胡的主流品种，在我国已有2000多年的应用历史。柴胡味辛、苦，性微寒，归肝、胆、肺经，具有和解表里、疏肝解郁、升阳举陷、退热截疟之功效。柴胡含有丰富的活性化学成分，主要包括多糖、皂苷、甾醇、挥发油(柴胡醇、丁香酚等)等。目前技术是将柴胡采用水煎煮提取的方法得到浸膏后，加入辅料制成片剂或者胶囊等口服制剂，用于治疗炎症相关疾病等，但存在服药剂量大，有效成分不明确、治疗标准可控性差等缺点，难于满足药物“安全、有效、可控、稳定”的要求，由于药效物质基础与作用机制不明，难于被国际市场所接受。因此，柴胡药用价值的深度挖掘对于中药资源的合理开发与利用具有现实意义。

炎症反应是机体对于刺激的一种防御反应，常表现为红、肿、热、痛和功能障碍。适度的炎症反应可动员体内的防御力量，在防御病原体入侵以及修复自身损伤组织中扮演着重要角色。而某些病理条件下，由于免疫调节能力失常，将会引起一系列非可控性炎症反应，严重危害人体健康。近年来的研究发现，白细胞向组织中快速而大量的浸润是多种急性炎症相关疾病发病的中心环节。因而，白细胞的过度浸润与多种炎症相关疾病的发生、发展及预后恶化有着密切关系，适度抑制白细胞的组织浸润成为治疗炎症相关疾病的新策略。

白细胞在血管内皮上的动态黏附和血管渗出是急性炎症损伤发生、发展的重要环节，其分子基础在于白细胞与血管内皮表面黏附分子间的相互作用。静息状态下，P-选择素储存于血管内皮的Weibel-Palade小体中，当血管内皮受到炎症因子刺激后，P-选择素被迅速转运并整合到血管内皮表面，通过与白细胞表面微绒毛上P-选择素糖蛋白配体1(PSGL-1)的特异性识别，捕获并介导白细胞在内皮上的起始识别和滚动黏附。P-选择素是启动炎症反应并维持炎症状态的关键黏附分子。因此，P-选择素成为干预急性炎症的新靶点。

发明内容

本发明实施例所要解决的技术问题在于，提供一种基于北柴胡组分的抗炎活性药物组合物及其制备方法。该方案通过对北柴胡中主要抗炎成分寡糖片段和总皂苷进行有效配比，制备了北柴胡组分中药组合物。利用动物、细胞模型，发现该中药组合物可以显著抑制白细胞的浸润。该中药组合物可以作为P-选择素配体类似物阻断P-选择素与PSGL-1的结合，拮抗P-选择素介导的白细胞起始黏附，展现出良好的抗炎作用。

为实现上述目的，本发明的第一个发明目的是提供一种基于北柴胡组分的抗炎活性药物组合物，其技术方案是由质量百分比为10-50％的北柴胡寡糖片段和50-90％的北柴胡总皂苷组成。

进一步设置是所述的北柴胡寡糖片段是通过以下方法制备：取北柴胡，80℃烘至恒重，将干燥的北柴胡粉碎过40目筛，加8倍量的80％乙醇，调节pH＝8，80℃回流提取3次，每次4h，合并乙醇提取液用于总皂苷的制备，残渣于80℃热水浸提4次，每次提取2小时，抽滤，合并滤液，将滤液在60℃减压浓缩，加入5倍体积的无水乙醇沉淀，低温静置过夜，离心，沉淀加蒸馏水溶解，再次重复乙醇沉淀的步骤3次，用蒸馏水溶解，经反复冻融、离心去除不溶物后，上清液加入链霉菌蛋白酶消化24小时，Sevag法脱蛋白5次，浓缩，冷冻干燥，得到北柴胡总多糖。将总多糖置于具塞瓶中，加入0.5M三氟乙酸溶液，80℃条件下水解120分钟，透析，冷冻干燥,得到北柴胡寡糖片段。

进一步设置是所述的北柴胡总皂苷是通过以下方法制备：

首先将乙醇提取液滤去不溶物，旋转蒸发回收乙醇、浓缩体积，用5倍量水饱和的正丁醇萃取3次，回收正丁醇，得皂苷萃取液，并以1倍柱体积每小时的流速上样到AB-8大孔树脂柱，先用5倍柱体积蒸馏水以2倍柱体积每小时的流速洗脱，再分别用5倍柱体积70％乙醇以2倍柱体积每小时的流速洗脱，收集70％乙醇洗脱液，回收浓缩，真空干燥后，得精制北柴胡总皂苷样品。

本发明还提供一种基于所述的抗炎活性药物组合物在制备针对P-选择素靶点的抗炎药物中的应用。

本发明还提供一种针对P-选择素靶点的抗炎药物制剂，包括有所述的抗炎活性药物组合物和药学上可接受的辅料或药物载体。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和山梨醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。可将所述的组合物制成各种适合于哺乳动物给药的剂型，所述剂型包括但不限于：注射剂、胶囊剂、片剂、乳剂、栓剂。

本发明对北柴胡的有效部位进行了提取。并分別对不同组分的化学成分进行了分析，并进行了活性试验。根据各个组分活性试验的结果，对北柴胡提取物中的各个组分含量进行了优化，从而得到一种疗效明确，协同作用显著的源自北柴胡提取物的中药组合物。

本发明的有益效果是：

具体见实施例数据，本发明利用急性腹腔炎小鼠模型、平行板流动小室和流式细胞术，系统评价了北柴胡组分中药组合物对急性腹腔炎症的保护能力。药理实验结果表明，急性腹腔炎模型小鼠腹腔液中有大量白细胞渗出，表明发生强烈的炎症反应。而经尾静脉注射北柴胡组分中药组合物干预后，可以显著抑制腹腔液中白细胞的渗出，展现出良好的急性炎症损伤保护功效。经北柴胡组分中药组合物处理后，HL-60细胞在平行板流动小室包被的P-选择素上的滚动速度明显加快，表明HL-60细胞与P-选择素的黏附作用显著减弱。流式细胞术实验结果表明该组合物可以有效阻断重组人P-选择素与HL-60细胞的结合。

目前，现有技术常采用北柴胡单一有效部位作为药物应用于临床。而本发明发现采用北柴胡单一有效部位，在活性试验及临床疗效上不如其水提物。这是因为单一有效部位虽然通过现代分离手段富集了北柴胡中的某一类化合物，但是忽略了药材中不同化合物之间可能发生的协同效应，本发明通过分子水平、细胞水平和整体水平上的活性试验研究，对北柴胡两种具有抗炎作用的活性化合物进行配比，通过不断优化质量百分比，最终获得的药物组合物在治疗急性炎症方面达到最佳的协同效应，获得更高的疗效。采用上述技术方案后，本发明所述的北柴胡中药组合物具有有效物质明确、疗效确切、毒副作用小、服用方便等优点，作为新型治疗急性炎症药物有着良好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。

图1为北柴胡组分中药组合物对小鼠急性腹腔炎的抑制作用示意图；

图2为北柴胡组分中药组合物对HL-60细胞与CHO-P在层流状态下的黏附抑制作用示意图；

图3为流式细胞术检测北柴胡组分中药组合物拮抗P-选择素与HL-60细胞黏附作用示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

实施例1：北柴胡寡糖片段(BCO)的制备

取5kg北柴胡药材，80℃烘至恒重，将干燥的北柴胡粉碎过筛(40目)，加8倍量的80％乙醇，调节pH＝8，80℃回流提取3次，每次4h，合并乙醇提取液用于总皂苷的制备，残渣于80℃热水浸提4次，每次提取2小时，抽滤，合并滤液，将滤液在60℃减压浓缩，加入5倍体积的无水乙醇沉淀，低温静置过夜，离心，沉淀加蒸馏水溶解，再次重复乙醇沉淀的步骤3次，用蒸馏水溶解，经反复冻融、离心去除不溶物后，上清液加入链霉菌蛋白酶消化24小时，Sevag法脱蛋白5次，浓缩，冷冻干燥，得到北柴胡总多糖。将北柴胡总多糖置于具塞瓶中，加入0.5M三氟乙酸溶液，80℃水解120分钟，透析、冷冻干燥,得到北柴胡寡糖片段。

实施例2：北柴胡总皂苷(BCS)的制备

首先将乙醇提取液滤去不溶物，旋转蒸发回收乙醇、浓缩体积，用5倍量水饱和的正丁醇萃取3次，回收正丁醇，得皂苷萃取液，并以1倍柱体积每小时的流速上样到AB-8大孔树脂柱，先用5倍柱体积蒸馏水以2倍柱体积每小时的流速洗脱，再分别用5倍柱体积70％乙醇以2倍柱体积每小时的流速洗脱，收集70％乙醇洗脱液，回收浓缩，真空干燥后，得精制北柴胡总皂苷样品。

实施例3：北柴胡中药组合物对小鼠急性腹腔炎的抑制作用

向雄性小鼠腹膜内注射2mL的3％巯基乙醇酸钠培养基或者无菌生理盐水。10min后，于小鼠尾静脉分别注射北柴胡寡糖片段、总皂苷，以及其不同比例的组合物(寡糖片段：总皂苷质量百分比分别为10:90；25:75；50:50；75:25；90:10)。2h后处死小鼠，用生理盐水灌洗，收集腹腔液。离心后，固定细胞，涂片和染色，记数每毫升灌洗液白细胞的数目，并计算抑制率。结果显示，与对照组相比，北柴胡寡糖片段、总皂苷和不同比例的组合物干预后，对模型小鼠腹腔中白细胞的渗出展现出不同程度的抑制作用。总皂苷的治疗效果要优于寡糖片段，而当二者以25％寡糖片段和75％总皂苷制备的组合物展现出了最佳治疗效果，白细胞浸润抑制率达到了85.8％，见附图1。

实施例4：北柴胡中药组合物抑制HL-60细胞与P-选择素在剪切应力作用下的结合

采用平行板流动小室配合显微成像设备、注射泵以及真空泵，建立体外模拟血流剪切的实验装置，测定北柴胡中药组合物阻断HL-60细胞与P-选择素在血流剪切应力条件下相互作用的能力。将稳定表达P-选择素的CHO-P细胞均匀铺于35mm培养板中，培养成单层细胞后，置于平行板流动小室装置中，并置于倒置显微镜载物台上。系统中注入HL-60细胞前，CHO-P细胞分别与北柴胡寡糖片段、总皂苷，以及其不同比例的组合物(寡糖片段：总皂苷质量百分比分别为10:90；25:75；50:50；75:25；90:10)孵育30分钟。以1dyn/cm²剪切应力，调整系统流速，PBS冲洗平行板流动小室5min，注入HL-60细胞悬液。当HL-60细胞进入显微成像视野后，随机选定10个区域，记录在CHO-P单层细胞表面滚动黏附的HL-60细胞。结果显示，当给药浓度为100μg/ml时，北柴胡总皂苷拮抗HL-60细胞与CHO-P细胞滚动黏附的能力要优于寡糖片段，分别为81.6％和58.5％。而经过不同质量百分比制备的寡糖片段和总皂苷组合物展现出更加明显的阻断效果。与对照组相比，北柴胡寡糖片段和总皂苷以不同比例的组合物(10:90；25:75；50:50；75:25；90:10)对HL-60细胞与CHO-P单层细胞滚动黏附的抑制率分别达到了86.7％、92.6％、77.7％、64.0％和57.4％。可见，北柴胡中药组合物(寡糖片段：总皂苷＝25％:75％)的抑制效果最佳，见附图2。

实施例5：流式细胞仪分析

利用流式细胞仪检测了北柴胡寡糖片段、总皂苷，以及其不同比例的组合物阻断重组人P-选择素/Fc融合蛋白(recombinanthuman P-selectin/Fc chimera protein，rhP-Fc)与HL-60细胞表面PSGL-1结合的能力。首先分别将北柴胡寡糖片段、总皂苷，以及其不同比例的组合物与重组人P-选择素/Fc融合蛋白(rhP-Fc)共同作用，再向体系中加入HL-60细胞悬液继续孵育1h，然后利用FITC偶联的抗人IgG荧光单抗标记rhP-Fc，细胞经PBS漂洗后，采用流式细胞术检测平均荧光强度和阳性细胞百分数。实验结果表明，相较于北柴胡寡糖片段，总皂苷展现出更优的P-选择素功能拮抗作用，可有效阻断rhP-Fc与HL-60细胞的结合，抑制率达到88.7％。而将二者以不同质量百分率进行组合(寡糖片段：总皂苷分别为10:90；25:75；50:50；75:25；90:10)，抑制率分别达到了90.3％、96.7％、79.2％、71.5％和67.4％。可见，组合物(25:75)展现出最佳的P-选择素功能拮抗作用，见附图3。表明寡糖片段与总皂苷以一定比例的组合，针对P-选择素功能拮抗具有协同增效作用，25％寡糖片段和75％总皂苷的组合效果最佳，见附图3。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (5)

1.一种基于北柴胡组分的抗炎活性药物组合物，其特征在于：由质量百分比为10-50％的北柴胡寡糖片段和50-90％的北柴胡总皂苷组成。

2.根据权利要求1所述的抗炎活性药物组合物，其特征在于：所述的北柴胡寡糖片段是通过以下方法制备：取北柴胡，80℃烘至恒重，将干燥的北柴胡粉碎过40目筛，加8倍量的80％乙醇，调节pH＝8，80℃回流提取3次，每次4h，合并乙醇提取液用于总皂苷的制备，残渣于80℃热水浸提4次，每次提取2小时，抽滤，合并滤液，将滤液在60℃减压浓缩，加入5倍体积的无水乙醇沉淀，低温静置过夜，离心，沉淀加蒸馏水溶解，再次重复乙醇沉淀的步骤3次，用蒸馏水溶解，经反复冻融、离心去除不溶物后，上清液加入链霉菌蛋白酶消化24小时，Sevag法脱蛋白5次，浓缩，冷冻干燥，得到北柴胡总多糖,将北柴胡总多糖置于具塞瓶中，加入0.5 M三氟乙酸溶液，80℃水解120分钟，透析、冷冻干燥,得到北柴胡寡糖片段。

3.根据权利要求2所述的抗炎活性药物组合物，其特征在于：所述的北柴胡总皂苷是通过以下方法制备：

首先将北柴胡乙醇提取液滤去不溶物，旋转蒸发回收乙醇、浓缩体积，用5倍量水饱和的正丁醇萃取3次，回收正丁醇，得皂苷萃取液，并以1倍柱体积每小时的流速上样到AB-8大孔树脂柱，先用5倍柱体积蒸馏水以2倍柱体积每小时的流速洗脱，再分别用5倍柱体积70％乙醇以2倍柱体积每小时的流速洗脱，收集70％乙醇洗脱液，回收浓缩，真空干燥后，得精制北柴胡总皂苷样品。

4.一种基于权利要求1所述的抗炎活性药物组合物在制备针对P-选择素靶点的抗炎药物中的应用。

5.一种针对P-选择素靶点的抗炎药物制剂，其特征在于：包括有权利要求1所述的抗炎活性药物组合物和药学上可接受的辅料或药物载体。