CN115028514B - 一种苏式烯-二炔-烯型聚炔及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种苏式烯‑二炔‑烯型聚炔及其制备方法和应用，属于医药技术领域。该苏式烯‑二炔‑烯型聚炔的分子结构式为：该制备方法为经过乙醇水溶液提取，浓缩，正丁醇萃取，在经过色谱分离纯化，从南柴胡根中分离出能够抗神经炎的苏式烯‑二炔‑烯型聚炔，在苏式烯‑二炔‑烯型聚炔中又分离出3对苏式烯‑二炔‑烯型聚炔，每对中又含有一对烯‑二炔‑烯型聚炔对映异构体，同时，证明了苏式烯‑二炔‑烯型聚炔在制备抗神经炎药物中的用途，该制备方法简单，重现性好，获得的苏式烯‑二炔‑烯型聚炔具有良好的抗神经炎活性。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及苏式烯-二炔-烯型聚炔及其制备方法和应用。具体涉及从药用植物南柴胡根中分离得到的3对新的苏式烯-二炔-烯型聚炔，以及每对中的烯-二炔-烯型聚炔对映异构体及其抗神经炎的医药新用途。
背景技术
南柴胡(Bupleurum scorzonerifolium Willd)：又名红柴胡、狭叶柴胡，为伞形科(Umbelliferae)，芹亚科，柴胡属多年生草本植物。南柴胡收录于《中国药典》(2020版)是中药柴胡的重要品种之一，一般根部入药。可用于治疗表证发热，肝郁气滞，气虚下陷等。
目前对南柴胡化学成分及药理活性的研究主要集中在柴胡皂苷类，木脂素类，而聚炔类特别是烯-二炔-烯型聚炔的研究鲜有报道。烯-二炔-烯型聚炔类化合物因其具有化学性质活泼的炔键和较长的共轭片段而显示出独特的生物活性，特别是在抗菌、抗病毒和抗炎等方面显示出较好的活性。值得一提的是，邻二醇的构型差异，脂肪链的长短差异等都将有可能会导致药理活性的差异。本发明所涉及的烯-二炔-烯型聚炔对映异构体是通过对南柴胡根提取物制备获得具有较好的抗炎活性，解决现有未发现南柴胡根治疗炎症的医药用途。
发明内容
本发明提供了一种烯-二炔-烯型聚炔对映异构体及其制备和应用，具体为3对从南柴胡根中分离出能够抗神经炎的苏式烯-二炔-烯型聚炔，在苏式烯-二炔-烯型聚炔中又分离出3对苏式烯-二炔-烯型聚炔，每对中又含有一对烯-二炔-烯型聚炔对映异构体，并且本发明又提供所述苏式烯-二炔-烯型聚炔在制备抗神经炎药物中的用途，其丰富了南柴胡根的抗神经炎医药用途。本发明制备方法简单，重现性好，获得的化合物具有良好的抗神经炎活性。
本发明的一种苏式烯-二炔-烯型聚炔的分子结构式为：
所述的苏式烯-二炔-烯型聚炔，还包括其形成的药学上可接受的盐。
所述的苏式烯-二炔-烯型聚炔，根据构型的不同，包括以下6个烯-二炔-烯型聚炔对映异构体，如式1a/1b-3a/3b所示：
所述的烯-二炔-烯型聚炔对映异构体，还包括其药学上可接受的盐。
本发明的苏式烯-二炔-烯型聚炔的制备方法，是以伞形科柴胡属多年生草本植物南柴胡(Bupleurum scorzonerifolium Willd)的根中提取分离得到的。
更进一步的是，苏式烯-二炔-烯型聚炔的制备方法，以干燥的南柴胡根作为药材，先采用体积浓度为70-80％乙醇水溶液提取，再进行浓缩，得到浸膏状乙醇提取物；
将浸膏状乙醇提取物再加入正丁醇进行萃取，将正丁醇萃取液，进行色谱分离纯化，得到苏式烯-二炔-烯型聚炔。
更具体的为：
苏式烯-二炔-烯型聚炔的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：提取
以干燥粉碎后的南柴胡根作为药材，采用乙醇水溶液进行提取，得到提取液；其中，采用的乙醇水溶液中，乙醇体积浓度为70-80％；
步骤2：浓缩
将提取液进行减压浓缩，干燥后，得到浸膏状乙醇提取物；
步骤3：萃取
采用正丁醇对浸膏状乙醇提取物进行萃取，得到正丁醇萃取液；
步骤4：色谱分离纯化
(1)将正丁醇萃取液经过硅胶减压柱色谱分离，采用按体积比为100:0～1:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，得到一次梯度洗脱液；
(2)取一次梯度洗脱液中，二氯甲烷-甲醇混合溶剂体积比为100:0-100:30范围内的洗脱部分，经HP-20大孔树脂柱色谱进行分离，采用乙醇体积浓度为0～90％的乙醇-水混合溶剂进行梯度洗脱，得到二次梯度洗脱液；
(3)取乙醇-水混合溶剂中乙醇体积浓度为0％-60％的二次梯度洗脱液部分，经ODS柱色谱进行分离，采用体积比为10:90-95:5的乙醇-水的混合溶剂进行三次梯度洗脱；取乙醇-水混合溶剂中体积比为60:40-80:20的三次梯度洗脱液部分，再经硅胶柱色谱进行分离，用体积比为100:1-1:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱；进一步用p-HPLC纯化，得到苏式烯-二炔-烯型聚炔。
所述的步骤1中，加入南柴胡根体积2-3倍的乙醇水溶液浸泡过夜，再加入南柴胡根体积5-8倍的乙醇水溶液提取至少2次，优选为2-3次，每次提取时间优选为1-3h。提取采用加热回流提取和/或超声提取中的一种；所述的加热回流提取的温度优选为60-80℃。
所述的步骤2中，浸膏状乙醇提取物中的固相率为60-70％。
所述的步骤2中，干燥的温度为80-85℃，时间为2-3h。
所述的步骤2中，减压浓缩的工艺为：压力为0.08-0.1MPa，温度为60-70℃，时间为1-2h。
所述的步骤3中，正丁醇的体积用量为浸膏状乙醇提取物体积的5-6倍。
所述的步骤3中，所述的正丁醇萃取的工艺参数为：分配系数k＝0.8。
将苏式烯-二炔-烯型聚炔经高效液相色谱法拆分后，得到3对苏式烯-二炔-烯型聚炔。
3对烯-二炔-烯型聚炔中，每对中的手性异构体的拆分方法为：以大赛璐IC、IG、IA手性柱中的一种作为色谱柱，流动相为4:1-6:1的正己烷-异丙醇混合溶剂，流速为0.6mL/min，紫外检测器检测波长为210nm，得到烯-二炔-烯型聚炔对映异构体。
一种抗神经炎药物组合物，包括苏式烯-二炔-烯型聚炔和药学上可接受的载体。
一种抗神经炎药物组合物，包括烯-二炔-烯型聚炔对映异构体和药学上可接受的载体。
一种抗神经炎药物组合物，包括苏式烯-二炔-烯型聚炔形成的药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。
一种抗神经炎药物组合物，包括烯-二炔-烯型聚炔对映异构体形成的药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。
一种苏式烯-二炔-烯型聚炔的应用，为制备抗神经炎药物中的应用。
一种烯-二炔-烯型聚炔对映异构体的应用，为制备抗神经炎药物中的应用。
一种抗神经炎药物组合物的应用，为制备抗神经炎药物中的应用。
本发明的苏式烯-二炔-烯型聚炔及其制备方法和应用，其有益效果在于:
从干燥的伞形科柴胡属多年生草本植物南柴胡(Bupleurum scorzonerifoliumWilld)根中提取分离的3对烯-二炔-烯型聚炔对映异构体。通过将南柴胡根粗提物通过反复的硅胶柱色谱，HP-20大孔树脂，ODS柱色谱，HPLC分离的色谱方法进行分离，并利用手性色谱柱进行手性拆分最终得到所述化合物，该化合物结构新颖，均为立体构型确定的光学纯化合物。利用LPS诱导的小胶质细胞BV-2炎症模型3对新的烯-二炔-烯型聚炔对映异构体的抗神经炎活性进行测试，体外细胞试验结果表明本发明的化合物1a/1b-3a/3b对小鼠小胶质细胞BV-2系表现出了较好的抗神经炎作用，其丰富了南柴胡根的抗神经炎医药用途。本发明制备方法简单，重现性好，纯度高，成本低，能耗低和生产过程污染低，获得的化合物具有良好的抗神经炎活性。
附图说明
图1：化合物1的UV谱
图2：化合物1的IR谱
图3：化合物1的HRESIMS谱
图4：化合物1a/1b的CD和ICD谱图5：化合物1的1H-NMR谱
图6：化合物1的13C-NMR谱
图7：化合物1的HSQC谱
图8：化合物1的HMBC谱
图9：化合物1的1H-1H COSY谱
图10：化合物1的DEPT谱
图11：化合物2的UV谱
图12：化合物2的IR谱
图13：化合物2的HRESIMS谱
图14：化合物2a/2b的CD和ICD谱图15：化合物2的1H-NMR谱
图16：化合物2的13C-NMR谱
图17：化合物2的HSQC谱
图18：化合物2的HMBC谱
图19：化合物2的1H-1H COSY谱图20：化合物2的DEPT谱
图21：化合物3的UV谱
图22：化合物3的IR谱
图23：化合物3的HRESIMS谱
图24：化合物3a/3b的CD和ICD谱图25：化合物3的1H-NMR谱
图26：化合物3的13C-NMR谱
图27：化合物3的HSQC谱
图28：化合物3的HMBC谱
图29：化合物3的1H-1H COSY谱图30：化合物3的DEPT谱
图31：化合物1a/1b-3a/3b对LPS诱导的抗神经炎活性，与空白组比较，###为P<0.001；与模型组相比，***为P<0.001。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来列举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
实施例1：化合物1a/1b-3a/3b的制备：
步骤1：提取
取干燥的南柴胡根药材60kg，用2-3倍体积量的乙醇水溶液浸泡过夜，再用5-8倍体积量的乙醇水溶液提取2-3次，乙醇水溶液中，乙醇的体积浓度为70-80％，提取采用80℃加热回流提取。
步骤2：浓缩
合并所有提取液，在压力为0.08Mpa，温度为70℃，进行减压浓缩1h，回收溶剂，减压浓缩完成后，80℃干燥2h，得到浸膏状乙醇提取物，浸膏状乙醇提取物中的固相率为60％。
步骤3：萃取
向浸膏状乙醇提取物中加入正丁醇萃取，得到的正丁醇萃取液；其中，正丁醇的体积用量为浸膏状乙醇提取物体积的5倍，分配系数k＝0.8；
步骤4：色谱分离纯化
正丁醇萃取液经经硅胶减压柱色谱分离，用体积比为100:0-1:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，将洗脱液均分为五个馏分，得到的五个馏分为Fr.1-Fr.5；Fr.1经HP-20大孔树脂柱色谱进行分离，用乙醇的体积浓度为0～90％的乙醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱，洗脱液分为三个馏分，分别为Fr.A-Fr.C；Fr.A和Fr.B经ODS柱色谱进行分离，用体积比为10:90-95:5的乙醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱，交叉合并得Fr.A1-Fr.A5。Fr.A3(对应体积比为60:40-80:20的乙醇-水的混合溶剂洗脱部分)再经硅胶柱色谱进行分离，用体积比为100:1-1:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱得8个组分Fr.A3.1-Fr.A3.8；利用制备HPLC对组分Fr.A3.5以甲醇-水系统65:35进行分离，得到了Fr.A3.5.1-Fr.A3.5.8。利用p-HPLC对Fr.A3.5.2以乙腈-水系统55:45进行洗脱，得到了化合物1和化合物2，并利用相同方法，对Fr.A3.5.4进行分离得到了化合物3。利用Daicel Chiralpak IC手性色谱柱对化合物1-3进行手性拆分(正己烷/异丙醇，5:1，流速0.6ml/min，紫外检测器检测波长为210nm)得到化合物1a/1b-3a/3b。
所得化合物经过系统结构鉴定结果如下：
利用UV,IR,ESIMS,1D,2DNMR技术对化合物1-3的平面结构进行鉴定。利用Snatzke法对拆分后的光学纯化合物1a/1b-3a/3b的绝对构型进行确定。
化合物1:无色固体粉末(甲醇)，10％硫酸-香草醛溶液显色呈深紫褐色。[α]2D0-1(c0.2MeOH)。UV(图1)(MeOH)λmax(logε)262(0.98),277(1.60),294(2.50),313(2.00)提示该化合物可能为一烯-二炔-烯(ene-diyne-ene)型聚炔类化合物；IR(图2)(KBr,cm-1)谱中显示化合物具有羟基(3360cm-1),炔键(2207cm-1),碳碳双键(1625cm-1)等官能团。HRESIMS谱(图3)给出准分子离子峰[M+Na]+299.1615(calcdforC17H24O3Na,299.1618),结合1H-NMR(图5)以及13C-NMR谱(图6)确定化合物分子式为C17H24O3，不饱和度为6。
1H-NMR(600MHz,CDCl3)谱(图5)中，在低场区，δH6.41(1H,dt,J＝15.8,4.8Hz,H-2),δH5.86(1H,d,J＝15.8Hz,H-3)提示为一组反式取代(J2,3＝15.8Hz)的烯键信号，且与一个亚甲基相连。δH6.29(1H,dd,J＝16.0,5.8Hz,H-9),δH5.91(1H,d,J＝16.0Hz,H-8)提示为一组反式取代(J8,9＝16.0Hz)的烯键信号，δH4.02(1H,dd,J＝6.2,5.8Hz,H-10)和δH3.48(1H,m,H-11)为两个连氧碳上的氢信号，δH4.26(2H,dd,J＝4.8,2.0Hz,H2-1)提示为一个亚甲基，且与氧原子相连。在高场区，δH 1.47(3H,m,H2-12,Ha-13),1.30(7H,m,Hb-13,H2-14-H2-16)提示为5个亚甲基氢。δH0.89(3H,t,J＝7.0Hz,H3-17)提示为甲基氢。
图6的13C-NMR(150MHz,CDCl3)和DEPT谱(图10)中，δC 145.6(C-9),145.6(C-2),109.0(C-3),111.1(C-8)为两个双键碳信号。δC75.2(C-10),δC74.5(C-11)提示为两个连氧次甲基碳信号，δC62.9(C-1)连氧亚甲基信号，δC79.4(C-7),74.5(C-5),80.0(C-4),75.2(C-6)提示为两个炔键信号。δC31.9(C-15),25.7(C-13),29.4(C-14),33.2(C-12),22.7(C-16)为5个脂肪亚甲基碳信号，δC 14.2(C-17)为末端甲基碳信号，提示结构中可能含有中长的脂肪链。结构中的两个双键和两个炔键占据了该化合物的全部不饱和度(6)，因此化合物1为链状结构。随后通过HSQC谱(图7)对化合物的氢碳信号进行了全归属。
根据HMBC，1H-1HCOSY作进一步解析。HMBC谱(图8)中，可以观察到H-2与C-4,C-5存在相关，H-8,H-9与C-6存在相关，确定该化合物为含有ene-diyne-ene基团的C17多炔烯类化合物。HMBC谱中，连氧亚甲基H2-1和C-3存在相关信号；1H-1HCOSY谱(图9)中H2-1/H-2,H-2/H-3相关信号可以确定连氧亚甲基位于C-1并与2位反式烯键相连。HMBC谱中，H-11与C-9存在相关，H-9与C-10存在相关，1H-1HCOSY谱中H-9/H-10,H-10/H-11存在相关，可以确定两个连氧碳处于邻位且与8,9位反式双键相连。结合分子量和IR可以确定C-10,C-11位应为羟基取代。
化合物1的相对构型通过H-10,H-11的偶合常数(J＝6.2Hz)确定为苏式(threo)。化合物1的比旋光度接近于0且没有明显的CD吸收，故推测其可能以外消旋体的形式存在。使用手性拆分色谱柱对化合物1进行拆分，成功得到一对比例近乎1:1的对映异构体 和/>它们的绝对构型通过Snatzke’smethod来确定的。1a与Mo2(OAc)4产生的配合物在310-310nm处诱导产生负Cotton效应(见图4)，根据Snatzke等人提出的经验规则，确定1a的绝对构型为10R,11R；同样地，1b与Mo2(OAc)4产生的配合物在相同波长处诱导产生正Cotton效应(见图4)，故确定1b的绝对构型为10S,11S。综上所述，确定了化合物1a和1b的结构并对其全部碳氢信号进行了归属，经系统文献检索，发现两者均是未见文献报道的新化合物，分别命名为(2E,8E)-10R,11R-heptadecadiene-4,6-diyn-1,10,11-triol和(2E,8E)-10S,11S-heptadecadiene-4,6-diyn-1,10,11-triol。1a/1b的核磁数据如下表所示：
表11a/1b在CDCl3中1H(600MHz)与13C(150MHz)NMR数据
化合物2：无色固体粉末(甲醇)，10％硫酸-香草醛溶液显色呈深紫褐色。1(c0.2MeOH)。UV(图11)(MeOH)λmax(logε)262(0.25),277(0.50),294(0.70),313(0.60)提示该化合物可能为一烯-二炔-烯(ene-diyne-ene)型聚炔类化合物；IR(图12)(KBr,cm-1)谱中显示化合物具有羟基(3361cm-1),炔键(2208cm-1),双键(1626cm-1)等官能团。HRESIMS(图13)给出准分子离子峰[M+Na]+299.1629(calcd for C17H24O3Na,299.1618),结合1H-NMR以及13C-NMR谱确定化合物分子式为C17H24O3，不饱和度为6。
1H-NMR(600MHz,CDCl3)谱(图15)中，在低场区，δH6.22(1H,dt,J＝11.0,6.4Hz,H-2),δH5.65(1H,d,J＝11.0Hz,H-3)提示为一组顺式取代(J2,3＝11.0Hz)的烯键信号，且与一个亚甲基相连。δH6.29(1H,dd,J＝15.9,5.9Hz,H-9),δH5.90(1H,d,J＝15.9Hz,H-8)提示为一组反式取代(J8,9＝15.9Hz)的烯键信号，δH 3.99(1H,dd,J＝6.3,5.9Hz,H-10)和δH 3.45(1H,m,H-11)为两个连氧碳上的氢信号，δH 4.39(2H,dd,J＝6.4,1.5Hz,H2-1)提示为一个亚甲基，且与氧原子相连。在高场区，δH 1.45(2H,m,H-12),1.29(8H,m)提示为5个亚甲基氢。δH0.88(3H,t,J＝6.9Hz,H3-17)提示为甲基氢。
在图16的13C-NMR(150MHz,CDCl3)谱和DEPT谱(图20)中，δC 146.2(C-9),145.6(C-2),109.5(C-3),108.8(C-8)为两个双键上的碳信号。δC75.2(C-10),δC74.5(C-11)提示为两个连氧碳信号，δC 61.1(C-1)连氧亚甲基信号，δC 81.0(C-7),79.5(C-5),77.5(C-4),74.8(C-6)提示为两个炔键信号。δC 31.9(C-15),25.7(C-13),29.4(C-14),33.1(C-12),22.7(C-16)为5个亚甲基碳信号，δC14.2(C-17)提示为甲基碳信号，提示结构中含有中长的脂肪链。结构中的两个双键和两个炔键占据了该化合物的全部不饱和度(6)，因此化合物2为链状结构。随后通过HSQC谱(图17)对化合物的氢碳信号进行了全归属。
根据HMBC，1H-1H COSY作进一步解析。HMBC谱(图18)中，可以观察到H-2与C-4,C-5存在相关，H-8,H-9与C-6存在相关，确定该化合物为含有ene-diyne-ene基团的C17多炔烯类化合物。HMBC谱中，连氧亚甲基H2-1和C-3存在相关信号；1H-1H COSY谱(图19)中H2-1/H-2,H-2/H-3相关信号可以确定连氧亚甲基位于C-1并与2位顺式烯键相连。HMBC谱中，H-11与C-9存在相关，H-9与C-10存在相关，1H-1H COSY谱中H-9/H-10,H-10/H-11存在相关，可以确定两个连氧碳处于邻位且与8,9位反式双键相连。结合分子量和IR可以确定C-10,C-11应为羟基取代。
C-10,C-11位邻二醇相对构型通过H-10,H-11的偶合常数(J＝6.3Hz)确定为苏式(thero)。
化合物2的比旋光度≈0且没有明显的CD吸收，故推测其可能以外消旋体的形式存在。使用手性拆分色谱柱对化合物2进行拆分，成功得到一对比例近乎1:1的对映异构体 和/>它们的绝对构型通过Snatzke’s method来确定的。2a与Mo2(OAc)4产生的配合物在310-310nm处诱导产生正Cotton效应(见图14)，根据Snatzke等人提出的经验规则，确定2a的绝对构型为10S,11S；同样地，2b与Mo2(OAc)4产生的配合物在相同波长处诱导产生负Cotton效应(见图14)，故确定2b的绝对构型为10R,11R。综上所述，确定了化合物2a和2b的结构并对其全部碳氢信号进行了归属，经系统文献检索，发现两者均是未见文献报道的新化合物，分别命名为(2Z,8E)-10S,11S-heptadecadiene-4,6-diyn-1,10,11-triol和(2Z,8E)-10R,11R-heptadecadiene-4,6-diyn-1,10,11-triol。2a/2b的核磁数据如下表所示：
表2 2a/2b在CDCl3中1H(600MHz)与13C(150MHz)NMR数据
化合物3：无色固体粉末(甲醇)，10％硫酸-香草醛溶液显色呈深紫褐色。 UV(图21)(MeOH)λmax(logε)262(0.40),277(0.55),294(0.75),313(0.65)提示该化合物可能为一烯-二炔-烯(ene-diyne-ene)型聚炔类化合物；IR(图22)(KBr,cm-1)谱中显示化合物具有羟基(3368cm-1),炔键(2201cm-1),双键(1622cm-1)等官能团。HRESIMS(图23)给出准分子离子峰[M+Na]+299.1625(calcd for C17H24O3Na,299.1618),结合1H-NMR以及13C-NMR谱确定化合物分子式为C17H24O3，不饱和度为6。
1H-NMR(600MHz,CDCl3)谱(图25)中，δH6.27(1H,dt,J＝11.0,6.4Hz,H-2),δH5.68(1H,dd,J＝11.0,1.4Hz,H-3)提示为一组顺式取代(J2,3＝11.0Hz)的烯键信号，且与一个亚甲基相连。δH6.10(1H,dd,J＝11.0,8.8Hz,H-9),δH5.75(1H,d,J＝11.0Hz,H-8)提示为一组顺式取代(J8,9＝11.0Hz)的烯键信号，δH 4.45(1H,dd,J＝8.8,6.4Hz,H-10)和δH 3.53(1H,m,H-11)为两个连氧碳上的氢信号，δH 4.43(2H,dd,J＝6.4,1.5Hz,H2-1)提示为一个与氧原子相连的亚甲基。δH 1.49(3H,m,H2-12,Ha-13),1.30(7H,m,Hb-13,H2-14-H2-16)提示为5个亚甲基氢。δH0.88(3H,t,J＝6.9Hz,H3-17)提示为甲基氢。
在图26的13C-NMR(150MHz,CDCl3)谱和DEPT谱(图30)中，δC 144.8(C-9),145.9(C-2),109.4(C-3),111.3(C-8)为两个双键上的碳信号。δC73.4(C-10),δC74.5(C-11)提示为两个连氧碳信号，δC 61.3(C-1)连氧亚甲基信号，δC 78.8(C-7),79.1(C-5),78.7(C-4),79.2(C-6)提示为两个炔键信号。δC 31.9(C-15),25.7(C-13),29.4(C-14),32.9(C-12),22.8(C-16)为5个亚甲基碳信号，δC14.2(C-17)提示为甲基碳信号，提示结构中含有中长的脂肪链。结构中的两个双键和两个炔键占据了该化合物的全部不饱和度(6)，因此化合物3为链状结构。结构中的两个双键和两个炔键占据了该化合物的全部不饱和度(6)，因此化合物3为链状结构。随后通过HSQC谱(图27)对化合物的氢碳信号进行了全归属。
根据HMBC，1H-1H COSY作进一步解析。HMBC谱(图28)中，可以观察到H-2与C-4；H-3与C-5存在相关，H-8,与C-6；H-9C-7与存在相关，确定该化合物为含有ene-diyne-ene基团的C17多炔烯类化合物。HMBC谱中，连氧亚甲基H2-1和C-3存在相关信号，1H-1H COSY谱(图29)中H2-1/H-2,H-2/H-3相关信号可以确定连氧亚甲基位于C-1并与2位顺式烯键相连。HMBC谱中，H-9与C-11存在相关，H-10与C-8存在相关，1H-1H COSY谱中H-9/H-10,H-10/H-11存在相关，可以确定两个连氧碳处于邻位且与8,9位顺式双键相连。结合分子量和IR可以确定C-10,C-11应为羟基取代。
C-10,C-11位邻二醇相对构型通过H-10,H-11的偶合常数(J＝6.4Hz)确定为苏式(thero)。
化合物3的比旋光度≈0且没有明显的CD吸收(见图24)，故推测其可能以外消旋体的形式存在。使用手性拆分色谱柱对化合物3进行拆分，成功得到一对比例近乎1:1的对映异构体和/>它们的绝对构型通过Snatzke’s method来确定的。3a与Mo2(OAc)4产生的配合物在310-310nm处诱导产生负Cotton效应(见图24)，根据Snatzke等人提出的经验规则，确定3a的绝对构型为10R,11R；同样地，3b与Mo2(OAc)4产生的配合物在相同波长处诱导产生正Cotton效应(见图24)，故确定3b的绝对构型为10S,11S。综上所述，确定了化合物3a和3b的结构并对其全部碳氢信号进行了归属，经系统文献检索，发现两者均是未见文献报道的新化合物，分别命名为(2Z,8Z)-10R,11R-heptadecadiene-4,6-diyn-1,10,11-triol；(2Z,8Z)-10S,11S-heptadecadiene-4,6-diyn-1,10,11-triol。3a/3b的核磁数据如下表所示：
表3 3a/3b在CDCl3中1H(600MHz)与13C(150MHz)NMR数据
用途例1:化合物1a/1b-3a/3b对脂多糖诱导的抗神经炎活性
2.1实验材料
小胶质细胞系BV-2细胞购自中国医学科学院细胞中心，DMEM培养基购自美国Clark公司。脂多糖(LPS)、二甲基亚砜(DMSO)和地塞米松(Dex)购自Sigma公司。
2.2细胞培养及处理
在温度为37℃、CO2浓度为5％的细胞培养箱中用高糖培养基DMEM(该培养基中含有10％的胎牛血清以及100μg/L的青霉素和100μg/L的链霉素)培养至对数增殖期，备用。化合物1a/1b-3a/3b溶于细胞培养水平的二甲基亚砜(DMSO)中，加入培养液，得到浓度为0.2％(v/v)的DMSO溶液，DMSO溶液对测试的细胞系的生长没有显著影响。对照组用等量DMSO处理。
2.3一氧化氮分析
细胞浓度调节为106/mL,96孔板每孔接种200μL。细胞孵育1h后用1μg/L的LPS处理，加入10μg/L的待测物处理24h。用Griess反应法测定了BV-2细胞培养上清液中NO2-浓度间接反映NO浓度。
2.4数据统计
所有的结果和数据在至少三个独立的实验中得到证实，使用GraphPad Prism 6(加利福尼亚，美国)软件对各组数据进行单因素方差分析，P<0.05被认为具有统计学意义。
2.5实验结果
实验结果如图31所示，化合物1a/1b-3a/3b在10μg/L浓度下NO含量与阳性药地塞米松(Dex)所产生的NO含量相当。因此化合物1a/1b-3a/3b有一定的抗神经炎作用。
Claims (9)
1.一种苏式烯-二炔-烯型聚炔，其特征在于，该苏式烯-二炔-烯型聚炔的分子结构式为：
2.根据权利要求1所述的苏式烯-二炔-烯型聚炔，其特征在于，该苏式烯-二炔-烯型聚炔，根据构型的不同，包括以下6个烯-二炔-烯型聚炔对映异构体，如式1a/1b-3a/3b所示：
3.根据权利要求1-2任一项所述的苏式烯-二炔-烯型聚炔，其特征在于，所述的苏式烯-二炔-烯型聚炔，还包括其形成的药学上可接受的盐；所述的烯-二炔-烯型聚炔对映异构体，还包括烯-二炔-烯型聚炔对映异构体形成的药学上可接受的盐。
4.一种权利要求1所述的苏式烯-二炔-烯型聚炔的制备方法，其特征在于，该苏式烯-二炔-烯型聚炔是从南柴胡的根中提取分离得到的；
包括以下步骤：
步骤1：提取
以干燥粉碎后的南柴胡根作为药材，采用乙醇水溶液进行提取，得到提取液；其中，采用的乙醇水溶液中，乙醇体积浓度为70-80％；
步骤2：浓缩
将提取液进行减压浓缩，干燥后，得到浸膏状乙醇提取物；
步骤3：萃取
采用正丁醇对浸膏状乙醇提取物进行萃取，得到正丁醇萃取液；
步骤4：色谱分离纯化
(1)将正丁醇萃取液经过硅胶减压柱色谱分离，采用按体积比为100:0～1:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，得到一次梯度洗脱液；
(2)取一次梯度洗脱液中，二氯甲烷-甲醇混合溶剂体积比为100:0-100:30范围内的洗脱部分，经HP-20大孔树脂柱色谱进行分离，采用乙醇体积浓度为0～90％的乙醇-水混合溶剂进行梯度洗脱，得到二次梯度洗脱液；
(3)取乙醇-水混合溶剂中乙醇体积浓度为0％-60％的二次梯度洗脱液部分，经ODS柱色谱进行分离，采用体积比为10:90-95:5的乙醇-水的混合溶剂进行三次梯度洗脱；取乙醇-水混合溶剂中体积比为60:40-80:20的三次梯度洗脱液部分，再经硅胶柱色谱进行分离，用体积比为100:1-1:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱；进一步用p-HPLC纯化，得到苏式烯-二炔-烯型聚炔。
5.根据权利要求4所述的苏式烯-二炔-烯型聚炔的制备方法，其特征在于，将苏式烯-二炔-烯型聚炔经高效液相色谱法拆分后，得到3对苏式烯-二炔-烯型聚炔；
3对烯-二炔-烯型聚炔中，每对中的手性异构体的拆分方法为：以大赛璐IC、IG、IA手性柱中的一种作为色谱柱，流动相为4:1-6:1的正己烷-异丙醇混合溶剂，流速为0.6mL/min，紫外检测器检测波长为210nm，得到烯-二炔-烯型聚炔对映异构体。
6.一种抗神经炎药物组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的苏式烯-二炔-烯型聚炔和药学上可接受的载体；或权利要求2所述的烯-二炔-烯型聚炔对映异构体和药学上可接受的载体；或权利要求3所述的苏式烯-二炔-烯型聚炔形成的药学上可接受的盐和药学上可接受的载体；或权利要求3所述的烯-二炔-烯型聚炔对映异构体形成的药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。
7.权利要求1所述的苏式烯-二炔-烯型聚炔的应用，其特征在于，为制备抗神经炎药物中的应用。
8.权利要求2所述的烯-二炔-烯型聚炔对映异构体的应用，其特征在于，为制备抗神经炎药物中的应用。
9.权利要求6所述的抗神经炎药物组合物的应用，其特征在于，为制备抗神经炎药物中的应用。
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| CN1899333A (zh) * | 2005-07-25 | 2007-01-24 | 郭爱华 | 一种柴胡提取物、其制备方法及其应用 |
| CN101838296A (zh) * | 2010-05-12 | 2010-09-22 | 江苏省中国科学院植物研究所 | 一种新聚炔苷的制备方法和用途 |
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